Method Article

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

DOI:

10.3791/56459

⸱

October 19th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה העיקרי המשמש להגדרת הנוכחות של מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הוא מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו ששינית מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות כדי להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות). אלה מלכודות חוץ-תאית מוגדרים על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית עם ביטוי משותף של רכיבים אחרים כמו גרגר פרוטאזות, שינויים היסטוניים citrullinated peptidyl arginase deiminase (מקלדת). הביטוי של המטס בדרך כלל נמדד לאחר חשיפה לגירוי, לעומת דגימות לא מגורה. דוגמאות כלולים גם על רקע ושליטה isotype. התאים הם ניתחו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה מוגדרים היטב. מיקרוסקופיה קונפוקלית עשוי לשמש כדי להגדיר את הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו ברקמת הריאה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), שתוארו לראשונה על-ידי. Brinkmann et al. 1 הם מיוצרים בעיקר בתגובה לזיהום (במיוחד לחיידקים) ויש להם תפקיד חשוב ב מארח ההגנה1,2. הם גם תוארו להתרחש בתגובה מחלות שאינן זיהומיות, כולל דלקת בכלי הדם, זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן); ו mitogen phorbol 12-myrisate 13-אצטט (PMA)2,3. זה לאחרונה הוכר כי סוגי תאים אחרים אולי גם לייצר מלכודות חוץ-תאית, כולל מקרופאגים. מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות) עדיין אינם ישות מוגדרים היטב הספרות4,5. לאחרונה הקמנו שיטות כדי לזהות הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו6,7. במאמר זה, המדידה של המטס שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית יתוארו.

תכונות עיקריות של NETosis אשר להבחינו מסלולים סלולר אחרים (כגון אפופטוזיס8) הם ההבלטה של כרומטין בשיתוף עם: (1) citrullination של שינויים היסטוניים (H3Cit)9, (2) ביטוי משותף של פרוטאזות גרגר10 , (3) מעורבות של peptidyl deiminase ארגינין (PAD) 411,12. מקרופאגים אקספרס גם H3Cit, גרגר פרוטאזות, PAD, ניתן להשתמש בתכונות אלה כדי להגדיר את הנוכחות של המטס.

המטס ייתכן תפקיד חשוב במיוחד בריאה, כפי מקרופאג התא דומיננטי נוכח alveoli ואת דרכי הנשימה של הריאות, יש את התפקיד הראשוני של בימוי התגובה החיסונית הסלולר זיהום/דלקת. בנוסף, בעוד הרבה של הריאות הוא חלל ריק (למשל, בתוך alveoli), הגרורות מסוגלים פוטנציאלי להרחיב השטח הזמין, בניגוד לאיברים מוצקים.

השיטה הנפוצה ביותר מגדירים את הנוכחות של רשתות היא על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יש עדיין אינה דרך ברורה כדי למדוד את המטס. הטכניקה לשקילת רשתות כבר מותאם כדי למדוד את הנוכחות של המטס ב פרוטוקול זה. הדרישות העיקריות של שיטה זו הם גישה מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת הדמיה המתאים לניתוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה בעקבות ניסויים אושרה: (1) בני אדם לפי האתיקה הוועדה של מונש מרכז רפואי וכן בעלי חיים (2) על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מלבורן.

1. מקרופאגים Bronchoalveolar שטיפה (BAL)

