עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

סיכום

כאן נתאר פרוטוקול המאפשר ניתוח היסטולוגית ומולקולרית של דגימות עור לאחר ההזרקה intradermal קנדידה אלביקנס . פרוטוקול זה שומר על שלמות המבנה של העור ומאפשר הלוקליזציה של תאים חיסוניים רקמות-תושב או שזה עתה מגויסים, כמו גם את ההתפלגות הפתוגן.

תקציר

העור הוא איבר מאוד מורחבת של הגוף, עקב זה משטח גדול, ללא הרף ייחשף מיקרואורגניזמים. נזק לעור יכול בקלות להוביל דלקות הדרמיס והתוצאה בתורו, יכול, להיות הפצת פתוגנים למחזור הדם. הבנת איך מערכת החיסון נלחם זיהומים בשלב מוקדם מאוד, איך המחשב המארח יכול לחסל פתוגנים היא צעד חשוב כדי להגדיר את הבסיס עבור התערבויות טיפוליות עתידיות. כאן נתאר מודל של זיהום קנדידה אלביקנס שיכולים להמחיש את התהליכים המתרחשים מוקדם במהלך זיהום, כולל בעת המחלה עברה את מחסום האפיתל, כמו גם את התגובה החיסונית שהפיק את אלביקנס ג הפלישה. השתמשנו מודל זיהום זה כדי לבצע ניתוח היסטולוגית המציגים את התאים החיסוניים זה לחדור את העור, כמו גם את הנוכחות ואת לוקליזציה של המחלה. הדגימות שנאספו לאחר הזיהום ניתן לעבד לחילוץ RNA.

מבוא

גוף האדם מכוסה עם מספר גבוה מאוד של מיקרואורגניזמים. לפני השטח של העור הוא בית הגידול של כמעט מיליון חיידקים לכל סנטימטר מרובע¹. מספר זה, עם זאת, אינו משקף על המגוון המלא של מיקרואורגניזמים והצנרות העור. בנוסף חיידקים, גוף האדם הוא התנחלו על ידי מינים פטרייתי רבים, כולל אלביקנס ג, שזה מסוגל לשרוד הן את הרירית והן את העור ברמה².

בשנים האחרונות גדל מאוד האחוז של אנשים שאובחנו עם זיהומים פטרייתיים. זאת בעיקר בשל העלייה במספר אנשים immunocompromised, קרי, חולי HIV-חיובי. וכלפי מטופלים עברו כימותרפיה או תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת³. במחקר מעקב שנערך בארצות הברית, Wisplinghoff. et al. הראה כי 9.5% של זיהומים nosocomial למחזור הדם שנגרמו על ידי זנים של קנדידה ⁴. עקב המופע מוגברת של זיהומים פטרייתיים, במיוחד בגלל האחוז מוגברות של קנדידה מינים נמצאו במהלך זיהומים למחזור הדם, הבנת איך הפתוגן הזה בורח השליטה של מערכת החיסון היא מאוד חשוב.

ג אלביקנס הוא בפטריה dimorphic שגדלה בצורות מורפולוגיות שונות כגון שמרים, blastospores, pseudohyphae ו- hyphae בהתאם לתנאים סביבתיים⁵. בצורתו hyphal, אלביקנס ג מציג את הקיבולת הגבוהה שלו invasiveness ויש לו את היכולת לחדור את אפיתל⁶.

זיהומים אלביקנס ג נחקרו באמצעות מספר גישות ניסיוניות. המודל הנפוץ ביותר של זיהום הוא הזרקה תוך ורידי של שמרים אלביקנס ג ⁷. עם זאת, מודל זה לא להתחשב בכל התהליכים זה יקרה לפני הפטריה מצליח להתפשט למחזור הדם. מודל נוסף מנצל היכולת של אלביקנס ג לפלוש האפיתל. בשיטה זו, המכונה גם נייר דגם⁸, פותחה על ידי Gaspari et al. . ב 1998⁹, מורכב באמצעות נייר חול כדי תשפשפו את העור, וכך למנוע את הקרנית לפני החלת אלביקנס ג. הליך זה מאפשר את הפטרייה לחדור האפיתל, ובכך מאפשר ניתוח פולשני ביכולות של הפתוגן הזה. לבסוף, דגמים אחרים של זיהומים במערכת העיכול¹⁰ ו כלי הנשימה¹¹ השתמשו במחקרים שונים.

