הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56689

⸱

26 בדצמבר 2017

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

במאמר זה

סיכום

נוגדן מבוססי תרופות מהפכה לטיפול במחלות דלקתיות. בנוסף יש השפעה ישירה על מטרות מוגדרות, נוגדנים ניתן להפעיל מקרופאגים להיות אנטי דלקתיות. פרוטוקול זה מתאר איך אנטי דלקתיות מקרופאג ההפעלה יכולה להיות המוערך במבחנה, באמצעות העכבר מח עצם, מאקרופאגים ויוו, באמצעות מקרופאגים הצפק.

תקציר

המקרופאגים הם phagocytic תאים חיסוניים מולדת, אשר ליזום תגובות חיסוניות פתוגנים ולתרום פיצוי ריפוי ורקמות. מקרופאגים חשובים באותה מידה ביטול תגובות דלקתיות. הראינו כי מקרופאגים מגורה עם עירוי אימונוגלובולינים (IVIg) ניתן לייצר כמויות גבוהות של ציטוקין דלקתי, אינטרלויקין 10 (IL-10), רמות נמוכות של ציטוקינים פרו-דלקתיים בתגובה lipopolysaccharides חיידקי ( LPS). IVIg היא שנוגדנים ערכיות, בעיקר בנוגדנים Gs (IgGs), איחדו בין הפלזמה של יותר מ-1,000 תורמים דם. הוא משמש כדי להשלים נוגדנים אצל חולים עם ליקויים החיסונית או לדכא את תגובות מערכת החיסון אצל חולים עם תנאים אוטואימוניות או דלקתיות. רמיקייד, נוגדן אלפא (TNFα) גורם טיפולי אנטי הגידול נמק, גם הוכח להפעלת מקרופאגים לייצר IL-10 בתגובה לגירויים דלקתיות. IVIg, תכשירים אחרים נוגדן מבוססי יכול להיבדק כדי לקבוע והשפעותיהם על מקרופאג ההפעלה. מאמר זה מתאר שיטות נגזרת, גירוי של הערכה של מקרופאגים מח עצם מאתר מופעל ע י נוגדנים במבחנה ומקרופגים הצפק מאתר מופעל עם נוגדנים בתוך vivo. לבסוף, נדגים את השימוש סופג המערבי כדי לקבוע את התרומה של תא מסוים מסלולי לפעילות אנטי דלקתיות מקרופאג איתות. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש עם עכברים מהונדסים, כדי לקבוע את ההשפעה של protein(s) ספציפי על הפעלת מקרופאג אנטי דלקתיות. טכניקות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך אם תכשירים ספציפיים רשאית לפעול על-ידי שינוי מקרופאגים למצב IL-10-הפקת הפעלה אנטי דלקתי אשר מפחית את תגובות דלקתיות בתוך vivo. זה יכול לספק מידע על עצמו את התפקיד של הפעלת מקרופאג ביעילותם של תכשירים במהלך המחלה במודלים עכברים, ומספקים תובנה מנגנון חדש פוטנציאלי פעולה אצל אנשים. לעומת זאת, זה ייתכן מתריעים מפני השימוש ביולוגיים מבוססי נוגדן ספציפי לטיפול במחלות זיהומיות, במיוחד אם מקרופאגים לשחק תפקיד חשוב בהגנה מארח נגד הזיהום הזה.