  1. BAL שימוש כדי להשיג מקרופאגים ריאות ב: (1) האדם נושאים על ידי ברונכוסקופיה 6 ו- (2) עכברים באמצעות שאיפה אינטרה-הנשימה 13 .
    הערה: רכישת המקרופאגים גורמת בדרך כלל יש הפעלה של תאים אלה. מקרופאגים מתקבלים מן חולים הזקוקים ברונכוסקופיה לחקור בעיה רפואית פוטנציאלית ועוד נושאים לא כל יכול להיות מתאים לניתוח של המטס (יהיה צורך לקבוע עבור כל פרוייקט בודדים).
    1. קח את פתרון BAL ו ספין למטה (500 x g 10 דקות) לטופס גלולה, לשטוף פעמיים עם תרבות בינוני (רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) עם סרום עגל העוברי 5%, 1%-גלוטמין) בטמפרטורת החדר, ואז לדלל תאים 4 מ של תרבות medi המ.
    2. במידת הצורך, בקשה רשמית ספירה מבדלת; רוב התאים (בדרך כלל > 80%) יהיה מקרופאגים 6.
      הערה: זה בדרך כלל יבוצעו על ידי שירות היסטולוגיה קליניים באמצעות המראה מורפולוגיות של סוגי תאים שונים 6.
    3. בצע תא מקרופאג קיימא לסמוך על הפתרון BAL באמצעות הדרה Trypan blue ו- hemocytometer.
      הערה: BAL מתקבל פתרון של בני אדם ועכברים כאמור בשלב 1.1.
    4. הוסף 1-4 x 10 מקרופאגים 5 כדי. ובכן 24 צלחות על coverslips ב 500 µL של תרבות בינוני לכל טוב ולהשאיר לילה ב 37 מעלות צלזיוס; התאים מקנא coverslips. לדוגמאות אנושי, להוסיף אנטיביוטיקה (למשל, פניצילין, סטרפטומיצין, 10 4 U/mL) כדי למנוע זיהום חיידקי.

2. Immunofluorescence Labeling/מיקרוסקופיה של מקרופאגים BAL

הערה: תאים מתקיימים על coverslips כאמור לעיל-

  1. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את התאים פעם עם פוספט buffered סליין (הציבורי). לתקן תאים לשבועיים paraformaldehyde/periodate/ליזין (פיפ) 2% במשך 10 דקות
  2. לשטוף את התאים לזמן קצר ב- PBS ולאחר מכן permeabilize ב- 0.2% 20 Tween ב- PBS במשך 20 דקות
  3. גוש תאים עם 10% עוף sera ב- 5% שור אלבומין (BSA) מדולל ב- PBS במשך 30 דקות
    4. נוגדנים
  4. Incubate עם שליטה ראשי ו isotype לשעה בטמפרטורת החדר בריכוזים בטחונות (פרטים ספציפיים יותר מפורטים בטבלה של חומרים) ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור הדגימות BAL, סמן ספציפי של מקרופאגים נדרש בדרך כלל לא.
  5. לאחר התוספת של נוגדנים העיקרי, לשטוף את התאים ב- PBS, דגירה נוסף עם נוגדנים משניים המתאימים למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לרחוץ בסעיפים PBS ו הר דאפי מבוססי הרכבה בינונית להמחשת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (כאמור לעיל) לייזר excitations 647 561, 488, 405 ננומטר, 40 X, נה 1.0 שמן המטרה.

3. דגימות רקמה בריאה

הערה: ויוו במחקרי של רקמת הריאה, לומדים את הדוגמאות לאחר חשיפת הרלוונטי (למשל, כפי שתואר על ידי O ' סאליבן. et al. 7). החשיפה הרלוונטי ביותר עבור ניסוי זה הם אורגניזמים זיהומיות, בעיקר חיידקים. זנים העכבר יכול לשמש עבור שיטה זו הם עכברים C57BL/6 או BALB/c, בן 10-12 שבועות, משקל 25-30 גרם וזכר.

