הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אנליזה מרחבית של תזרים שדות במיקרוvasקובלטורה

5.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60493

⸱

18 בנובמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

במאמר זה

סיכום

כדי לכמת את זרימת מיקרונימי הדם ממהירות גבוהה מהירות רצף נימי תמונה, פיתחנו צוות (ניתוח זמני מרחבי של זרימת שפילד) תוכנה. מעבר לשדה התמונה המלא ולאורך הזמן, הצוות מעריך מהירויות זרימה ומייצר רצף של מפות מרחבית בצבע לצורך הדמיה ותפוקה טבלאית עבור ניתוחים כמותיים.

תקציר

שינויים במהירות זרימת הדם והפצה חיוניים לשמירה על רקמות ואיברים בתגובה לצרכים סלולריים שונים. עוד, המראה של פגמים במיקרו מחזור יכול להיות מחוון העיקרי בפיתוח של פתווגיות מרובות. ההתקדמות בהדמיה אופטית הפכה את מיקרוסקופ הטרטל (IVM) לגישה מעשית, המתיר הדמיה ברמה התאית והתאית בבעלי חיים במהירות גבוהה לאורך זמן. ובכל זאת, למרות החשיבות של שמירה על הרקמה הנאותה, השונות המרחבית והטמפורלית בזרימה קפילר מתועדת לעיתים רחוקות. בגישה הסטנדרטית, מספר קטן של מגזרי נימים נבחרים להדמיה במשך זמן מוגבל. כדי לכמת באופן מקיף את זרימת נימי בצורה בלתי משוחדת פיתחנו בניתוח זמני מרחבי של שפילד תזרים (צוות), מאקרו עבור תוכנות הקוד הפתוח של פיג'י תוכנת ניתוח. באמצעות רצפי תמונות במהירות גבוהה של שדות מלאים של זרימת הדם בתוך נימים, צוות מייצרת תמונות המייצגות תנועה לאורך זמן הנקרא kymographs עבור כל מרווח זמן עבור כל פלח כלי דם. מצוות kymographs מחשבת המהירויות ממרחק כי בתאי הדם האדומים לנוע עם הזמן, והתפוקות את נתוני המהירות כרצף של מפות מרחבי צבע מקודד עבור ויזואליזציה ופלט טבלאי עבור ניתוחים כמותיים. בתוך כבדי העכבר הרגילים, הצוות מנתח את ההבדלים העמוקים במהירות הזרימה בין אזורי כלקרום הלב והשער הפנימי שבתוך הלובולים. אפילו יותר בלתי צפוי הם ההבדלים מהירות הזרימה לראות בין sinusoids כי הם בצד ותנודות לראות בתוך מגזרים בודדים כלי הדם לאורך שניות. הצוות הינו כלי חדש ורב עוצמה המסוגל לספק תובנות על ידי הפעלת הדינמיקה הטמפורלית המורכבת של זרימת קפילר.

מבוא

המיקרוקובלטורה ממלא תפקיד קריטי בפיזיולוגיה, ומבטיח הפריה אפקטיבית של רקמות בתנאים שמשתנים. מיקרוכלי דם תפקוד מיקרו משויך תנאים רבים כולל תחלואה וכלי דם לטווח ארוך ותמותה, פיתוח של דמנציה, ומחלות של הכבד והן הכליות ולכן הוא גורם מפתח של עניין במגוון רחב של חקירות ביו1,2,3,4,5. בעוד טכניקות מרובות נעשה שימוש כדי להעריך את הפרזיה רקמות, רק מיקרוסקופ intravital מאפשר איסוף נתונים בזמן וברזולוציה מרחבית הדרושים כדי לאפיין את זרימת הדם ברמה של נימים בודדים.