מבוא

המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת, אשר ממלאים תפקידים מרובים בהתגובה החיסונית זיהום או פגיעה. מקרופאגים אחראים ייזום תגובה חיסונית זיהום או רקמת נזק, לעצור את התגובה דלקתית, וקידום של תגובת ריפוי1. דוגמאות של ההפעלה הטובה ביותר למד מקרופאג שלושת המצבים הם: 1) מקרופאגים שטופלו באינטרפרון גמא (IFNγ) ואת ליפופוליסכריד חיידקי (LPS), המיועד מ' (IFNγ + LPS), אשר תורמים התגובה דלקתית; 2) מקרופאגים מגורה עם אינטרלוקין 4 (IL-4), M(IL-4), בהם יש קשר עם תגובת ריפוי; 3) מקרופאגים מגורה עם מכלולי המערכת החיסונית (IC) ו LPS, מ' (IC + LPS), אשר יש את היכולת לבטל את2,של תגובה דלקתית3. M (IC + LPS) נבדל M(IL-4) פצע ריפוי מקרופאגים, שאינם מבטאים את האנזים arginase (Arg-1) או FIZZ14. הסמן הטוב ביותר של מקרופאגים אנטי דלקתיות אלה הוא הייצור שלהם ציטוקין5. מקרופאגים תפקידים מרובים בשמירה על הבריאות, אבל גם לתרום סרטן3ומחלות דלקתיות. מסיבה זו, המקרופאגים הם מטרה טיפולית מפתח לטיפול במגוון רחב של מחלות. חשוב לחקור את ההשפעות של נוגדנים על מצב ההפעלה שלהם לפתח מקרופאג מבוססי טיפולים למחלה.

המוקד של מאמר זה הוא על השימוש של מח העצם מאתר נגזר מקרופאגים (BMDMs) ו מקרופאגים הצפק כדי לבחון את ההשפעה של תרופות נוגדנים על תגובות דלקתיות חוץ גופית בתוך ועל ויוו. לאחרונה, היו מספר מחקרים המראים את ההשפעות של נוגדנים על מקרופאג הפעלה6,7,8. מקרופאגים מופעל במשותף עם מכלולים חיסוניים, אשר הם נוגדנים ומורכבת עם אנטיגן, ו LPS, גירוי דלקתי בדרך כלל, לייצר רמות גבוהות מאוד של ציטוקין דלקתי, IL-10, רמות נמוכות מאוד של ציטוקינים פרו-דלקתיים. אינטרלוקין 12 (IL-12)9. בנוסף, רמיקייד, של נוגדנים חד שבטיים כנגד TNFα, נמצאה לעבודה, בין השאר, על ידי גרימת מקרופאגים אנטי דלקתיות שלו שבר crystallizable (Fc) אזור7. דיווחנו כי IVIg + LPS זירוז הפעלה מקרופאג אנטי דלקתי הדומה ל- M (IC + LPS), שבו שיתוף מגורה מקרופאגים לייצר כמויות גדולות של IL-10, כמויות נמוכות של ציטוקינים פרו-דלקתיים יחידה משנית אינטרלוקין 12 או 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) ו- TNF8. IVIg היא תרופה מורכבת נוגדנים polyclonal, בעיקר IgG, אשר יש כבר איחדו מהדם של תורמים יותר מ-1,00010. היא משמשת לטיפול במגוון רחב של מחלות חיסוניות, כגון אידיופטית היווצרות קרישי דם, פולינוירופתיה של המיאלין כרונית, אך את מנגנון הפעולה אינה לגמרי מובן11. השפעת סמים נוגדן מבוסס על הפעלת מקרופאג יכול להידרש באמצעות השיטות המתוארות במסמך זה.

ניתן לבדוק זאת ההשפעות של תכשירים ספציפיים על הפעלת macrophage BMDMs, המקרופאגים הצפק. באמצעות מקורות אלה מקרופאג מאפשרת הערכה של ראשי תאים. בדיקה ראשונית של נוגדנים על תאים בתרבית הראשי דורש פחות זמן והשקעה כספית מאשר דגמים אחרים במחלה זמן רב ויקר. על ידי הזרקת תרופה לתוך יישום עכבר בריא ויוו, ואת לבודד את התאים וניתוח אותם ex-vivo, ניתן לקבוע אם מחקרים הם מוצדקת כדי להעריך אם טיפול עם תרופות/מוצרים ביולוגיים משפיע על ההפעלה מקרופאג במודלים של המחלה.

