כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להגביר את ייצור כמירה ללא השימוש של ציוד חדש. שינוי כיוון פשוטה של העובר להזרקה ניתן להגדיל את מספר העוברים המיוצר, להפחית באופן פוטנציאלי את ציר הזמן germline שידור.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism
במאמר זה
סיכום
תקציר
במאמץ להגדיל את יעילות ביצירת עכברים מהונדסים באמצעות מתודולוגיות ES תא, אנו מציגים עיבוד בפרוטוקול הנוכחי של הזרקת הבלסטוציסט. כאן אנחנו מדווחים כי סיבוב פשוט של העובר, וכן הזרקה דרך טראנס-הפנימית תא בנפח גדול (TICM) גדל אחוז עכברים chimeric מ 31% ל- 50%, עם אין ציוד נוסף או יותר התמחה הדרכה. 26 שונים מוכלאים שיבוטים, שיבוטים הכולל 35 הוזרקו על פני תקופה של 9 חודשים. היה הבדל משמעותי ההריונות או קצב ההחלמה של העוברים בין טכניקות מסורתיות הזרקת TICM. לכן, ללא שינוי כלשהו העיקריים בתהליך הזרקה, מיצוב פשוטה של הבלסטוציסט ואת הזרקת דרך ICM, משחררים את התאים ES לתוך חלל blastocoel יכולים פוטנציאל לשפר את הכמות של ייצור chimeric ובעקבות germline שידור.
מבוא
במשך קרוב ל-25 שנים, הקמת יישוב גנטית עכברים כבר תהליך איטי, לעיתים קרובות הקשו על ידי צוואר בקבוק בשלב microinjection תא blastocysts ES לדור של germline משדר כימרות. הפיתוחים האחרונים, כולל1,CRISPR/Cas92 פילוח תאים ES, תפוקה גבוהה ES תא דור מהמגזר כמו komp ב, השתפרו הדור/הזמינות של תאים ES מהונדסים. עם זאת, הדור של germline כימרות נשאר צוואר בקבוק ביצירת עכברים מהונדסים אלה ES תאים3,4. תפוקה גבוהה ES תא דור פרויקטים שייסרו על ידי השתנות גבוהה באיכות תא ES, אשר הוא קריטי עבור יצירה מוצלחת של germline כימרות. בנוסף, חלק מהשורות תא ES שימוש בדרך כלל ידועים הגבוהה אנאפלואידיה וייצור קשה germline כימרות המוסמכת5.
פותחו שיטות רבות ליצירת עכברים עם גם שימרה גבוה יותר, או לגמרי ES תא נגזר עכברים6,7,8,9,10. בעוד כל אחת ממערכות אלה יש את היתרונות שלה, יש להם גם החסרונות. הדור של tetraploid היו בעת יצירת תאים ES 100% נגזר עכברים, הוא לא יעיל, מוגבל בדרך כלל קווים outbred 5,6. שיטות חדשות של הזרקת morula יכול להניב כימרות אחוז גבוה, מתקרב 100%, אבל בדרך כלל דורשים ציוד נוסף משמעותי (לייזרים או piezos) ואימונים10,11. במעבדות איפה טכניקות אלה שכבר נמצאים במקום, מתודולוגיה חדשה זו ייתכן שלא יהיה צורך.
המטרה של מחקר זה היתה למצוא שיטה המשתמשת טכניקות נפוצות וציוד זמינים כדי להגביר את הקצב של כמירה הדור, ומגדילים את הסיכוי germline שידור של אלל mutant להקים את המושבה העכבר עוקבות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הפעולות נעשו כחלק מההתנהלות הרגילה של המתקן NIEHS לדפוק את העכבר הליבה. כל העכברים הוחזקו 12:12 מחזור אור h: כהה, היו להאכיל דיאטה של NIH-31 ומים ad libitum. כל הניסויים בוצעו בהתאם החיה אכפת והוועדה שימוש של נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה.
1. הכנה בעלי חיים
- מתרבים התורם עכברים, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J עכברים נקבה בגיל 8-10 שבועות של הגיל באופן טבעי כדי B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J עכברים גברים בין גיל 8 ו- 26 שבועות. בדוק תקעים חזותית למחרת בבוקר (E0.5).
- גזע עכברים הנמען, וובסטר שוויצרי עכברים הנשי בין גיל 6 ו 9 שבועות שנבחרים באופן טבעי עיקור עכברים זכרים וובסטר שוויצרי. בדוק תקעים חזותית למחרת בבוקר (E0.5).
2. ES תא הכנה
- עבור תאים AB2.2 ES 129-derieved, התרבות תאים DMEM בתוספת 15% FBS, 1% גלוטמין, 1% פן/דלקת ו- 0.1% β-mercaptoethanol. תרבות כל התאים האחרים ES לפי ההוראות של ES תא הספק, באמצעות פרוטוקולים המומלצת שלהם.
