הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58327

⸱

1 בנובמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurobiology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 2Comparative Medicine Branch, National Institute of Environmental Health Sciences, 3Reproductive and Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

עכבר הביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן. מאמר זה מתאר עבור לנקב את zona עם לייזר כדי מגלי תאים עובריים עם וקטורים lentiviral וכדי ליצור העכברים הטרנסגניים פרוטוקול.

תקציר

Lentiviruses הם וקטורים יעיל למסירה גן בתרבית של תאים. בעקבות התמרה חושית, הגנום lentiviral stably הוא שולב כרומוזום המארח, מועברת אל רומא. לפיכך, הם וקטורים אידיאלי עבור יצירה של שורות תאים יציב, ויוו משלוח של אינדיקטורים, התמרה חושית של תא בודד מופרית ביצים כדי ליצור חיות מהונדס. עם זאת, העכבר מופרית ביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן lentiviral. Lentiviruses גדולים מדי כדי לחדור את סונה, מועברים בדרך כלל על ידי microinjection של נגיפים לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים. הדרישה לבעיותיהם מיומנים וציוד מיוחדים יש למזער את השימוש lentiviruses למסירה גן העוברים העכבר. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור permeabilizing את הביצים העכבר מופרית על ידי לנקב את zona עם לייזר. לייזר-ניקוב לא לגרום כל נזק עוברי ומאפשר lentiviruses לקבל גישה לתאים עובריים למסירה גן. Transduced עוברי ניתן להתפתח הבלסטוציסט במבחנה, אם שהושתלו בעכברים pseudopregnant, להתפתח הטרנסגניים הגורים. הלייזר בשימוש פרוטוקול זה הוא יעיל, קל לשימוש. הגנים מועברים על ידי lentiviruses stably לשלב תאים עובריים בעכבר, germline שעוברת ביחסי. זה שיטה חלופית עבור יצירה של העכברים הטרנסגניים הדורשת אין המיקרומניפולציה ו- microinjection של הביצים.

מבוא

בשיטה זו מספק הוראות מפורטות עבור permeabilizing את pellucida zona של העכבר מופרית ביצים כדי להפוך תאים עובריים לנגיש עבור המסירה הגן על-ידי lentiviruses. Lentiviruses תוכננו על ידי הטבע למסירה גן יעיל בתרבית של תאים. הם להדביק תאים החלוקה הלא-חלוקת ולשלב את הגנום lentiviral שלהם מארח כרומוזומים1. טווח התאים מארח lentiviral ברצון מורחבת מאת pseudotyping את lentivirus רקומביננטי עם גליקופרוטאין וירוס vesicular stomatitis (VSV-G), בשל tropism רחב של חלבון VSV-G2. בעקבות התמרה חושית, גנים lentiviral stably משולב, הביע כחלק בכרומוזומים המארח שלהם יצירת כלי אידיאלי ליצירת חיות מהונדס. אם תימסר לתאים עובריים בשלב מוקדם, הגנום lentiviral משוכפלת, שבאה לידי ביטוי בכל המנגנון. התמרה חושית lentiviral הוביל הייצור של עכברים, עכברושים, עוף, שליו, חזיר3,4,5,6,,7 , בין מינים אחרים של transgenics. השיטה טיפוסי של המסירה הגן lentiviral, עם זאת, דורשת טכנאים מיומנים וציוד מיוחדים כדי להתגבר על המכשול zona pellucida המכיל את העוברים בשלב מוקדם. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לתאר כיצד permeabilize את zona באמצעות לייזר כדי להקל על המסירה הגן lentiviral.

ביצים יונקים מוקפים את pellucida zona אשר מתקשה בעקבות הפריה להגן על הביצים מפני polyspermy וכדי להגביל את האינטראקציות סביבתיים8,9. Zona יוצרת מחסום שמונע lentiviruses מן התאים מתחלקים עד העוברים בוקעים כמו הבלסטוציסט. העכבר בתרבית מופרית ביצים הפתח לאחר 4 ימים, חייב להיות מושתלים לתוך עכברים pseudopregnant לפני הבקיעה להתפתחות הרגילה לתוך הגורים. לכן, עבור התמרה חושית, lentiviruses הן microinjected לפני הבקיעה מן zona לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים.