מחקרים מעטים בוחן את ההשפעה של טיפולים ביולוגיים על מקרופאג הפעלה חוץ גופית בתוך ו ויוו ישירות, טכניקות שלנו לספק יתרון על טכניקות חלופיות. טכניקות הנוכחי כוללות השפעות תרופות וחיסונים בדיקה על מעורבות לתאים אוכלוסיות במבחנה, כגון השפעת רמיקייד תגובת לימפוציטים מעורבת (MLR) או IVIg על אנושי מקרופאגים בתאים תאי דם היקפיים, איפה האפקט לא ניתן לייחס ל-7,סוג תא מסוים12. באמצעות BMDMs ו מקרופאגים הצפק יש יתרון על פני שימוש שורות תאים, כגון תאים RAW264.7, אשר אינם מייצרים את ציטוקינים פרו-דלקתיים, IL-12, בתגובה LPS8,13. בדיקת השפעת סם נוגדן מבוסס על מקרופאג תגובות שמחוץ יתרונות בגלל תגובות ציטוקין ניתן לייחס ישירות מקרופאגים, יותר מאשר מסיקים מקרופאג תגובות על ידי מדידת רמות ציטוקינים סרום14 . BMDMs ו מקרופאגים הצפק יכולים להיות נגזר, מבודד עכברים מהונדסים כדי לקבוע את התפקיד הספציפי של חלבון מקרופאג אנטי דלקתיות הפעלה. לדוגמה, השתמשנו Il10 לקויה(- / -) BMDMs כדי להדגים כי IVIg-induced הפחתה של ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים תלויה חלקית IL-108. מנגנון הפעולה של התרופה יכול ייחקרו באמצעות סופג המערבי, בו ניתן לקבוע את התפקיד של חלבונים ספציפיים ואירועים איתות. ניתן לבצע תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) BMDMs או מקרופאגים הצפק כדי להציג דפוסים של ביטוי גנים כתוצאה מהפעלה נוגדן. מודלים המחלה בעכברים יכול לספק מידע על יעילות פוטנציאל של נוגדן מבוססי טיפולים ביולוגיים במודלים למחלות מעי דלקתיות, דלקת מפרקים שגרונית מחלות סרטן15,16, 17. אולם, מהטכניקות שתוארו כאן יספק מידע על מנגנון הפעולה של תכשירים אלה על-ידי קביעת אם הם זירוז פעילות מקרופאג אנטי דלקתיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת בריטיש קולומביה.

