מאמר שיטה

קיבעון ריאה תחת לחץ מתמיד על הערכה של אמפיזמה בעכברים

DOI:

10.3791/58197

⸱

26 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Pharmaceutical Planning Group, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הוא פרוטוקול שימושי עבור קיבעון ריאה שיוצר מצב יציב עבור הערכה היסטולוגית של דגימות ריאה ממודל העכבר של אמפיזמה. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהוא יכול לתקן את הריאות הרבה עם הלחץ התמידי אותו ללא התמוטטות ריאה או בדלציה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אמפיזמה היא תכונה משמעותית של מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). מחקרים הכרוכים במודל עכבר emphysematous דורשים קיבעון ריאה אופטימלי כדי לייצר דגימות היסטולוגית אמין של הריאה. בשל טבעה של ההרכב המבני של הריאה, המורכב ברובו מאוויר ומרקמות, קיים סיכון שהוא מתמוטט או מרוקן במהלך תהליך הקיבוע. קיימות שיטות שונות של קיבוע ריאה, שלכל אחד מהם יתרונות וחסרונות משלו. שיטת קיבוע הריאה המוצגת כאן משתמשת בלחץ תמידי כדי לאפשר הערכת רקמות אופטימלית למחקרים באמצעות מודל ריאות העכבר emphysematous. היתרון העיקרי הוא שהוא יכול לתקן הרבה ריאות עם אותו מצב בבת אחת. דגימות ריאות מתקבלות מעכברים כרוניים חשופים לעשן סיגריה. קיבוע ריאה מבוצעת באמצעות ציוד מיוחד המאפשר ייצור של לחץ תמידי. הלחץ התמידי הזה שומר. על הריאה במצב מנופח כך, שיטה זו מייצרת דוגמית היסטולוגית של הריאה המתאימה להערכת הסיגריה הנגרמת נפחת מתון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COPD היא אחת הסיבות המובילות בעולם של מוות1. עשן סיגריות הוא הגורם החשוב ביותר של COPD, אבל מנגנוני הפתוגנזה להישאר מוגדרים לחלוטין. COPD מדגים שני מאפיינים עיקריים, כולל הגבלה מתקדמת של זרימת אוויר ותגובה דלקתית נורמלית של הריאה. הפרעת emphysematous מתרחשת לעתים קרובות בריאות של חולי COPD2. הממצאים הפתולוגיים של אמפיזמה מאופיינים בהשחתת קירות מכתשיים3. מספר מיני בעלי חיים שימשו להפקת דגמי COPD בvivo (כגון, כלבים, שרקנים, קופים ומכרסמים)4. עם זאת, העכבר הפך לנפוץ ביותר בבניית מודלים COPD. זה יש יתרונות רבים, כולל העלות הנמוכה שלה, היכולת להיות מהונדסים גנטית, מידע רב גנומי זמינות, זמינות של נוגדנים, ואת היכולת להשתמש במגוון של זנים של העכבר5. כיום, אין מודל העכבר שיכול לחקות את התכונות המלאות של האדם COPD; לכן, חוקרים בודדים חייבים לבחור איזה מודל מתאים ביותר עבור מחקר COPD ספציפי6. מודל העכבר emphysematous הוא אחד מדגמים רבים של עכבר COPD הזמינים כעת. דגמים נוספים כוללים מודל החרפה של העכבר, מודל שיתוף morbidities מערכתית, ו COPD הרגישות דגם7.

מודל העכבר emphysematous יכול להיווצר על ידי מספר סוגים של סוכנים אקסוגני, כולל סוכנים כימיים וחשיפה עשן סיגריה4. חשיפה כימית (למשל, כדי elastase) מייצרת סוג חמור של אמפיזמה, בעוד עשן סיגריות תוצאות אמפיזמה קלה8,9. עשן סיגריות הוא נחשב הגורם העיקרי לפתוגנזה של COPD; לכן, הבחירה של עשן סיגריה כאמצעי ליצור מודל העכבר COPD הוא הגיוני10. מחקרים רבים השתמשו עשן סיגריות כדי ליצור אמפיזמה בעכבר. לדוגמה, Nikula ואח ' יצרה בהצלחה מודל עכבר emphysematous מ B6C3F1 עכברים נקבה על ידי חשיפת אותם עשן סיגריות עבור 7 או 13 חודשים11. כמו כן הקמנו מודל עכבר emphysematous באמצעות חלבון סמן/SMP-30 KO עכברים12. זה חיוני לבצע קיבוע ריאה שיטה שיכולה להמחיש כראוי זה מודל אמפיזמה מתון על ידי חשיפה עשן סיגריה.