Pellucida zona יוסר לעיתים קרובות עבור הפריה במבחנה של ביצים אנושי כדי להגביר את קצב הפריה10. אולם, הסרת כימי של העכבר zona pellucida לרעה משפיעה על התפתחות העובר העכבר, מזיקה תאים עובריים11,12. שיטות נוספות המסירה הגן ביצים העכבר מופרית להתגבר על המכשול zona pellucida על ידי microinjection ישירה של ה-DNA לתוך גרעין התא13. Pronuclear microinjection הוא אמצעי יעיל של אספקת גנים העוברים. עם זאת, מאז כל העובר מתקיים במקום בנפרד עבור microinjection, התרגול ניתן מפרך וצורכת זמן למשתמש המתחיל.

שיטות אחרות כגון אלקטרופורציה photoporation שימושיים ארעי, המסירה הגן לטווח קצר העכבר מופרית ביצים14,15,16. שיטות אלה משמשים בהרחבה להעברת רכיבים CRISPR-Cas9 ו- recombinases. עם זאת, משלוח אלקטרופורציה ו- photoporation של גנים לא ניתן להשתמש ביעילות כדי ליצור transgenics. Spermatozoa הנאספות מן העכבר מנוקבת יותרת האשך יכול גם להיות transduced על ידי lentiviruses, שימוש עבור הפריה במבחנה להפקת חיות הטרנסגניים17,18,19, 20.

ב פרוטוקול זה, המסירה הגן lentiviral העכבר עוברי בהנחייתם permeabilizing את zona באמצעות לייזר. הלייזר XYClone פותחה ככלי סיוע עבור במבחנה הדישון21 וטיפוח של תאי גזע עובריים22. זה מנגנון קטן פשוט להתקנת וניתן קל לשימוש. פעם להתקין מיקרוסקופ, הנתפש המרחב של עדשת המטרה בתוכנה הנלווית מאפשר מכוון הלייזר תוך התבוננות דרך של עיניות מיקרוסקופ (ראה פרוטוקול: סעיף 3). ברגע סונה הוא מחורר על ידי לייזר XYClone, lentiviruses יכול להיות מוחדרים התקשורת תרבות עבור ג'ין משלוח23. ניתן להשתמש lentiviruses מרובים בו זמנית לספק מספר גנים של התאגדות כרומוזומלית.

פרוטוקול זה יתאר כיצד לבודד, תרבות העכבר מופרית ביצים, מדגים את השימוש בלייזר עבור ניקוב של pellucida zona, ממחישה את התמרה חושית של תאים עובריים בעכבר על-ידי lentiviruses.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים וטיפולים בשימוש פרוטוקול זה היו בהתאם להנחיות NIH/NIEHS טיפול בבעלי חיים, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה (ACUC) ב NIH/NIEHS, חיה פרוטוקול 2010-0004.