1. מח עצם מקרופאג נגזרת והפעלה עם נוגדנים

  1. לבצע המתת חסד באמצעות חנק2 CO.
    1. עכבר למקום בלשכת הגיוס. המתת חסד העכבר עם הרדמה איזופלוריין 5%, עבור s 60-90, עד משותק ונושמת עמוק ולאט.
    2. לבטל את איזופלוריין הרדמה ולפקח על 6-8 L/דקה של CO2 עד העכבר הפסיקה לנשום. יוצאים עכבר עם CO2 לפחות עוד 5 דק. ודא כי קיים כבר לא דופק או נשימה. לבצע תאמת צוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
      הערה: 8-12 שבועות עכברים הישן לספק את התשואה הגבוהה ביותר של מקרופאגים.
  2. לרסס העכבר רגליים עם 70% אתנול, להלביש אותם עם הידיים והרגליים הנמתחת במצב פרקדן מעל לוח מוקצף. עם מספריים, מלקחיים להחזיק את העור, עושים חתך רדוד (0.2 ס מ) כדי להסיר את העור והפרווה מפני השטח של כל אחת הרגליים האחוריות.
    הערה: לבצע הליך זה ומניפולציות תרביות רקמה כל כיסוי סטרילי.
  3. חיתוך השריר לחשיפה tibias ועצמות ירך. הסר את tibias ואת עצמות הירך, על ידי חיתוך עצם של השרירים מתחת מפרק הירך מעל הקרסוליים. לקצץ כמה שיותר שרירים ככל האפשר.
  4. לרסס עצמות עם 70% אתנול ולהמתין 1 דקות עד להתאדות, ולאחר מכן למקם אותם בצלחת טוב 6 של עצם בינוני סומק (של Iscove שונה בינוני של Dulbecco (IMDM), 10% סרום שור עוברית (FBS)).
  5. חתוך את קצות העצמות על ידי חיתוך 0.1 ס מ של עצם הקרסול, העליון של עצם הירך, כך חלל העצם נחשפת. ודא מח העצם הוא גלוי מחט בקוטר 26 ניתן למקם בחלל העצם.
  6. חותכים את העצמות, השרירים כדי להפריד את tibias ואת עצמות הירך של המפרקים בברך. הכנס של מחט בקוטר 26 המצורפת מזרק 10 מ"ל לתוך החלל. לרוקן את מח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ ל 5 מ של העצם מיושרות בינוני. ריקון שני tibias ועצמות ירך שני, מעכבר אחד, לתוך כל שפופרת 50 מ.
  7. Pipette למעלה ולמטה כמה פעמים או מערבולת את מח העצם במהירות איטית כדי לפזר בעדינות גושים. מחרוזות של מח צריך להיות שבור לתוך קטן (פחות מ- 0.5 מ"מ) כתמים של מח. למלא צינור חרוטי כדי 50 מ עם עצם מיושרות בינוני. פיפטה התוכן של הצינור חרוט 75 ס מ2 רקמות בתרבות הבקבוק ובא דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לשעה.
    הערה: בוגרת מקרופאגים ותאים mesenchymal יהיה חסיד אל הבקבוק ולא ימחקו, בעוד hematopoietic המוצא לאגס הרצוי להישאר ההשעיה.
  8. Pipette של המדיום עם אבות hematopoietic לתוך צינור חרוטי 50 מ. Centrifuge הצינור ב g 300 x בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של המושבה מקרופאג גירוי בינוני תרבות פקטור (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ננוגרם למ"ל MCSF, פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין ו 150 μM monothioglycerol (mtg ב)).
  9. ספירת תאים באמצעות hemocytometer18. הוסף בינוני resuspend לתאים ריכוז של 0.5 x 106 תאים למ"ל, 1.5 x 107 תאים/הבקבוק ב 30 מ של בינוני, ו פיפטה למעלה ולמטה בעדינות. פיפטה 30 מ של ההשעיה לתוך בקבוקון תרביות רקמה מטופלים חדשים 75 ס מ2 .