  1. Euthanize עכברים, באמצעות הזרקה בקרום הבטן של קטאמין (400 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (40 מ"ג/ק"ג). פתח את חלל בית החזה, לחשוף את הריאות והלב באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים.
    1. להשרות PBS חמים באמצעות מחט 21-מד לתוך החדר הימני כדי לשטוף את הדם מכלי הדם ב-30 s, ואז להשרות 10 מ"ל של 2% מקבע פיפ ב-30 (לתוך החדר הימני).
    2. להשתמש חמים PBS (42 ° C) שטיפת בחלל החזה פתוח. לצנרר קנה הנשימה עם מחט 21-מד וחתיכת אבובים 0.8 מ מ חיתוך לפי מידה, להזריק µL 800 של ומחוממת מראש (עד 42 ° C), התכה נמוכה הצבע 3% agarose פתרון.
    3. העניבה off קנה הנשימה במשי קלועה (4.0 USP). מניחים את החוט סביב קנה הנשימה, מתחת נקודת הכניסה של הצינורית, ואבטח אותו באמצעות קשר בוהן פשוט. כדי לחזק את agarose, לנהל PBS קר כקרח סביב הריאות. הסר את הריאות והלב כבלוק בחלל בית-החזה בעזרת מספריים והן עמום. להסיר את כל הריאה בנפרד ולתקן אותם ואז עבור 16 h ב- 2% פיפ או פורמלין ב-4 מעלות צלזיוס
    4. לאחסן את דגימות PBS ב 4 ° C עד רקמות חלוקתה. אלה שיטות לקבלת רקמת הריאה היה שתואר לעיל 13.
  2. להכין את רקמת הריאה דגימות השתמש בשלבים הבאים.
    1. תיקון רקמת הריאה רקמות (resected בשלב 3.1) בפורמלין באגירה טבעי 10% במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. להעביר 75% אתנול ולשים במעבד רקמות על מחזור של 12 שעות, (2.5 h ב- 75% EtOH, 3 h ב- EtOH מוחלטת, 3.5 h ב- 3B הממס, ובמשך 3 h בפרפין).
    2. הטבע בפרפין סטנדרטי כדי ליצור בלוקים (FFPE) פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע, אשר מאוחסנים בטמפרטורת החדר.
      הערה: בשלב זה, זה בדרך כלל נוח לחתוך הסעיפים ריאות עבור שקופיות רגילה.
    3. לחתוך הסעיפים הריאה FFPE-4-5 מיקרומטר עובי באמצעות מיקרוטום והר טעונה, מצופה שקופיות כאמור מתוארת על ידי O ' סאליבן. et al. 7
    4. הר שקופיות, לשים 3 טיפות של הרכבה בינונית על coverslips 60 מ"מ x 24 מ"מ (גודל 1.5), היפוך השקופית על coverslip ולדחוף את עודף בינוני. הרמטית לאטום עם לק ולאחסן בטמפרטורת החדר.

4. הכנה/מיקרוסקופיה של דגימות רקמה בריאה

  1. דה-שעווה, נוזלים, pretreat המדגם רקמת הריאה FFPE עם אנטיגן אחזור פתרון.
    1. התנור יבש FFPE שקופיות עבור 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. אז לשים את השקופיות בפתרון קסילן במשך 30 דקות והעברת לפתרון אתנול 70% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף במי ברז.
    2. המקום חום הוכחה ניילון נצמד ובכפוף חיר-אנטיגן אחזור בסיר לחץ במשך 10 דקות 10 מ'/מול/ליטר טריס, pH 1 mmol/EDTA 9.0. מגניב עבור 20 דק לשטוף פעמיים במי ברז למשך 5 דקות על כיסא נדנדה, אז פעם אחת עם PBS על הנדנדה.
    3. בלוק עם הנסיוב עוף 10% 5% BSA/PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. מכתים את הרקמה.
    1. להגדיר המטס מקרופאגים, להוסיף ראשי נוגדנים (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) 1% BSA/PBS עבור h 16 ב 4 ° C-דילול 1/100 (פרטים ספציפיים לגבי כמויות נוגדן מוצגים בטבלה של חומרים). תשטוף פעמיים עם PBS למשך 5 דקות על כיסא נדנדה.
      2. נוגדנים
    2. להשיג זיהוי פלורסנט על ידי דגירה עם משני המתאים 1% BSA/PBS למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. נוגדנים הם: (1) עוף אנטי עכבר 488 (ירוק), (2) עוף אנטי-עז 594 (אדום), ועכבר (3) חמור נגד 647 (אדום רחוק).
    3. לרחוץ בסעיפים PBS ו הר המכילות דאפי הרכבה בינונית עבור צביעת כרומטין.
  3. להשיג פלורסנט תמונות באמצעות לייזר קונפוקלי סריקת הראש מחובר במיקרוסקופ הפוכה.
    1. להלהיב ההכנה עם 405, 488, 561 647 ננומטר לייזר. ללכוד תמונות פיקסל 512 x 512 מטוס יחיד על ידי לחיצה על הקו-רציפים, בהחלקה לחצן (בממוצע קו 2) באמצעות 20 X 0.1 והאוויר נה נה 40 X 1.0 שמן מטרות.
    2. לקבל לפחות 10 שדות ראייה לכל מקטע עבור ניתוח נתונים עבור כל תוצאה (קרי, 10 ובעוצמת שדות ראייה (HFOV) עבור הפקד, 10 עבור מדגם מגורה, וכדומה, עבור כל עכבר).
      הערה: כדי לקבל במדגם מייצג של כל השדה, מטריצה המערכת יכולים לשמש אשר מחולק השדה לתוך מקטעים שונים עבור כל דגימה שונה המטריקס באותו משמש כדי לבחור שדות ראייה (למשל, השדה יכול להיות מחולק למקטעים 9 ומועברים למרכז, 4 הפינות, שני HFOV).

