מחקר זה מיושם רצף הגנום כולו עבור ניתוח של מוטציות בגנים היוועצות תרופתיים פטרת, קנדידה glabrata. Glabrata ג מבודד עמידים echinocandins, azoles ו- 5-flucytosine, היו רציף כדי להמחיש את המתודולוגיה. הרגישות פרופילים של מבודד בקורלציה עם נוכחות או היעדרות של המוטציה דפוסי בגנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הגנום כולו רצף של קנדידה glabrata עבור זיהוי של סמנים של פטריות תרופתיים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
קנדידה glabrata יכול לרכוש במהירות מוטציות שגורמות עמידות לתרופות, במיוחד אל azoles ואל echinocandins. זיהוי של מוטציות גנטיות חיוני, כמו ההתנגדות זוהה במבחנה ניתן לעיתים קרובות בקורלציה עם כשלון קליני. בדקנו את הכדאיות של שימוש רצף הגנום כולו (WGS) לניתוח ברמת הגנום של עמידות לתרופות נגד פטריות ב- glabrata ג. המטרה הייתה torecognize נחותות ומחסומים ביישום WGS ומדידת יעילותו. מאמר זה מתאר את בקרת איכות מפתח מחסומים ואת מרכיבים חיוניים של מתודולוגיה WGS לחקור גנטיים המשויכים הרגישות מופחתת סוכני פטריות. זה גם מעריך את הדיוק של ניתוח נתונים, סיבוב סביב הזמן של בדיקות.
הרגישות פנוטיפי של 12 קליני, בקרת האוויר אחד, מזן glabrata ג נקבע באמצעות בדיקות רגישות נגד פטריות. שלושת אלה כלולים לבודד זוגות, של שלושה מטופלים, שהתפתח עלייה בריכוזים מעכבות המינימלי סמים. ב שני זוגות, השני בודד של כל זוג פיתח עמידות echinocandins. בידוד השני בזוג השלישי פיתח עמידות 5-flucytosine. הנותרים מורכבת רגישים ועמיד azole מבודד. פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) גנים הקשורים echinocandin, azole והתנגדות 5-flucytosine היו אישר מבודד עמיד דרך WGS באמצעות רצף הדור הבא. SNPs Non-נרדף בהתנגדות פטריות זוהו גנים כגון FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 , FCY2 . בסך הכל, ממוצע של 98% הקריאות WGS של glabrata ג מבודד למפות את הגנום הפניה עם כיסוי על 75-fold עומק קריאה. משך העבודה והעלות היו דומות סנגר רצף.
לסיכום, WGS של glabrata ג היה ריאלי בגילוי משמעות קלינית מוטציות מעורב ההתנגדות סמים פטריות שונות שיעורים ללא צורך מרובים PCR/DNA רצף תגובות. זה מייצג צעד חיובי לקראת הקמת WGS יכולת במעבדה קלינית לגילוי סימולטני של החלפות ומעניקה עמידות נגד פטריות.
מבוא
קנדידה glabrata הוא הפתוגן יותר ויותר המערכת נתקלה עם חשיבות כמו זן תערוכות ההתנגדות של azoles וכן לאחרונה,2,1,echinocandins3. בניגוד דיפלואידי אלביקנס ג, הגנום הפלואידי של glabrata ג עשוי לאפשר לו לרכוש מוטציות ולפתח עמידות לתרופות מרובות בקלות רבה יותר. ההתנגדות שותף עד שתי הכיתות סמים היה גם דיווח על4. לפיכך, הערכה מוקדמת של פטריות רגישות וזיהוי של עמידות לתרופות ב glabrata ג הוא קריטי עבור גם טיפול נכון, יישוב כמו ההקשר של סדרנות פטריות להגביל את מנהלי ההתקנים של עמידות מיקרוביאלית1 ,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אין אישור מוסרי היה נדרש עבור מחקר זה.
1. תת-תרבות ו inoculum הכנה קנדידה glabrata
- בחר פאנל של מבודד C.glabrata שילמדו אשר גם לכלול לפחות אחד glabrata ג אמריקאי סוג תרבות אוסף (בקרת האוויר) עם דפוס רגישות ידועה.
- תת-תרבות בידוד על-ידי נגיעה שמושבה בודדת באמצעות לולאה פלסטיק חד פעמיות סטריליות והופעת פסים, על גבי דקסטרוז אגר של Sabouraud (SDA) לוח8.
- דגירה לצלחת SDA במשך 24-48 שעות-35 ° C טהור תרבות של בידוד עם גדילה טובה.
2. קביעת הרגישות פטריות
- שימוש לולאה פלסטיק חד פעמי סטרילי לבחור 4-5 מושבות של-1 מ מ קוטר מתוך טרי s....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
13 glabrata ג הכוללת glabrata ג מבודד בקרת האוויר 90030 ו-12 מהמעבדה קליניים הפניה מיקולוגיה (מבודד CMRL1 כדי CMRL12), בית החולים Westmead, סידני נחקרו (טבלה 1). אלה כללו שלושה זוגות מבודד CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 ו- CMRL-5/CMRL-6 שהושגו לפני ואחרי טיפול נגד פטריות עם קישורים אפידמיולוגיים ביניהם 24 (טבלה 1).