  10. ביום 4 וביום 7 אחרי תרבות ראשונית בשלב 1.9, ודא כי התאים הם מחסידי קנים מעט באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ניגודיות שלב הפוכה. למחוק את המדיום המכילות את התאים הלא-חסיד. לשטוף את התאים עם IMDM פעם אחת, להוסיף 30 מ של MCSF תרבות בינוני.
  11. כאשר התאים הם בוגרים ביום 10 (> 95% חיובי F4/80 ו- Mac-1), לוודא שוב התאים הם מחסידי במקצת.
  12. צלחת תאים עבור stimulations, המדיום תרבות להסיר הבקבוקון ולהוסיף 8 מ ל אנזים חינם, מבוסס-EDTA תא דיסוציאציה מאגר (טבלה של חומרים). דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  13. לגרד תאים בעדינות, עם כמות קטנה של לחץ, באמצעות המגרד של התא סטרילי. בדוק במיקרוסקופ זה התאים יש מנותקת השטח את הבקבוק. פיפטה הפומבית תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ. לשטוף את הבקבוק 3 פעמים עם 5 מ של IMDM, בריכה הפתרון שטיפה עם התאים נבצרו. צנטריפוגה תאים ב g x 300 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  14. Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של MCSF מדיום תרבות למחזור חרוט 50 מ. ספירת התאים קיימא באמצעות hemocytometer18. Resuspend תאים על ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל וצלחת μL 100 של התא השעיה (1 x 105 תאים/טוב) לכל טוב של 96-ובכן רקמות תרבות מטופלים, צלחת התחתון שטוח.
    הערה: עצמות של עכבר אחד יפיק מספיק תאים 100-וולס. אם רצונך בכך, באפשרותך מצופה 1 מ"ל של תאים בצלחת 6-טוב (תרביות רקמה, שטוח מטופל למטה). מספר גדול יותר של תאים (1 x 106 תאים) עשויה להיות שימושית עבור ניתוחים תספיג חלבון.
  15. לאחר חסיד, לעורר כפילויות או שהפקידים בארות כל אחד עם 10 ננוגרם למ"ל של LPS ב IMDM, 30 מ"ג/מ"ל של IVIg, או IVIg + LPS. מינונים של LPS או IVIg, יכול להיות טיטרציה כדי למטב את התגובות. השאר כפולים או triplicate בארות כפקדי unstimulated. תקופת דגירה אותם של 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
    הערה: תאים מצופים מחדש צריך לדבוק תרביות רקמה בארות בתוך 1 h.
  16. לאסוף תא supernatants מכל קידוח לתוך צינורות microcentrifuge mL 1.7 בודדים ולהסיר כל חלקיקי מאת ספינינג ב g x 10,000 למשך 5 דקות.
  17. הסר את התא supernatant, להימנע מהפרעה בגדר. למקם את התא מובהר supernatant בשפופרת microcentrifuge סטרילי.
    הערה: תא supernatants שניתן לבדיקה ציטוקינים, IL-10 של ציטוקין יחידה משנית, IL-12 / 23p 40, על ידי מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C לטווח ארוך. בצע אליסה פרוטוקול זמינים מסחרית קיט (טבלה של חומרים). ציטוקינים פרו-דלקתיים אחרים יכולים להיות לבדיקה, כגון IL-6 ו- TNF, כפי שהם מופחתים גם על ידי טיפול משותף עם IVIg + גירוי LPS בהשוואה גירוי עם תקליטונים בלבד. לאחר גירוי, תאים חסיד יכול להיות מוכנים טכניקות כגון סופג המערבי או כמותית פולימראז תגובת שרשרת (Q-PCR) 19,20.