5. תלת-ממדיים (3-D) הדמיה של המטס

הערה: כפי. המטס מבנים תלת-ממדיים, על ידי לקיחת z מרובים-מחסנית תמונות, אשר הם מחדש, רשאי למסור מידע בעל ערך.

  1. סעיף דגימות ריאות מבלוקים פרפין, על שימוש vibratome בבית משרעת שוכן בגובה 1.8 מ"מ ומהירות של 0.1-0.5 מיקרומטר 200 מ"מ/ס
  2. לחסום את רקמת הריאה עם 20% של הסרום המתאים (10% עגל עוברית סרום ו- 10% עוף סרום) ולאחר מכן permeabilize PBS שיושלם ו- 3.75% טריטון-X 100 עבור 7 שעות בטמפרטורת החדר תחת עצבנות עדין.
  3. כתם הסעיפים עבור h 16 ב 4 ° C עם נוגדנים העיקרי הרלוונטי (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) 200 כרכים µL צינורות microcentrifuge (נוגדן ריכוזים מוצגים בטבלה של חומרים).
  4. לשטוף את הסעיפים ב- PBS, 3 פעמים במשך 10 דקות לפני המקננת עם נוגדנים משניים הרלוונטיים בטמפרטורת החדר במשך ה 1
  5. כתם הסעיפים ריאות עבור דאפי (1:5, 000) בתמיסה למשך 20 דקות, לפני הוספת את שער גולשת המיקרוסקופ שקופיות ב- PBS.
  6. להשיג תמונות פלורסצנטיות באמצעות הפוכה קונאפוקלית במיקרוסקופ (40 x 1.3 NA) מצוידים עם 405 ננומטר, 440 ננומטר, 473 nm, 543 ננומטר, 635 ננומטר לייזר.
  7. להקליט z-במחסן תלת-ממדי של 0.54 עובי מיקרומטר עם אופטימלית חלוקתה z עבור המטרה שמן 40 x 1.3 נה.
    הערה: התוכנה ששימשה משתנה בהתאם המיקרוסקופ בודדים. דוגמה של איך התוכנה יכול לשמש עבור מיקרוסקופ אחד מסופק 1 הקבצים המשלימים.

6. ניתוח תמונה

הערה: הניתוח של דגימות מחייב שימוש תוכנה ספציפית ניתוח ההדמיה, דוגמאות מפורטים בטבלה של חומרים. בזמן הניתוח של התוצאות תלויות התוכנית ספציפיים השתמשו, הנקודות המפורטות להלן חשובים.