שיטות שונות לקיבוע ריאות הוקמו13. עם זאת, אין שיטה סטנדרטית זהב של קיבוע רקמת ריאות להערכת אמפיזמה14. מספר מחקרים מהמעבדה הראו כי מערכת הקיבעון המוצגת כאן שימושית על ידי יצירת מצב יציב להערכת אמפיזמה12,15,16,17,18. היתרון העיקרי של המערכת הנוכחית הוא שהוא יכול לתקן את הריאות הרבות עם אותו מצב בבת אחת ללא התמוטטות ריאה או בדלציה. מערכת קיבעון הריאה הנוכחית משתמשת בכמה ציוד מיוחד המאפשר דגימות ריאה להיות מנופח בלחץ קבוע מתאים לתקופה נתונה. ציוד מיוחד זה כולל שלושה חלקים, כולל מכולה נמוכה יותר, מכולה עליונה ומשאבה. דגימות ריאות ממוקמות במיכל התחתון המחובר לסוכני תיקון בלחץ, והתוצאה היא 25 הבדל בלחיצה2O ברמה של הסוכנים בין המכולות העליון והתחתון19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות הבאות אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים וועדות השימוש של אוניברסיטת Juntendo הספר לרפואה. ההנחיות להתנהלות נאותה של ניסויים בבעלי חיים, מועצת המדע של יפן, 1 ביוני, 2006 הופעלו. ישנם שלושה שלבים עיקריים בשיטה זו: 1) לנתיחה העכבר, 2) הדימום בריאות, ו 3) קיבעון של רקמות ריאות בסיוע ציוד מיוחד. בדרך כלל, דגימות ריאות מעובדות לembedment אחרי 48 h של קיבעון12,15,16,17,18.

1. ניתוח עכבר

  1. למדוד את משקל הגוף של העכבר, ולאחר מכן לקבוע את כמות הפנטוברביטל לניהול.
  2. הכנס פנטוברביטל intraperitoneally במינון של 70 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף ולאשר הרדמה על ידי העדר התגובה צביטה הבוהן.
  3. להזריק את המחט בזווית 45 ° עד שהוא חודר את העור ואת השריר. לצייר את הבוכנה ולאשר ואקום אוויר, ואז להזריק את פנטוברביטל.
  4. תאשר את ההרדמה. בהעדר תנועת רפלקס
    הערה: שימוש בעכבר מורדם לעומת עכבר מורדמים מומלץ לדימום מלא בריאות.
  5. חותכים את העור העכבר ואת שריר הבטן בקו האמצעי, מכוון לאזור הספלי.
  6. . לספק מרחב עבודה רחב יותר

2. דימום ריאות

  1. לחשוף את שכבת הסרעפת ונקב אותו עם מלקחיים.
  2. פתח את החלל החזה לחתוך את האזור sternal, המאפשר את הריאות והלב כדי להיראות בבהירות.
  3. חותכים את הלב באטריום השמאלי והחדר הימני.
  4. הכניסו צינורית (24 גר') לאזור החדר הימני והנחו אותו לאזור הספלי עד שיגיע לעורק הריאתי, כמוצג באיור 1.
  5. הפעל את המשאבה ואפשר לתמיסת מלח באגירה של 1 x (PBS) לזרום (כ-200 mL/h) עד שכל רקמת הריאה תשתנה לצבע לבן.