2. מאתגר עכברים In Vivo עם IVIg קצירת מקרופאגים הצפק

  1. שוקלים כל עכבר.
חישוב הנפח של IVIg (ריכוז מניות 100 מ"ג/מ"ל) הדרושים כדי לספק מנה הסופי של 2.5 g/ק ג משקל גוף העכבר כל.
הערה: לדוגמה, עבור עכבר 20 גרם, 500 µL של IVIg נדרש.
  • צייר הכמות הנדרשת של IVIg לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי מצויד 26 סטרילי. קוטר המחט עבור בקרת עכברים אשר לא יקבל IVIg, לנהל אמצעי אחסון המקבילה מנה תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS), pH 7.4 במקום IVIg.
  • עורפה העכבר עם יד אחת על-ידי תופס את עורה באחור של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה ממושכת שלה הזנב והרגליים האחוריות עם האצבעות הנותרות. להטות את הגוף שלו לכיוון האדמה.
  • מקם את המחט בזווית של 30-40 מעלות ביחס הבטן של העכבר, ברביע התחתון הנכון, מסגרת משופעת למעלה והוסף 1.5 ס מ של המחט. להזריק את IVIg או PBS intraperitoneally. . אני לא. 1 h
  • המתת חסד עכברים עם 5% איזופלוריין הרדמה ואחריו 6-8 L/min CO2 חנק (ראה שלבים 1.1.1 - 1.1.2), או בהתאם להנחיות האתית של המוסד.
  • להצמיד את העכבר כדי לוח קצף, גפיים פרושים. לרסס את החלקים עם 70% אתנול.
    הערה: בצע את ההליך בשכונה סטרילי.
  • לעשות חתך שטחי של העור (0.2 ס מ) עם מספריים לאורך הקו האמצעי של העכבר, כדי למנוע חיתוך חלל הצפק. משוך את העור בבטן את הבטן של העכבר באמצעות מלקחיים, כך שגלוי הציפוי הפנימי של הקיר הצפק ללא פגע.
  • ממלאים מזרק 5 מ ל 5 מ של PBS סטרילי (pH 7.4). הכנס של 25 או 27 מד המחט בחלק העליון של חלל שמאל או צד ימין לעבר המרכז של העכבר עם שפוע של המחט למעלה.
    הערה: המקום את המחט בקפידה העכבר כך שאתה לא מזריק PBS לתוך האיברים, אך במקום זאת, לחלל הצפק.
  • לדחוף את הנוזלים לתוך חלל הצפק. להוציא את המחט החלל ועיסוי של הצפק 10 s כדי לסלק תאים. המחט בחלק העליון של החלל ולהימנע איברים. לאסוף ולמקם נוזל שטיפת התאושש לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל על קרח.
    הערה: עבור כל 5 מ של נוזל מוזרק, כ 3.75 מ ל ניתן לשחזר.
  • חזור על הזרקת ושחזור (מדרגות 2.8 2.9) 3 יותר פעמים (נפח הזרקה סך של 20 מ ל), לשחזר 15 מ"ל של נוזל שטיפת בסך הכל. לאסוף שטיפת כל העכבר לתוך צינור חרוטי נפרד 15 מ"ל.
    הערה: לאחר הזריקה האחרונה, זה עשוי להיות קל יותר לחלץ את הנוזלים מן הצדדים רחוק שמאלה וימינה של העכבר, שבו מצטבר נוזל. האיברים תגרום פחות הפרעות עם מחט בעמדה זו.
  • ספין תאים למטה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend תאי μL 500 של ציפוי בינוני (IMDM, 10% FBS ו פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין...) לכל העכבר סמוקות. ספירת מקרופאגים קיימא באמצעות hemocytometer18.
    הערה: המקרופאגים יהיה מעט גדול יותר מאשר שאר התאים הצפק. התשואה טיפוסי הוא 5 x 105 - עונה 1 פרק 106 מקרופאגים/עכבר עכבר C57BL/6 פראי סוג.
    אופציונלי: אם מספר גדול של תאי הדם האדומים נמצאים בבגדר תא, לבצע צעד פירוק כדי להסיר אותם, באמצעות המאגר פירוק של תאי הדם האדומים 1 x על פי הוראות היצרן.
  • Resuspend תאי ציפוי בינוני-עונה 1 פרק 106 מקרופאגים/mL, צלחת μL 100 לכל טוב בצלחת תרביות רקמה מטופלים בתחתית שטוח 96-ובכן.
    הערה: ייתכן צורך בריכה תאים מן העכבר אחד או יותר עבור ניסוי אם משתמש triplicate בארות או ממריצים titrating. לדוגמה, אם עכבר אחד היו 5 x 105 מקרופאגים, μL 500 של ציפוי בינוני יהיה צורך. יהיו מספיק תאים עבור 5 בארות, או 1 בניסוי כפולות, עם מנה אחת של LPS.
  • דגירה תאים עבור h 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לאפשר מקרופאגים להיות חסיד. התאים חסיד הם המקרופאגים הצפק. הסר תא supernatants ותאים שאינם מחסידי. שטיפה הבארות פעמיים עם 200 μL IMDM (מראש התחמם עד 37 ° C), חכה 10 s לאט להטות את הצלחת. החלף את המדיום ציפוי. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות לפני גירוי.
  • לעורר את המקרופאגים עם 10 ננוגרם למ"ל של LPS ב- IMDM, או להשאיר unstimulated, בתור פקד. תקופת דגירה של 24 שעות, לאסוף ולהבהיר supernatants תא (ראה שלבים 1.16-1.17) לניתוח ציטוקין IL-10 על ידי אליסה. בצע אליסה פרוטוקול זמינים מסחרית קיט (טבלה של חומרים).
    הערה: לאחר גירוי, תאים חסיד יכול להיות מוכנים לכל טכניקות כגון תספיג או ה-PCR.