  1. ניתוח של בל דגימות
    1. הגדר המספר של מקרופאגים על-ידי בחירת ערוץ הצבע הכחול על דאפי הקצאת בגודל מינימלי עבור התאים (למשל, > 18 מיקרומטר בקוטר). באמצעות התוכנות הרלוונטיות, למדוד את המספר הכולל של מקרופאגים לכל שדה.
    2. לספור את מספר תאי יש את התכונות של המטרופוליטן על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית שזיהה דאפי עם ביטוי משותף של סמנים אחרים (למשל, MMP12, PAD2 ו- H3Cit).
      הערה: מספר סמנים ניתן לנתח תלויה במספר של לייזרים זמינים, אך באופן אידיאלי בנוסף דאפי, לפחות שני סמנים אחרים צריך להיות כלול. השני פחות פרמטרים ספציפיים עבור ביטוי MET (למשל, מספר תאים עם כרומטין חוץ-תאית, של גרעין מוגדלת) יכול לשמש.
    3. כדי להשוות את הביטוי MET ב BAL לנתח דגימות (בין הבקרה, עשן, עשן/DNase התייחסו לקבוצות), מינימום של 100 מקרופאגים BAL לדגימה.
    4. למדוד נוגדנים משניים, isotype לשלוט רמות קרינה פלואורסצנטית; למדוד מינימום של 100 תאים בכל מדגם עבור קרינה פלואורסצנטית שלהם. למדוד את הרמה הממוצעת של רקע זריחה עבור כל סמן (למשל, H3Cit) באמצעות תוכנה סטנדרטית.
    5. להגדיר ביטוי MET, לספור את התאים עם פנוטיפ אופייני (למשל, חוץ-תאית כרומטין עם שותף ביטוי H3Cit MMP9), עבור כל MET, למדוד את רמת קרינה פלואורסצנטית סמנים (למשל, H3Cit, MMP9). לא לכלול תאים בהפקת המטס אם צביעת שלהם לא היה מעל רקע ושליטה isotype.
    6. לדוגמאות BAL אנושי, לנתח מינימום של 100 תאים עבור כל דגימה עבור האחוז של מקרופאגים שהופכים הגרורות. לקבלת דוגמאות מאתר, התאים הם קטנים יותר, המטס קשה להגדיר, לנתח מספר גדול יותר של תאים עבור כל דגימה (למשל, מקרופאגים 200).
  2. ניתוח של דגימות רקמה בריאה
    1. כדי לקבוע הנוכחות של המטס ברקמת הריאה, השתמש הסמן מקרופאג ספציפיים כגון F4/80-
    2. להגדיר את הנוכחות של המטס ברקמת הריאה באמצעות שיתוף הלוקליזציה של F4/80 בתאים המבטאים כרומטין חוץ-תאית עם פרמטרים אחרים, כמפורט בסעיף 6.1.
    3. לקבוע את רמות קרינה פלואורסצנטית רקע בדגימות עם נוגדנים משניים, הפקדים isotype. אל תכלול המטס ניתוח שאינם מעל הרקע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטס, ניתן לאבחן מדגימות BAL, רקמת הריאה, בסעיפים ריאות עבה יותר עם תמונות תלת-ממדיות. דוגמה של המטס דמיינו במדגם BAL מוצג באיור1. המורפולוגיה של הגרורות ישתנה בהתאם שלהם שלב של התבגרות. התכונה הראשונה לזיהוי על מיקרוסקופ הוא התנועה של הגרעין לקצה של התא. זה מלווה כרומטין חוץ-תאית עם המגשרים ביטוי שיתוף אחרים, כגון H3Cit, גרגר פרוטאזות. בשלבים מוקדמים יותר, התא עדיין יש בערך עגול עם המלכודת חוץ-תאי ביטא. בשלבים מאוחרים יותר, היווצרות MET מאופיין על ידי התארכות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת בסקירה זו מבוססת בשימוש עבור הגדרת הנוכחות של רשתות14. מקרופאגים עד כה סוג התא דומיננטי בדגימות BAL, שיטה זו של אוסף זה מתאים במיוחד ללמוד הגרורות. אם תאי דם אדומים נוכח הכדור, תאים אלה צריך להיות lysed על-ידי שימוש אמוניום כלוריד. ההליך BAL יהיה בדרך כלל להפעיל את המקרופאגים, לכן הוא צפוי כי יהיו המטס נוכח דגימות לא מגורה. המקרופאגים BAL הם בדרך כלל מאוד חסיד. המקרופאגים BAL בדרך כלל לא יזדקקו סמן ספציפיים כמו תאים אלה הם הסוג תא דומיננטי, ניתן להבחין גם על ידי המורפולוגיה שלהם. בדר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין גילויים לעשות ביחס לזה לעבוד.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומן על ידי מענקים אוניברסיטת מונש, הבריאות הלאומיים, המועצה למחקר רפואי, ריאות מונש ואת מכון שינה. המחברים רוצה להודות לצוות אימונולוגיה קלינית בבית הבריאות מונש, ג'ודי קלהאן, אלכס פולקו, השולחן שלי Elgass ו קמדן Lo של מונש מיקרו הדמיה (MMI) לעזרה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה, ולהכיר המחברים את המתקנים MMI אוניברסיטת מונש. המחברים להכיר את מתקני וסיוע המדעית והטכנית של פלטפורמת היסטולוגיה מונש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<דגימות חזקות>אנושיות: נוגדנים ראשוניים