זרימה מיקרוכלי דם ניתן לדמיין במיקרוסקופיה פלואורסצנטית או על ידי התנועה של מיקרוספירות פלורסנט או על ידי התנועה של כדוריות הדם האדומות נגד הרקע של ממברנה-ציוויים סמנים פלורסנט (g., כגון תוספי התווית או אלבומין)6,7. ניתן לעשות שימוש בזרימה מיקרוסקולרית בשכבות תא שטחיות בעזרת מיקרוסקופ שטח, או לעומק באמצעות מיקרוסקופ מרובה או מיקרופוטון. עם זאת, שיעורי זרימת נימי הם כאלה כי מעבר של כדוריות הדם האדומות לא ניתן בדרך כלל להילכד במהירויות פחות מ 60 מסגרות/s. מאז ביותר בדיקת מיקוד לייזר מיקרוסקופ multiphoton דורשים 1 – 5 s כדי לסרוק את שדה התמונה מלא, מהירות זו יכולה בדרך כלל רק על ידי הגבלת שדה התצוגה, לפעמים קו סריקה אחת8. התהליך של הגבלת מדידות לפלחי נימים נבחרים (1) יש את הפוטנציאל להציג הטיית בחירה ו-2) מאפשר ללכוד את הטרוגניות המרחבי והזמני בשיעורי זרימת הדם נימי. לעומת זאת, תמונות של רשתות קפילר ניתן לאסוף במהירויות יעלה 100 fps באמצעות מיקרוסקופים דיגיטלית רחבת שדה מצויד מדעי מוליך למחצהמדעית תחמוצת מתכת (scmos)מצלמות 9,10. אלה מערכות זולות, נפוץ במעבדות ביו-רפואית טיפוסי לאפשר להזרים מיקרונימי התמונה על פני רשתות דו ממדיות שלמות, למעשה ברציפות. הבעיה אז הופך להיות אחד מציאת גישת ניתוח כי הוא מסוגל לחלץ נתונים כמותיים משמעותיים מתוך נתוני תמונה מסיבית ומורכבת שנוצרו על ידי מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה.

כדי לאפשר ניתוח של נתוני זרימה בשדה מלא פיתחנו צוות, ניתוח תמונה הרומן תוכנה שיכולה ברציפות למדוד זרימה מיקרוכלי דם בכל שדות מיקרוסקופ שלמים של סדרת תמונות שנאספו במהירות גבוהה11. הגישה מתאימה למגוון של מערכות נסיוניות ושיטות דימות שונות, ותוכנת ניתוח התמונה של הצוות מיושמת ככלי מאקרו המוגדר עבור הטמעת ה-פיג'י של ImageJ12. העיקרון הבסיסי המשמש כאן כדי להמחיש זרימה מיקרוכלי דם היא כי הראשון, יש לספק כמה ניגודיות כדי להיות מסוגל לדמות את כדוריות הדם האדומות בתוך נימים. במחקרים שלנו, ניגודיות מסופק על ידי בדיקה פלורסנט בתפזורת כי הוא נשלל על ידי כדוריות הדם האדומות. מהירות הזרימה יכול להיות לאחר מכן לכמת מן העקירה של כדוריות הדם האדומות המופיעות ככתם שלילי בתוך הפלזמה המסומן באמצעות פלואורוסקופים בתמונות שנאספו במהירות גבוהה מחיה חי8. לאחר מכן אנו משתמשים בצוות כדי ליצור חלקות של מרחק לאורך כל קטע נימי על מרווחי זמן מרובים הנקראים kymographs, לאחר מכן לזהות את המדרונות הנמצאים kymographs13, וממדרונות אלה לחשב את שיעורי הזרימה microvascular. הגישה ניתן להחיל על תמונות שנאספו מכל מיטה נימי כי ניתן לגשת להדמיה. כאן אנו מתארים את היישום של IVM ואת הצוות למחקרים של זרימת הדם בכבד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויי בעלי החיים אושרו ונערכו על פי הנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשתמש בהנחיות של אוניברסיטת אינדיאנה, והוא דבק במדריך NRC לטיפול ולשימוש בבעלי חיים.

1. הכנה כירורגית למיקרוסקופיה

הערה: . זה לא ניתוח הישרדות פעם בסעיף 1 "הכנה כירורגית למיקרוסקופיה" מתחילה, לא ניתן להשהות את העבודה עד להשלמת סעיף 2 "מיקרוסקופ אינטרטל".