3. קיבוע רקמת הריאה

  1. . הסירו את קנה הנשימה, הריאות והלב
  2. שחררו את כל שלושת האיברים על ידי חיתוך רקמות החיבור הסובבות.
  3. לקשור את הברופון הראשי הימני עם חוט תפר וחותכים את כל האונות של הריאה הימנית.
  4. (אופציונלי): האונות של הריאה הימנית מורכבת מארבעה חלקים. חותכים את החלקים האלה מתוך הברופון הימני הראשי לחלק את החלקים לעיבוד כמו דגימות רקמות קפואות.
  5. הכנס את הלב ואת האונות של ריאה שמאל לתקן סוכנים, ממוקם בתוך 10 מ"ל מזרק.
    התראה: סוכני התיקון מסוכנים. ללבוש ציוד הגנה מתאים (למשל, כפפות גומי ארוכות) ולעבוד בחדר מאוורר היטב.
  6. צור מצב ואקום באמצעות מזרק 10 מ ל כדי לנפח את הריאה, כפי שמוצג באיור 2.
  7. הכנס צינורית (20 גר') לקנה הנשימה וקשור קשר.
  8. מנפח את הריאה עם תיקון סוכנים כדי לבדוק עם דליפות, באמצעות מזרק 1 mL.
  9. העברה לציוד לחץ בקיבוע ריאה, כפי שמודגם באיור 3.
  10. לאחר תיקון תקופות, להסיר את דגימת הריאה לקשירת קנה הנשימה עם קשר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שמתואר קודם לכן, הציוד התמחה, היוצר לחץ תמידי מורחב, ניתן לחלק לשלושה חלקים (איור 3א). החלק התחתון הוא הנקודה שבה יש להוסיף את דגימת הריאה (איור 4א). הריאה מחוברת באמצעות צינורית (20 גר') לקצה זרימת פורמלין באמצעות התרנגול הפסקת שלושה כיוון (איור 4ב). הלחץ נוצר מפני רמות שונות של תיקון סוכנים בין המכולות התחתונות והעליון (איור 5). ההבדל בלחץ הוא 25 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך הקיבעון של הריאות מכרסמים הציג כאן הוא לא רומן; עם זאת, למערכת זו יש מספר יתרונות. ראשית, זה יכול לתקן את הריאות הרבה (מקסימום של 20) עם אותו מצב בבת אחת. אגודת הפתולוגיה הגיאולוגית מצהירה כי הלחץ לשינוי הכבידה משתנה מ -22 – 25 cmH2O22. בעיקר, מספר מחקרים ביצעו קיבעון ריאה בלחץ של 25 cmh2O13,19,23,24,25,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מתחרים להכריז עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו היתה נתמכת בחלקו של JSPS KAKENHI גרנט מספר 26461199 (ט. סאטו) והמכון לרפואה מגדר הסביבה, Juntendo האוניברסיטה בוגרת בית הספר לרפואה, גרנט מספר E2920 (ט. סאטו). לפאנדר לא היה כל תפקיד בעיצוב השיטות הנוכחיות ובכתיבת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% פורמלין (תמיסת חיץ ניטרלית פורמלין)Wako060-01667
מלקחיים כפופיםHammacherHSC187-11
צינורית, גודל 20Gצינורית TerumoSR-FS2032
גודל 22GTerumoSR-OT2225Cצינורית לריאות exsanguinate
מלקחייםHammacherHSC184-10
KimtowelNippon Paper Crecia (קימברלי קלארק)61000
KimwipeNippon Paper Crecia (קימברלי קלארק)62011
מיכל תחתון (חומר זכוכית אקרילית)Tokyo Scienceציוד לחץבהתאמה אישית
משאבת רולרNissin Scientific CorpNRP-75מכונת משאבה להוצאת ריאות
משאבת רולר RP-2000Eyela (טוקיו Rikakikai Co. Ltd)160200משאבת ציוד לחץ
צינור סיליקון Ø 9 מ"מSansyo94-0479רכיב ציוד לחץ
Somnopentyl (64.8 מ"ג/מ"ל)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312Pentobarbital נתרן
מספריים כירורגייםHammacherHSB014-11
חוט תפר, גודל 0NescosutureGA01SW
מזרק, מזרק 1 מ"לTerumoSS-01T
, 1 מ"ל עם מחטמזרק TerumoSS-01T2613S
, 10 מ"לTerumoSS-10ESZ
תא עצירה תלת כיווניTerumoTS-TR1K01
מיכל עליון (חומר זכוכית אקרילית)Tokyo Scienceרכיב ציוד לחץבהתאמה אישית
, רכיב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
  3. Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
  4. Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
  5. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
  6. Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
  7. Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
  8. Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
  9. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
  10. Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
  11. Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
  12. Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
  13. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
  14. Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  15. Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
  16. Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
  17. Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
  18. Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
  19. Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
  20. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
  21. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
  22. Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
  23. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
  24. Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
  25. Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
  26. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
  27. Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
  28. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
  29. Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236(2015).
  31. Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
  32. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
  33. Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SMP30 Knockout

מאמרים קשורים