3. העובר אוסף
-
דיסקציה בעלי חיים
- להכין מספר מאכלים 60 מ מ, כ 1 לכל 5 עכברים כולל תוספת 3, עם 10 מ"ל הפיצוץ אוסף המדיה (BCM) (10% FBS IN DMEM)., 4. ובכן מגישים עם 0.5 mL BCM לכל טוב. Equilibrate ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
- המתת חסד B6 (Cg)-Tyr < c-2J > עכברים הנשי /J ב E3.5 באמצעות חנק2 CO, עם קצב זרימה של 10%.
- לאחר המתות חסד, במקום העכברים במצב פרקדן, להרטיב את הבטן ביסודיות עם 70% אתנול.
- עשו את החתך הראשון דרך העור בלבד, אל נקודת האמצע של הבטן, ביצוע פתיחת רחבה ככל האפשר. לאחר מכן פתח דרך דופן הבטן, שוב עושה את החתך רחבה ככל האפשר.
הערה: עושה את זה בשני שלבים מסייע להפחית או למנוע זיהום פרווה. - החל מ- שחלה, והחזקת כרית השומן של השחלה עם מלקחיים בוטה, בזהירות להסיר את השחלה, oviduct, הרחם, לוקח טיפול נוסף כדי לשמור את רקמת שומן עד למינימום. הסר את הרחם כמקשה אחת, או כמו קרניים בודדים, ללא כל שינוי בהליך הבא.
- לאחר ההסרה, מקום הרחם תבשיל 60 מ מ המכיל הפיצוץ אוסף המדיה.
-
הסרת העובר
- להכין מזרק 10 מ"ל מלא BCM, ובכושר עם מחט 25 גרם.
- הרחם אחד בכל פעם, להסיר אותם מן המנה החזקה של BCM, למחוק אותם על טישו כדי להסיר את עודף דם, ומניחים בקערה 60 מ מ מתחת הגדלה נמוכה לנתח מיקרוסקופ.
- והחזקת בעדינות ובזהירות את הרחם מתחת הקצה הדיסטלי (ליד oviduct) עם מלקחיים לנתח, להוסיף את המחט אל המרכז של הרחם, במקביל מטוס ככל האפשר. הכנס את המחט מעבר קצות המלקחיים.
- ללחוץ כדי המלקחיים להחזיק את הרחם על המחט, לגרש כ- 1 מ ל BCM דרך הקרן של הרחם.
הערה: יש לנקוט בשלב זה, כמו לחץ רב מדי על המזרק יגרום זרם בלתי נשלט של מדיה, לעיתים קרובות עוזב את המנה. - לאחר ריקון הרחם, uteri כל עד 5 לכל צלחת 60 מ מ, מניחים את המנה חזרה בחממה עד אוסף.
-
אוסף העובר
- באמצעות פיפטה מזכוכית מצוירת על יד מנגנון פיפטה בפה, לאסוף את blastocysts תחת טווח ויבתר, הניצב בין 25 X 35 X. (איור 1).
הערה: הפה פיפטה מנגנון מורכב של 30-40 ס מ, צינורות גמישים, מתחת לגיל 5 מ"מ זהות להוסיף 1, 000 µL פיפטה עצה, בשלב הראשון בקצה אחד, ולהצמיד את פיפטה מזכוכית בתוכו. להוסיף מסנן מזרק הקצה השני, עם צמוד 1 cc מזרק החבית, לא בוכנה, להתנהג כמו חתיכה הפה. - הסרת מנות החממה, באמצעות תבנית רשת, לבחון כל חלק המנה עבור עוברי. עוברי נאספות למעלה בנפרד ומניחים על ירידת BCM בקערה משנית.
- לאחר איסוף כל המנות, לשטוף את העוברים פעם נוספת בטיפה של BCM טריים, ולאחר מכן מקם בצלחת טוב 4 להמתין הזרקה.
- באמצעות פיפטה מזכוכית מצוירת על יד מנגנון פיפטה בפה, לאסוף את blastocysts תחת טווח ויבתר, הניצב בין 25 X 35 X. (איור 1).
4. העובר הזרקה
- לאסוף תאים ES בנפרד עם מחט ההזרקה המבוסס על אישור.
- להכין צלחת הזרקת על-ידי הוספת 5-7 מ של הזרקת מדיה (DMEM, 10% FBS ו 20 מ מ HEPES) על צלחת זכוכית הזרקת התחתון. זריקות נעשים בטמפרטורת החדר.
- שימוש microinjector אוויר או שמן, להחיל ואקום המחט הזרקת כדי למשוך תאים ES. לטפל כדי לשמור, על שטח קטן ככל האפשר בין תאים. לספור את התאים ES כאן, או בשלב ההזרקה.
- בחר תאים ES שהם בינוניים עד קטנים בגודלם בהשוואה לאוכלוסייה הכללית של תאים, עם משטח חלק, וללא פגמים ברור כגון וקואלות.