היווצרות פצע (כמו דגם נייר חול) גורמת את ההפעלה של כמה מסלולים, כולל תא החיסון גיוס והפעלה, על מנת לקדם את תהליך הריפוי¹². זה יכול לשנות או להסתיר את התגובה החיסונית במיוחד elicited נגד המחלה, ובכך מוביל משתנה מתערב תוצאות.

כאן נתאר שיטת דלקת עור זה מונע היווצרות פצע הראשונית ואת של אינדוקציה של סביבה דלקתית הבזליים. כדי לשמור על המבנה אפיתל ללא פגע, ישירות נזריק אלביקנס ג בצורתה hyphal ב למחרת היום עמוק. אף-על-פי זריקה אחת יכול להפיק דלקת קלה, הכמות של דלקת מוגבלת, מוגבל לעומת היווצרות פצע פתוח כמו דגם נייר חול. הגישה כי אנו מתארים כאן מאפשר המחקר של התגובה החיסונית לזיהום פטרייתי, התפשטה תוך הימנעות הסביבה דלקתית מוגזמת ולא קיימים נגרם נזק מכני.

פרוטוקול

כל ההליכים היו מאושרים תחת טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC) ולא פעלו תחת פיקוחו של המחלקה של משאבים בעלי חיים לילדים חולים (קשת) בבית החולים לילדים בבוסטון או אושרו על-ידי האיטלקי משרד הבריאות והופיע תחת מוסדיים חיה טיפול הוועדה ב האוניברסיטה של מילאנו-ביקוקה.

1. הכנה ג אלביקנס

1. תרבות ג אלביקנס, זן CAF3-1¹³, צינורות המכילות בינוני עשיר (דקסטרוז peptone תמצית שמרים (YEPD), תמצית שמרים 1% (w/v), 2% (w/v) מה נשארתי Peptone, 2% (w/v) גלוקוז) בתוספת uridine (50 מ"ג/ליטר) ב 25 º C. בתנאים אלה אלביקנס ג גדל כמו שמרים.
   הערה: זנים אחרים אלביקנס ג יכול לשמש, כגון זן SC5314 אלביקנס ג ¹³לבודד קליני. מאז לאחרונה הראו כי התהליך כיבית הנגרמת על ידי הפעלת מערכת החיסון המולדת¹⁴, תיאורטית כל זן אלביקנס ג המתחזק את רכיבי קיר התא והן המבנה, כמו גם היכולת מקורם ההקרנות hyphal, יכול לשמש.
2. נטר את התרבות על ידי ספירת הריכוז הסלולר באמצעות מנתח מונה תא.
3. הקציר התרבות כאשר הוא מגיע ריכוז של 8 x 10⁶ תאים למ"ל. לחלופין, השתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את יתר₆₀₀.
   הערה: בדרך כלל, ערך של יתר₆₀₀ = 1 מקביל ריכוז השמרים של 3 x 10⁷ תאים למ"ל, אך מומלץ טיטור.
4. Resuspend התרבות YEPD-uridine בינוני, באמצעות HEPES (50 מ מ, pH 7.5) כסוכן מאגר, דגירה התרבות ב 37 ° C כדי לעודד היווצרות hyphae. בדוק היווצרות hyphal תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 100. צורה hyphal היא גלויה 5 שעות לאחר culturing ב 37 מעלות צלזיוס; עם זאת, להשתמש התאים 16 h לאחר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס כאשר האחוז hyphal מגיע כמעט 95% של התרבות הכולל.
5. להעשיר עוד את ההכנה בריכוז hyphal, צנטריפוגה aliquots של התרבות-3,300 g x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- PBS סטרילי-ריכוז של עונה 1 פרק 10⁸ hyphae/mL....