סנדלי החבלנים נקבעו באמצעות נקודת עצירה הפרשנית CLSI עבור סוכני פטריות תשע........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה נקבע היתכנות, צירי זמן משוער ודיוק של זיהוי מונחה WGS של עמידות לתרופות ב glabrata ג. זמן טיפול (TAT) כדי להפוך את הספריה הכנת רצף היה ארבעה ימים ודיווח תוצאות שנותחה שתיים ימים. זה משווה עם כמות דומה של פחות TAT על מבחני רגישות בין צלחות לתרבות סנגר רצף עם מספר גבוה משמעותית של דגימות. בסביבות 30-90 glabrata ג הגנום יכול היה לסדרם המבוססת על רצף זרימה-תא קיבולת, עם רצף 80-100% כיסוי. מאז הרצף בוצעה התקנה מעבדה WGS ללא צורך במיקור חוץ, הדרישות עלויות/משאב במחקר זה היה שווה ערך ל העלות הנוכחית של.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים, אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז למחלות זיהומיות, מיקרוביולוגיה, בריאות הציבור. המחברים לא קיבלו כל אחרים מימון למחקר זה. המחברים מודים Drs אלישיה Arnott, נתן בכמן, Ranjeeta מנון על שלהם מומחים יעוץ וסיוע עם הניסוי רצף הגנום כולו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DensiCHECK Plus | BioMé rieux Inc | K083536 | מד צפיפות המשמש לקריאות מקפרלנד |
| Sensitre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | לוחית בדיקת רגישות מסחרית עם תרופות אנטי פטרייתיות סטנדרטיות. |
| לולאות ומחטים חיסון חד פעמיות של Fisherbrand | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | ניתן להשתמש בלולאות פלסטיק חד פעמיות ישירות מהאריזה. אין צורך בלהבה. |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה Eppendorf Safe-Lock | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | נפח 2.0 מ"ל, טבעי |
| ZYMOLYASE 20T מבית Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | משמש לליזה של דופן התא של מבודד פטרייתי לפני מיצוי DNA |
| אשף ערכת טיהור DNA גנומי | פרומגה | A1120 | עושה 100 מיצוי DNA |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקת | Thermo Fisher Scientific | P7589 | ריאגנט פיקוגרין המכונה צבע פלואורסצנטי בפרוטוקול. כולל תקן DNA למבדה ומגיב פיקוגרין לבדיקה. |
| ערכת הכנת דגימת DNA Nextera XT | Illumina | FC-131-1096 | כוללת תיבה 1 ותיבה 2 ריאגנטים ל-96 דגימות |
| ערכת אינדקס Nextera XT v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | ערכת אינדקס A ערכת אינדקס B ערכת אינדקס C ערכת אינדקס D |
| NextSeq 500/550 ערכת תפוקה גבוהה v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 מחזורים, יותר מ-250 דגימות לערכה |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 מחזורים, יותר מ-130 דגימות לערכה |
| ערכת בקרת PhiX Illumina | FC-110-3001 | לסידור מדדים מערכת אינדקס לפי הסדר | |
| ערכת מתקן לוחית אינדקס TruSeq | FC-130-1005 | ערכת | |
| כימות ספריית 2 מתקנים KAPA לריצוף הדור הבא | KAPA Biosystems | KK4824 | כולל תקנים מוכנים מראש, פריימרים |
| ומערכת טיפול בנוזלים MasterMix Janus NGS Express | PerkinElmer | YJS4NGS | משמש לדילול DNA במהלך ריצוף |
| 0.8 מ"ל לוחית אחסון | תרמו מדעית | AB0765B | צלחת MIDI לניקוי ספריית DNA ונורמליזציה |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | חרוזים מגנטיים בתמיסה לטיהור ספרייה |
| מעמד מגנטי-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | משמש לטיהור DNA מבוסס חרוזים מגנטיים |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | שייקר צלחות 96 בארות עם 4 פלטפורמות |
| צלחת PCR קשיחה | BioRad | HSP9601 | קיר דק, 96 באר |
| LightCycler 480 מכשיר II | רוש | 5015278001 | מכיל 96 בארות |
| צלחת Microseal 'B' PCR סרט איטום, דבק, אופטי | ביו-רד | MSB1001 | אוטמי צלחות שקופים 96 בארות |
| CLC גנומיקה Workbench | Qiagen | CLCBio | תוכנה לניתוח נתונים, גרסה 8 |
| NextSeq500 מכשיר | Illumina | אילומינה | סיקוונסר שולחני המשמש לריצוף הדור הבא |
מקורות
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