1. תכשירים

  1. להכין/רכישה של recombinant lentiviruses הפצת שאינו נושא את הגן עניין. במחקר זה, lentivirus SBI511 ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק שטרגליים (copGFP; מקוצר GFP) של התארכות פקטור 1a יזם שימש עבור התמרה חושית. פרוטוקולים סטנדרטיים2 שימשו כדי לייצר, כייל נוגדנים lentiviruses ב titers גבוה יותר 1e8 יחידות transducing mL (טו/mL).
    הערה: שימוש באזהרה, אקונומיקה כל חומר זה יצר קשר עם lentiviruses. עיין ההנחיות של המכון שלך שימוש בטוח וטיפול lentiviruses.
  2. ההתקנה זוגות של העכבר הרצוי זן יום לפני הקטיף עוברי. בניסוי זה, שימשה C57BL/6J זן של עכברים. לא טופלו עכברים הנשי משמש השחלות ואוסף oviduct עם כל ההורמונים עבור superovulation.
  3. 2 – 24 שעןת לפני הקטיף העכבר מופרית ביצים, להכין מספר בינוני ממוטב סימפלקס אשלגן24 (KSOM) ירידה צלחות כדלקמן: להוסיף טיפה 50 μL KSOM בינוני עד לאמצע 35 מ מ שטופלו תרביות רקמה צלחת ומכסים עם 2 מיליליטר Dimethylpolysiloxane (DMPS5X), במקום 37 oC, 5% CO2, 5% O2 ו 90% N2 כדי equilibrate.
    הערה: השתמש צלחות פלאסטיק חד פעמי סטרילי וזורקים בעקבות החשיפה lentiviruses.
  4. להכין x 1, תמיסת hyaluronidase M2 בינוני מהפתרון מניות (100 x, 30 מ"ג/מ"ל, לאחסן ב-20 ° C). 100 x פתרון מניות הוכן במים.
  5. h 24 שעות ביממה פוסט לייזר בסיוע התמרה חושית של העכבר מופרית ביצים, להגדיר זוגות בין עיקור עכברים זכר ונקבה להכין עכברים הנשי pseudopregnant.

2. בידוד של העכבר מופרית ביצים

  1. 16-24 h פוסט ההזדווגות, בחרו עכברים נקבה עם מעידה על הזדווגות מוצלחת מהנרתיק פקקים, בצורה הומאנית המתת חסד25. העכברים השתמשו במחקר זה היו מורדמים מאת נקע בצוואר הרחם תחת עמוק CO2 או איזופלוריין באינהלציה.
  2. לבודד את השחלות, oviducts על פי פרוטוקולים סטנדרטיים25.
  3. העבר את השחלות ואת oviducts תבשיל 35 מ מ המכיל M2 מדיה.
  4. עבור כל השחלה, דמעה ampulla לגזרים לשחרר את הביצים מוקף תאים קומולוס.
  5. להעביר את הביצים, תלולית לתאים 35 מ מ מאכל המכיל hyaluronidase x 1 בינוני M2 דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
  6. Pipet מופרית ביצים למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים קומולוס.
  7. העברת הביצים תבשיל 35 מ מ המכיל pipet למעלה ולמטה כדי לשטוף hyaluronidase ומדיה M2.
  8. העברת הביצים תבשיל 35 מ מ המכילות KSOM ואת pipet למעלה ולמטה כדי לשטוף את המדיה M2 הנותרים ואת hyaluronidase.
  9. העברת הביצים הלוחות טיפה KSOM מוכן מהשלב 1.3.
    הערה: העכבר מופרית ביצים KSOM חייב להישמר בתוך חממה תרביות רקמה של 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 ו 90% N2 כדי equilibrate. הסרת לוחות החממה יותר מ 15 דקות לגרום לנזק עוברי.
  10. לאפשר הביצים להתאושש במשך 2 h בחממה לפני המעבר לשלב הבא.

3. ניקוב של העכבר מופרית ביצים עם לייזר XYClone

  1. התקנה, לכייל XYClone לייזר על-פי ההמלצה של היצרן. . הרבה לייזרים אחרים, משמש בדרך כלל עבור הפריה במבחנה , XYClone לייזר ניקבה את הביצים.
    1. לצרף את החוט תיבת לייזר בקר המנגנון לייזר על המיקרוסקופ.
    2. לצרף את תיבת בקר לייזר למחשב שבו פועל התוכנה לייזר דרך יציאת USB. 3.1.3. הכנס את בקר לייזר, הפעילו את זה.
    3. מחפש דרך העיינית של המצלמה, לנקב מדגם הבדיקה (למשל מחיקה יבש סימונים על משטח זכוכית).
    4. להשתמש הנהג בורג קטן (כלול בערכה לייזר) כדי להתאים את ה-X ואת Y המיקום של הלייזר כדי להתאים את ה-LED אור נראה דרך העיינית של המצלמה מיקרוסקופ לכייל את הלייזר.
  2. מניחים צלחת טיפה KSOM המכילים ביצים העכבר מופרית על הבמה מיקרוסקופ. אל תשמור את הצלחת מחוץ החממה יותר מ 15 דקות.
  3. להסתכל דרך העינית מיקרוסקופ ולהבטיח כי zona pellucida של העובר נמצא המוקד והיא הלייזר נורית LED הוא גלוי.
  4. הזז את הבמה מיקרוסקופ כדי למקד את zona עם LED האור/הלייזר.
  5. שימוש בתוכנת מחשב מוגדר XYClone לייזר 250 μs.
  6. להתאים את גודל אור LED לממדים הרצויים (הגדרת 5 בניסוי זה).
  7. לנקב את zona של הביצית המופרית כל שלוש פעמים עם הלייזר. Zona יכול להיות או פירסינג או מדולל. באמצעות ההגדרות לעיל, הלייזר יהיה לייצר חור בקוטר של 10 μm (איור 2).
    הערה: כיוון הגופה קוטב שומר לייזר מן התא העוברי.
  8. לאפשר הביצים להתאושש במשך 2 h בחממה תרביות רקמה לפני המעבר לשלב הבא.