2. הזרקת עורי עמוק

1. 24 שעות לפני ההליך זיהום, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג), ואז מגלחים את האגף של העכברים באמצעות של קוצץ חשמלי.
   הערה: לאחר כל נוהל הכרוכים בהרדמה, הנח העכברים תחת מנורת חימום עד הם התאוששו ביעילות.
2. שאר העכברים במשך 24 שעות ביממה למנוע כל דלקת עקב תהליך הגילוח.
3. 24 שעות לאחר הניתוח גילוח, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג).
4. בדוק את רפלקס כפה על מנת להבטיח כי העכברים הם מרדימים עמוקות. להעריך את רפלקס פאו מאת בחוזקה צובט את כף הרגל. אם ההרדמה מושגת, החיה לא להרגיש כאב, לא זזה.
5. מזריקים hyphae אלביקנס ג ב למחרת עמוק באמצעות מזרק אינסולין 0.3 mL עם מחט 30 G x 8 מ מ נפח סופי של 50 µL הזרקה, המקביל 5 x 10⁶ hyphae הזרקה.
   1. משוך את העור של האגף מגולח מתוח בעזרת שתי אצבעות כדי להזריק את עוצמת הקול ישירות בלמחרת היום עמוק. הכנס את המחט עם זווית של 10-15° עם שפוע של המחט פונה כלפי מעלה.
   2. בזווית זו, המחלה להיות מוזרק עם עומק של 300-500 מיקרומטר. כדי להבטיח שההזרקה מבוצעת טוב, בדוק האחסון מוזרק יוצר בליטה זה נספג כמה דקות לאחר ההזרקה.
      הערה: בליטה נוצרו לאחר הזריקה יהיה של 1 ס מ.². זהו האזור יוסר בנקודת הזמן המיועד לבדיקה היסטולוגית או מולקולרית.
   3. נקודות זמן על פחות מ 24 שעות (מומלץ) לסמן את האזור של זיהום עם עט מרקר, מאז המכשול הקים עם ההזרקה נמשכת לכמה דקות, אחרי אשר נספגות. עבור נקודות זמן של 24 שעות או יותר, שלב זה אינו נדרש, כי אולקוס או ציסטה יהיה גלוי בבירור.

3. לטעום איסוף והכנה היסטולוגית מכתים

1. המתת חסד העכברים על פי הנהלים מוסדיים.
2. בעזרת מלקחיים כירורגיים, משוך את העור בגבול של אתר מוזרק, שסומן קודם לכן עם טוש. באמצעות מספריים כירורגיים, לסלק את האתר הנגוע על ידי חיתוך העור אחרי קו מסומן.
   הערה: להיות זהירים להפריד את העור הצפק בעזרת המספריים עגול.
3. לטבול את העור של תבנית הבסיס חד פעמי מלא עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם, עם הצד הפנימי של העור כלפי מעלה. להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי עד למתחם הופך לבן. לא נותנים החנקן הנוזלי לכסות המדגם לפני זה קפוא לחלוטין כפי שזה היה פוגע. המדגם.
   הערה: זהירות! במהלך שלב 3.3, ללבוש מגן הפנים להגנה מפני חנקן נוזלי.
4. אם הדגימות לא משמשים מיד להכנה שקופיות, במהירות לאחסן אותם ב- 80 ° c
   הערה: דוגמאות שניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן.