    • 3. מאתגר עכברים in Vivo עם IVIg + LPS קצירת מקרופאגים הצפק

    1. שוקלים כל עכבר. חישוב הנפח של IVIg (ריכוז מניות 100 מ"ג/מ"ל) הדרושים כדי לספק מנה הסופי של 2.5 g/ק ג משקל גוף. לחשב את הסכום של LPS (ריכוז מניות μg/מ ב- IMDM) הדרוש כדי לספק מנה הסופי של 0.2 μg/גרם משקל.
      הערה: לדוגמה, עבור עכבר 20 גרם, 500 µL של פתרון מניות IVIg, μL 40 של פתרון 100 μg/mL של LPS נדרש.
    2. לצייר את הכמות הנדרשת של IVIg ולהערכת LPS לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי מצויד 26 סטרילי המחט. עבור בקרת עכברים אשר לא יקבל IVIg, להחליף אמצעי מקביל של IVIg PBS סטרילי pH 7.4.
    3. עורפה העכבר עם יד אחת על-ידי תופס את עורה באחור של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה ממושכת שלה הזנב והרגליים האחוריות עם האצבעות הנותרות. להטות את הגוף שלו לכיוון האדמה.
    4. מקום המחט בזווית של 30-40 מעלות ביחס הבטן של העכבר, ברביע התחתון הנכון, מסגרת משופעת, ו להוסיף 1.5 ס מ. הכנס IVIg + LPS, או PBS + LPS, intraperitoneally כמו צעד 2.4.
    5. לאחר 1h, לקצור מקרופאגים הצפק על-ידי ביצוע השלבים 2.5-2.10.
    6. ספין תאים למטה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. הסר 1 מ"ל של נוזל שטיפת התאושש להשתמש עבור IL-10 וניתוחים IL-12 / 23p 40 מאת אליסה לפי הוראות היצרן או להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס במשך שניתוח.
      הערה: כדי להבטיח השוואה מדויקת בין הטיפולים לניתוח ציטוקין נוזל שטיפה, לבצע flushs מ של חלל הצפק 4 פעמים עבור אמצעי אחסון הסופי של 15 מ"ל. לא כל נוזל יחולץ מתוך כל סומק.
    7. כמו צעד 2.11, resuspend ולספור מקרופאגים קיימא.
      הערה: המקרופאגים יהיה מעט גדול יותר מאשר שאר התאים הצפק.
    התשואה טיפוסי הוא 5 x 105 - עונה 1 פרק 106 מקרופאגים/עכבר עכבר C57BL/6 פראי סוג.
    אופציונלי: אם מספר גדול של תאי הדם האדומים נמצאים בבגדר תא, לבצע צעד פירוק לפי הנחיות היצרן כדי להסיר אותם, כמו שלב 2.11.
  • כמו צעד 2.12, להשעות מחדש תאי ציפוי בינוני.
    הערה: יתכן לתאים הבריכה הכרחי מכל עכבר אחד או יותר עבור ניסוי. לדוגמה, אם עכבר אחד היו 5 x 105 מקרופאגים, μL 500 של ציפוי בינוני יהיה צורך.
  • כמו 2.13, דגירה תאים עבור h 1-37 ° C 5% CO2 כדי לאפשר מקרופאגים להיות חסיד.
  • לאסוף ולהבהיר בינוני ממוזגים, לפי שלבים 1.14-1.15, מכל התאים הצפק.
    הערה: דגימות עשוי להיות שימוש באופן מיידי או קפוא, מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח ציטוקין מאת אליסה.
  • בצע את שלב 2.11, אך דגירה תאים עבור unstimulated 24 שעות. לאסוף ולהבהיר תא supernatants, לפי שלבים 1.16-1.17, לניתוח ציטוקין מאת אליסה.
    הערה: ניתן להכין תאים עבור טכניקות כגון תספיג או PCR, צעדים 1.16-1.17, 2.14.

    • הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    מאתר עצם מח נגזר מקרופאגים יכול להיות מחונן מ מבשרי תא hematopoietic ב aspirates מח עצם מח עצם aspirates איחדו בין עצמות הירך tibias של עכבר C57BL/6 אחד בדרך כלל תשואה 10 מקרופאגים מח עצם נגזר7 , הפיכתם מקור נוח של מקרופאגים לניסויים. BMDMs יכול לשמש כדי לבדוק תגובות סמים נוגדן מבוסס כאשר לערער עם גירוי דלקתי של במבחנה. איור 1 מציג את המותג IVIg, Gammunex (GX), + LPS מגביר את הייצור של ציטוקין דלקתי, IL-10, 7-fold לעומת LPS גירוי לבד (