ארנב אנטי-אנושי H3Cit (ציטרולין R26)AbcamAB510310 ug/ml
ארנב אנטי-אנושי MMP12Novus BiologicalNB110-57214ריכוז 1:100 לא ניתן לכימות
עכבר אנטי-אנושי MMP9Novus BiologicalAB1199061:200 מיימת, ללא ריכוז נתון
ארנב אנטי אנושי PADI2/PAD2AbcamAB16478 7 ug/ml
עכבר אנטי אנושי PADI4/PAD4AbcamAB12808610.1 ug/ml
כבשים אנטי-אנושי NELifeSpan BioscienceLS-B424425 ug/ml
שםחברהמספר קטלוגיהערות
><חזק>דגימות עכבר: נוגדנים ראשוניים
עז נגד עכבר MMP9AbcamAF90910 ug/ml
ארנב נגד עכבר H3Cit (ציטרולין R26)AbcamAB510310 ug/ml
חולדה נגד עכבר F4/80בבית (היברידומה)בבית20 ug/ml
כבשים אנטי-אנושי אנטי-HNE /NESapphire BioscienceLS-B424425 ug/ml
עכבר אנטי אנושי וביישן; וביישן; וביישן; וביישן; PADI4 / PAD4AbcamAB12808610.1 ug/ml
סופר-פרוסט פלוס שקופיותMenzelS41104A
Dapi-prolong זהבבדיקות מולקולריותP36931
Triton-X 100Sigma-Aldrich85111
אמוניום כלורידSigma-AldrichE9434
<חזק>שם<חזק> חברהמספר קטלוגיComments
נוגדנים משניים
עוף נגד ארנב AF 488/Life technologiesA-21441
עוף נגד ארנב AF 594Life technologiesA-21442
עוף נגד עזים AF 594Life טכנולוגיותA-21468
תרנגולת נגד עכבר AF488Life technologiesA-21200
חמור נגד כבשים AF 594Life technologiesA-11018
עוף נגד עכבר AF 647Life technologiesA-21463
חמור נגד כבשים AF 594Life technologiesA-11016
בקרת
ארנב IgGבבית
ארנב IgGבבית
עכבר IgG1BD Bioscience550878
ארנב IgGבבית
עכבר IgG2aBioLegend400201
כבשים IgGבבית
שםCompanyCatalog NumberComments
Software Programs
ImarisBitplane
Image JNIH
לעוצמה ממוצעת של פלואורפורים ניתן להשתמש ביישום משרדי סטנדרטי כמו Microsoft Excel
nameCompanyCatalog NumberComments
Microscopes
C1 מיקרוסקופ סריקה קונפוקליNikon
FV1200 מיקרוסקופ סריקה קונפוקליאולימפוס
nameCompanyCatalog NumberComments
Tissue Sources
Human BAL samples מחבילת הברונכוסקופיה במרכז הרפואי
מונאשדגימות BAL של עכבר ורקמת ריאה מהמחלקה לפרמקולוגיה, אוניברסיטת מלבורן.
nameCompanyCatalog Number>Comments
Media
RPMISigma-Aldrichr8758
סרום עגל עובריSigma-AldrichF0926
L-גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'G7513
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>ריאגנטים אחרים
סודאן שחורסיגמא-אולדריץ'199664
פרפורמלדהיד/פריודיאט/ליזין (PLP) מקבעסיגמא-אולדריץ'27387
קסילןסיגמא-אולדריץ'214736
קטמיןסיגמא-אולדריץ'K2753
פורמלין טבעיסיגמא-אולדריץ'42904
פרפיןסיגמא-אולדריץ'327204
אגרוזסיגמא-אולדריץ'A2576
ממס 3BHi-Chem2026
Coverslips 12 מ"לSigma-AldrichS1815
Coverslips 60 x 24 מ"לSigma-AldrichC6875
NameCompanyCatalog>Comments
עכברים
c57 שחור 6פלטפורמת מחקר בעלי חיים מונאש (MARP)
BALB/cMARP
איזוטיפ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
  4. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1(2013).
  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  6. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371(2015).
  7. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  10. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
  11. Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360(2012).
  12. Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
  13. Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
  14. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
  15. Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  16. Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Macrophage Extracellular TrapsConfocal MicroscopyExtracellular ChromatinCitrullinated HistonesGranule ProteasesPeptidyl Arginase DeiminaseBronchoalveolar LavageParaformaldehyde FixativeDAPI StainingImage Analysis Software

Related Articles