4. הכנה של שקופיות

1. לחצי את הדגימה כדי להכין את הפרוסות היסטולוגיה החל המרכז של המדגם.
2. חותכים 5-מיקרומטר פרוסות עבות עם cryostat.
   הערה: עבור דגימות עור, הטמפרטורה של cryostat לא צריך להיות גבוה מ-25 מעלות צלזיוס. טמפרטורה גבוהה יותר תגרום התכה חלקית של ה-H-OCT ומתוחזק ולכן הדגימות לא להיות בתנוחה הנכונה במהלך ההליך חיתוך.
3. השתמש שקופיות מיקרוסקופ הטעון חיובית כדי לאסוף את הפרוסות.
4. אם הפרוסות שנאספו לא משמשים מיד לאחר ההכנה, לאחסן אותם ב-20 ° C. בשלב זה, פרוסות שניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.

5. hematoxylin & אאוזין מכתים

1. כתם השקופיות על-ידי טבילה hematoxylin של גיל עבור 4 דק לשטוף את השקופיות פועל מי ברז למשך 5 דקות.
2. כתם שהשקופיות על-ידי טבילה אאוזין Y לפתרון מינימלית 1 לשטוף את השקופיות פועל ברז מים במשך 5 דקות יש לשטוף את השקופיות בעזרת מים מזוקקים לפני שתמשיך את הפרוטוקול.
3. מייבשים על ידי טבילה באופן סדרתי הגדלת ריכוזי אתנול פתרונות (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). לטבול את השקופיות 15 s בכל הפתרונות אתנול.
4. לנקות את השקופיות למשך לפחות 2 דקות על ידי טבילה סוכן סליקה היסטולוגית.
5. לטעון את השקופיות בעזרת הרכבה בינונית, שער גולשת.
6. לרכוש תמונות של השקופיות עם סורק שקופיות מיקרוסקופ בהגדלה גדולה-X 40.

6. חומצה המחזורית-שיף (PAS) מכתים

1. לתקן השקופיות עם אצטון % ≥99.5 בטמפרטורת החדר במשך דק 1. שטיפת בשקופיות זורמים מהברז עבור 1 דקות.
2. כתם השקופיות על-ידי טבילה בפתרון המחזורית חומצה (1 g/dL) עבור 5 דק שטיפת בשקופיות 3 שינויים של מים מזוקקים.
3. כתם השקופיות על-ידי טבילה ריאגנט של שיף במשך 15 דקות לשטוף את השקופיות פועל מי ברז למשך 5 דקות.
4. כתם על השקופיות על-ידי טבילה hematoxylin של גיל עבור 5 דק. לשטוף את השקופיות מפעיל ברז ל 30 s.
5. מייבשים את השקופיות על-ידי טבילה 3 שינויים של 100% אתנול. לטבול את השקופיות 15 s בכל פעם.
6. לנקות את השקופיות למשך לפחות 2 דקות על ידי טבילה סוכן סליקה היסטולוגית.
7. לטעון את השקופיות בעזרת הרכבה בינונית, שער גולשת.
8. לרכוש תמונות של השקופיות עם סורק שקופיות מיקרוסקופ.

7. לטעום איסוף והכנה החילוץ-RNA

1. המתת חסד העכברים על פי הנהלים מוסדיים. הסר את דגימות עור כמו שלב 3.2.
2. לטבול את הדגימות צינור כובע הצמד 2 מ"ל עם 1 מ"ל של ריאגנט לחילוץ thiocyanate-פנול-כלורופורם חומצה guanidinium.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
3. לחתוך את הדגימה לחתיכות של 0.2 ס מ² באמצעות מלקחיים כירורגיים.
   הערה: זהירות! רוב ריאגנטים עבור בידוד ה-RNA הם רעילים מוטגניות. צעדים 7.3 7.4 חייב להיעשות תחת ברדס fume.
4. לרסק את הדגימה עם מפעל חרוז במהירות של תנודות בשנייה 20 על 20 דק. לחלופין, קדר מכני יכול לשמש.
5. בדוק את המגון יעיל של הדגימות וחיפש את הנוכחות של חתיכות שלמות של העור. חזור על שלב זה אם הדגימות לא הומוגני לגמרי.
6. Centrifuge הדגימות-16,000 x g עבור 1 מינימלית לשמור את supernatants לחילוץ RNA וזורקים בגדר. שלב זה מבוצע כדי לחסל שיער ופסולת יכול לחסום את העמודות החילוץ.
7. להמשיך עם החילוץ-RNA באמצעות עמודות טיהור רנ א¹⁴.
8. השתמש ספקטרופוטומטרים לאמוד ריכוז וטיהור של RNA. אם RNA תמציות לא משמשים מיד להכנה cDNA, אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.