4. התמרה חושית של העכבר מופרית ביצים בעקבות ניקוב לייזר XYClone

  1. Pipet 2 μL של lentivirus מרוכז (גדול מ 1e8 TU/mL כייל נוגדנים) לתוך הירידה KSOM 50 μL. לא pipet למעלה ולמטה. הביצים בקלות לצרף הטיפ pipet. על סמך הניסיון שלנו, 1e5-5e5 יחידות transducing של lentivirus של אמצעי אחסון פחות מ 3 μL הוא אופטימלי המסירה הגן.
  2. לאפשר הביצים להתפתח הבלסטוציסט ארבעה ימים בחממה. אין צורך לשנות את התקשורת.

5. ניתוחי העברת העכבר Transduced עוברי עכברים מדומים בהריון

  1. השתמש עכברים pseudopregnant, 3.5 יום לאחר ההזדווגות, מוכן בשלב 1.5.
  2. להשתמש בהתקן להעביר עובר שאינו כירורגי (NSET) כדי להשתיל עוברי העכבר לתוך עכברים pseudopregnant.
    1. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי או ויבתר, הכנס עם ספקולום וגינלי להמחיש את צוואר הרחם.
    2. הכנס את המכשיר להעביר עובר שאינו כירורגי (NSET) כ 5 מ מ העוברים צוואר הרחם ואת הפיקדון באמצעי אחסון כ- 2 μL.
      הערה: התקן NSET סטרילי המשמש עבור כל העברה, יימחקו לאחר ההליך. כל ריאגנטים בשימוש המניפולציה של העוברים חייב להיות סטרילי.
  3. להעביר 10 – 15 בריא הבלסטוציסט μL 2, ףקיהב KSOM כל העכברים pseudopregnant.
  4. להמשיך לעקוב ולמדוד את העלייה במשקל בעכברים pseudopregnant בימים הבאים כדי לקבוע NSET הצליחה.
  5. לשחזר הגורים מאת ומאפשר העכברים בהריון ללדת באופן טבעי או ביצוע של ניתוח קיסרי 17 ימים אחרי העובר להעביר26. ניתוח קיסרי נחוץ לעיתים קרובות אם העוברים מעט מאוד נוכחים, הם גדלים גדול מדי עבור לידה טבעית.
  6. לאסוף רקמות הגורים עבור genotyping לקבוע שיעור transgenesis27.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פיתוח של ביצים מבודד/transduced העכבר מופרית ניתן לבדוק תחת מיקרוסקופ מדי יום (איור 1). העוברים בריאים להתפתח הבלסטוציסט תוך 3-4 ימים. ב פרוטוקול זה, 60-70% ללא טיפול עוברי להתפתח הבלסטוציסט23. מתוך 114 מחורר בלייזר transduced עוברי 54 התפתחה הבלסטוציסט (שיעור של 47%) 46 blastocysts והביע GFP (46/54 = 85%)23.