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    מקרופאג הפעלה הברית תפקיד חשוב הן רקמה הומאוסטזיס ומחלות22. מקרופאגים יכולים להיות ברורים כמו גם חופפים הברית הפעלה, בהתאם רמזים שלהם microenvironment3. . יש להם תפקידים ברורים בכל שלבי התגובה דלקתיות: ההגנה נגד פתוגנים, פצע ריפוי ורקמות פיצוי, ויש גם מצב הפעלה אנטי דלקתי מובהק כי חשוב לכבות את התגובה דלקתית2 . מקרופאג אנטי דלקתיות ההפעלה דורשת שני גירויים חיצוניים עבור מקרופאגים לייצר כמויות גבוהות של ציטוקין דלקתי, IL-10, כמויות נמוכות של ציטוקינים...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

    תודות

    L.K. היא זוכת פרס studentship בוגר אוניברסיטת בריטיש קולומביה מלגת 4 שנים (4YF). L.M.S. הוא הנמען של אגודה הקנדי של גסטרואנטרולוגיה / קרוהן, קוליטיס קנדה / ניו CIHR שכר חוקר פרס הוא מלומד הביו-רפואית של קרן מייקל סמית למחקר בריאות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרוייקט משירותי הדם הקנדי, בשיתוף עם קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק # CIHR2016-LS).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    איסקוב s שונה Dulbecco' s medium (IMDM)Life technologies12440053
    סרום בקר עוברי (FBS)טכנולוגיות חיים12483-020
    גורם מגרה מושבת מקרופאגים עכבריים רקומביננטיים (MCSF)טכנולוגיות תאי גזע78059
    פניצילין-סטרפטומיציןטכנולוגיות חיים15140148
    מונותיוגליצרול (MTG)סיגמא88640
    1X מאגר ליזה של תאי דם אדומיםeBioscience
    מאגר דיסוציאציה של תאיםטכנולוגיות חיים13150016ללא אנזימים, מבוסס הנקס, EDTA
    ליפופוליסכריד (LPS)סיגמא אולדריץL 4516מ- E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex)Grifolsשהתקבלו מבית החולים לילדים בקולומביה הבריטית, רפואת
    עירויIVIg (נוזל גמגארד)תאגיד הבריאות בקסטרהתקבל מבית החולים לילדים בקולומביה הבריטית, רפואת
    IVIg (אוקטגם)אוקטפארמההתקבלה מבית החולים לילדים בקולומביה הבריטית, רפואת
    מי מלח פוספט בופר (PBS) (סטרילי), pH 7.4טכנולוגיות חיים10010023
    עכבר IL-10 ELISABD biosciences555252
    עכבר IL-12/23p40 ELISABD biosciences555165
    anti-Erk1/2 נוגדןאיתות תאים9101
    נוגדן anti-pp38טכנולוגיית איתות תאים9211
    נוגדן anti-GAPDHפיצג'רלד תעשיות10R-G109A
    26 גרם מחטBD biosciences305110
    מזרק 1 מ"לBD biosciences309659
    מזרק 10 מ"ל BDbiosciences309604
    צינור חרוטי 15 מ"לBD biosciences352096
    50 מ"ל צינור חרוטיBD biosciences352070
    צינור מיקרוצנטריפוגה (1.7 מ"ל)קוטרSPE155-N
    75 ס"מ2 רקמות בקבוק מטופלBD biosciences353136
    מגרד תאיםBD biosciences353085
    ForceptsVWR82027-386קצה עדין, ניתוח 
    מספרייםVWR82027-582עדין, 4 1/2"
    מיקרוסקופ BrightfieldMoticAE31סולם ניגודיות פאזה הפוכה
     מטלר PE 3000
    ' עירויעירוי טכנולוגיית

    מקורות

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    תגיות

    IL 10Western Blotting
    הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק
    צור קשר
    המלצה לספרייה

    פרטיות

    תנאי שימוש

    מדיניות

    2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.