תוצאות

באמצעות ההזרקה של המחלה ישירות בלמחרת היום עמוק, המורפולוגיה מבנית של רקמת נשאר שלם (איור 1 א').

שמירה על העור המבנית מאפשרת הגילוי של תאים חיסוניים ולוקליזציה שלהם באתר של זיהום. ההגדלה גבוה יותר באיור איור 1B מגלה כי המורסה מורכבת בעיקר מ אורך חייהם לויקוציטים (PMCs) המכילים את התפשטות המחלה על ידי ריתוק שלה באתר של זיהום. גיוס של PMCs, כגון נויטרופילים, מאפשרת היווצר...

דיון

כאן אנחנו תיאר שיטה של זיהום אלביקנס ג ללמוד תהליך דלקתי שמאותחלת הכניסה פטרייתי ב למחרת היום עמוק.

אף-על-פי להצטברות של העור הוא אירוע נדיר יחסית על זיהום אלביקנס ג ¹⁵, הזרקה של הפטרייה ישירות בלמחרת היום עמוק מאפשר לא רק חקר היווצרות מורסה מונחה-פטרייתי, אלא גם הניתוח של החיסון ספציפי תאים להשתתף להכיל פטרייתי להתפשט. עם השיטה המתוארת כאן, זה אפשרי ללמוד את האינטראקציה בין תאים חיסוניים, כמו גם הגיוס של תאים חיסוניים חשובים בהשתלטות על התפשטותה פטריי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים
PBS	Euroclone	ECB4053L	חם ב-37 מעלות; אמבט C לפני השימוש
מעבדות היסטו-קו	תרכובת H-OCT	R0030
מעבדות קו היסטו המטוקסילין של גיל		09-178-2
תמיסת Eosin Y, מעבדות קו היסטו אלכוהולי		09-209-05
אתנול אבסולוט	שרלאו	ET00232500
מעבדות		קו היסטו של Citro-HISTOCLEARR0050
Eukitt, הרכבה בינונית	ביו-אופטיקה
אצטון	סיגמא-אולדריץ'	179124
מערכת צביעה PAS	סיגמא-אולדריץ'	395B-1KT
בקטו פפטון	BD	211677
תמצית שמרי בקטו	BD	212750
D(+)-גלוקוז נטול מים לביולוגיה	מולקולריתApplichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
צינורות נעילה בטוחה 2 מ"ל	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	רעיל, קורוזיבי ומוטגן. השתמש בכל אמצעי הזהירות הדרושים
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
חנקן			ללבוש מגן עיניים
<חזק>מכשיר
קולטר נגד ספירת חלקיקים	בקמן קולטר
צנטריפוגה 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat			היסטו-ליין
רקמותLiser	QIAGEN
/חזקים>
0.3 מ"ל מזרק אינסולין עם מחט 30 גרם x 8 מ"מ	BD	324826
מלקחיים
מספריים
עובש בסיס מעבדות חד פעמיות		2781
שקופיות ביו-מיקרוסקופ טעונות חיובית	ביו-אופטיקה	09-2000
תלושי כיסוי 24 x 50 מ"מ	תרמו מדעי	11911998

נוזלי מעבדות <חזק>חומרים<כירורגייםכירורגיים