העוברים העכבר היו מחורר בלייזר ביום של קציר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היכולת של lentiviruses שילוב לתוך הגנום המארח שלהם גורם להם וקטור אידיאלי עבור המסירה הגן יציב. וקטורים lentiviral יכול לשאת kilobase עד 8.5 זוג (kbp) של חומר גנטי שיכול להכיל תאים ספציפיים או inducible היזמים, סמני הבחירה או moieties פלורסנט. החומר הגנומי incorporated יכולים לשכפל כחלק הגנום המארח שלהם, להיות מוסדרות כדי להביע או לבטל בנקודות הזמן הרצויים. וקטורים אלה מאפשרים שליטה ייתכן על ביטוי גנים בשלבים שונים של פיתוח, lentiviruses מותג כמו כלים רבי-עוצמה המסירה הגן.

לייזר בסיוע transgen...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מגזר תוכנית המחקר של המכון הלאומי לבריאות (NIH), לאומי המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS). . אנחנו אסירי תודה ד ר רוברט פטרוביץ, ד ר ג'ייסון ויליאמס על קריאה ביקורתית של כתב היד, עצות מועילות. אנחנו רוצים גם להכיר ולהודות ד ר ברנד מבריק, הליבה נוקאאוט, המתקן Cytometry זרימה, מיקרוסקופיה של זריחה, מרכז הדמיה ובמתקני ענף רפואה השוואתית NIEHS על תרומתם טכני. ברצוננו להודות מר דוד גולדינג מהענף רפואה השוואתית, גב' לויס Wyrick של מרכז הדמיה ב NIEHS סיפק לנו תצלומים ואיורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CD510B-1 מערכת פלסמידBiosciencesCD510B-1המשמש לאריזת וירוס הלנטי המבטא EF1a-copGFP
דימתילפוליסילוקסןסיגמאDMPS5Xעוברים מתרבות
היאלורונידאזסיגמאH3506המשמש להסרת תאי קומולוס
XYClone לייזרהמילטון ת'ורן ביוסיינססניקוב ביציות
מופרות עכבריםמכשיר העברת עוברים לא כירורגי (NSET)ParaTechs60010NSET של עוברים
<חזקים>KSOM בינוניMilliporeMR-020P-5Fעוברי תרבית
<חזקים>הרכב של KSOM:<חזק>מ"ג/100 מ"ל
NaCl555
KCl18.5
KH2PO44.75
MgSO4 7H2O4.95
CaCl2 2H2O25
NaHCO3210
גלוקוז3.6
Na-Pyruvate2.2
DL-חומצה לקטית, מלח0.174 מ"ל
10 מ"מ EDTA100&מיקרו; L
סטרפטומיצין5
פניצילין6.3
0.5% פנול אדום0.1 מ"ל
L-גלוטמין14.6
MEM חומצות1 מ"ל
MEM לא חיוני AA0.5 מ"ל
BSA100
<חזק>M2 בינוניMilliporeMR-015-Dעוברי תרבית
<חזקים>הרכב M2:<חזק>מ"ג/100 מ"ל
סידן כלוריחזק 25.1
מגנזיום גופרתי (נטול מים)16.5
אשלגן כלורי35.6
אשלגן פוספט, מונוביסיק16.2
נתרן ביקרבונט35
נתרן כלורי553.2
אלבומין, חלק400
D-גלוקוז100
ו-HEPES54.3
פנול אדום1.1
חומצה3.6
DL-חומצה295
נתרן אמינו חיוניות בקר פירובית לקטית

מקורות

  1. Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
  2. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
  3. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  4. Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
  5. McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26(2010).
  6. Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335(2012).
  7. Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817(2012).
  8. Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
  9. Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
  10. Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
  11. Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
  12. Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
  13. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  14. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382(2014).
  15. Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677(2011).
  16. Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513(2014).
  17. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  18. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
  19. Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
  20. Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
  21. Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892(2014).
  22. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20(2006).
  23. Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
  24. Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
  25. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
  26. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
  27. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  28. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
  29. Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
  30. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ניקוב לייזרזונה פלוצידהיצירת עכבר טרנסגניבידוד עובריתווך KSOMלייזר XYCloneהתפתחות בלאסטוציסטהעברה בקו הנבט
המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.