הערה: אוכלוסיות תאים ES להשתנות במידה רבה באיכות מורפולוגי, הסטנדרטים בשימוש יהיה צורך להתאים איתם.
- להזריק העוברים עם תאים ES כ 15 (איור 1).
- לצרף פיפטה החזקה של עצה כדי microinjector השני אוויר, והצב העובר ליד הפתח של בעל. החל ואקום כדי לאבטח את העובר עם בעלי.
- להתאים עבור ציר z באמצעות הזזת פיפטה החזקה של למעלה או למטה כך העובר רק נוגע השקופית, ואחריו בסדר התמקדות סונה. לאחר מכן, להתאים ציר Z של המחט הזרקת כך ES תאים ליד הקצה הם בפוקוס.
- להתאים את העובר כעת על ידי דחיפת בעדינות מן המחט הזרקת בחלק העליון או התחתון, סיבוב זה כדי לשים את ICM במיקום הרצוי.
- הכנס את המחט הזרקה של סונה, את ICM או trophoblast, באמצעות דחיפה חזקה אבל מבוקרת. חלות לחץ קל microinjector של המחט הזרקת כדי לסייע למנוע את blastocoel קורסת.
- ברגע שהמחט שחדר את blastocoel, הפעילו לחץ מ microinjector כדי להעביר תאים ES blastocoel של העובר. השהה בקצרה כמו שפוע של המחט מתחיל לצאת העובר כדי לאפשר את הלחץ בתוך העובר יחזור לקדמותו, תוך שמירה על התאים.
הערה: תאים ES קבוצת התייחסות הוזרקו בדרך כלל, בעקבות ES המסורתי של תא הזרקת פרוטוקול9, מטפל לא לגעת את ICM. תאים ES הוזרקו גם באמצעות ICM, דוחף את המחט ישירות דרך ICM (TICM) (איור 2הסרט משלים).
5. העברת eEmbryos
- העברת העוברים וובסטר שוויצרי עכברים-E2.5, באמצעות התקן העברה ניתוחי העובר, לפי נהלי ייצור. הליך כירורגי זה מחייב ללא הרדמה או טיפול מיוחד לאחר הניתוח. עכברים בבית בנפרד לאחר המעבר של העוברים, וכן באמצעות משלוח הגמילה עוקבות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מודל לינארי אפקטים מעורבים בטיפול קו תא כאפקט אקראי, שימש כדי לנתח את הנתונים התוכנה (למשל SAS (גרסה 9.2)). כל ניתוח מבוקר על המספר של עוברי העבירה לבין הקו הסלולרי. הניתוח השני מבוקר גם עבור מספר הגורים ששרדו.
במחקר זה, כל שורת ES התאים ולשכפל הוזרק שניהם עם מסורתית וטכניקות TICM, לסירוגין בין שתי השיטות לאחר כל העובר. לאחר ההזרקה, העוברים היו הפרדה על מדיח הכלים, כשהם מקובצים לפי העברה, בדרך כלל בין העוברים 12 ו- 15 לכל נמען נ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זה זמן רב כבר חשבה כי כל הפרעה של ICM יכול להוביל התמותה, למעשה, הנוכחי הבלסטוציסט microinjection פרוטוקולים עדיין מזהירים זה12,13. מה שהראתי כאן זה microinjection דרך ICM אינה פוגעת העובר, והיא מגדילה את היבול של כימרות.
המנגנון המדויק בשביל האפקט הזה לא זוהתה. עם זאת, שיבוש מכני את ICM, את hypoblast הנלווים, צריך להגביר את השכיחות של שילוב תאים ES ICM שהוקם בעקבות microinjection. עבודה בתחום iPSCs הראו כי גירוי מכני מסייע התכנות של ה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך [חלקית] על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה. תודה מיוחדת Shyamal Peddada לשם ניתוח סטטיסטי. אנחנו גם רוצים להודות יאו האמפרי, גארי ציפור, יוקי םינוי לסקירה של כתב היד הזאת, פרנקו דימיו עבור המשך תמיכה וייעוץ שלו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחט הזרקת תא ES | Humagen | MSC-20-0 | |
| מכשיר NSET | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (טכנולוגיות חיים) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (טכנולוגיות חיים) | 10439-024 | יש לבדוק בנפרד את תאימות תא ES. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-מרקפטואתנול | Sigma | M7522 | |
| מיקרו מניפולטור | Leica | מיקרו מניפולטור | |
| מיקרו מזרק | Eppendorf AG | תא חשמלית אוויר 5176 | |
| מיקרוסקופ | Leica | DM IRB | |
| 4 באר צלחת | Thermo Scientific | 176740 | |
| צלחת 60 מ"מ | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J | Jackson Labs, בר הרבור, מיין, ארה"ב | 000058 | |
| עכברי וובסטר שוויצריים | Taconic, ארה"ב | Tac:SW | |
| צלחת הזרקה | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
מקורות
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