  1. האקזה 9 – 10 גבר בן C57BL/6 עכברים, לפחות 4 ימים ומהר עבור 16 h לפני הלימודים.
  2. שוקלים את החיה, תרופת הרגעה עם 5%. מקום על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף השתמש בקצב זרימת חמצן של 1 – 2 L/min ולשמור על הרגעה עם 1-2% isofלוריאן. בדוק רפלקסים על ידי צביטה בבוהן. לעקוב אחר טמפרטורה באמצעות מד חום רקטלי. הצג קצב פעימות לב ונשימה חזותית.
  3. כאשר הרדמה יציבה, לגלח את האזור מיקום צינורית הצוואר ואת האזור מתחת לכלוב הצלעות לחשיפת הכבד.
  4. לצינורית עורק הצוואר, לעשות 1 ס מ החתך הגחוני השמאלי 1 – 2 ס מ מתחת ללסת של העכבר. לנקות את כל השומן והfascia סביב וריד הצוואר. לקשור את הקצה הקדמי של ווריד הצוואר באמצעות מחרוזת תפר 06 כדי למנוע דימום.
    1. לעשות ניק זעיר בווריד העורק ולהחליק את הצינורית (30 G x 1/2 ב, מחט), מחזיק המחט וצינורות פוליאתילן (0.011 x 0.024 אינצ'ים2 מצורף מתאם Stub luer ו מלא עם 0.9% מלוחים) בערך 1 ס מ, ומאובטח בקצה האחורי של וריד הצוואר באמצעות מחרוזת תפר 0-6.
  5. באמצעות צינורית עורק הצוואר לספק 70 kda fluorescein תוספי (למינון של 30 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה של 0.1 mL של 9 מ"ג/mL תמיסת מלח).
  6. לחשוף את הכבד לדימות על ידי ביצוע חתך של 4 – 6 ס"מ על פני הגוף, 1 – 2 ס מ מתחת לאמצע של כלוב הצלעות.
  7. המקום רטוב (ספוגה ב 0.9% מלוחים) 2 x 2 אינצ'ים2 ספוג גזה מתחת לאונה השמאלית של הכבד הרוחבי. הקלטת מקום על הפריפריה של חלון הזכוכית של צלחת 40 מ"מ coverslip ולהחיל דבק ציאנואקרילי לקלטת. לחץ על הצלחת זכוכית לכבד באמצעות כותנה מכשיר המוליך ללחוץ גזה לתוך הדבק על הקלטת כדי למזער את תנועת הרקמה עבור מיקרוסקופ.
  8. להעביר חיה לשלב המיקרוסקופ. הוסף סטרילי 0.9% תמיסת מלח לתוך הצלחת התחתית coverslip כדי לשמור על הכבד לח לאורך המפגש הדמיה. שמרו על טמפרטורה של 36 – 37 ° צ' באמצעות משטחי חימום הנטענים על הבמה, משטח חימום הממוקם על החיה ומחמם אובייקטיבי.

2. מיקרוסקופ אינטרטל

  1. לבצע מיקרוסקופ הפוך על המיקרוסקופ epiפלואורסצנטית הפוכה מצויד מצלמת וידאו מסוגל לכידת תמונה במהירות גבוהה.
    הערה: כאן, מנורת קשת קסנון, fluorescein מסוים עירור (480 – 500 ננומטר) ופליטה (507 – 543 nm) מסננים, תוכנית Fluor 20 x, N.A. 0.75 מים המטרה טבילה, ו מצלמה במהירות גבוהה sCMOS שימשו.
  2. בחר את אזור העניין עבור ניתוח זרימת דם קפילר באמצעות תאורה מינימלית.
  3. הגדר את זמן החשיפה קצר מספיק עבור המצלמה כדי להיות מסוגל לרכוש 100 fps. הגדר את רמת התאורה כדי להמחיש בבהירות את הצללים של תא דם אדום ואת הטופולוגיה של ואצלב תוך הימנעות פוטורעילות והלבנת של לווין פלורסנט.
  4. לאסוף תמונות בקצב של 100 fps. הגדר את רזולוציית הפיקסל של המצלמה בין ~ 0.65 ו-~ 1.3 μm/פיקסל. הגדר גודל מסגרת בין 512 x 512 ו 1024 x 1024 פיקסלים. קבע עומק סיביות בין 8 ל-16 סיביות. השתמש ברזולוציה הגבוהה ביותר, גודל המסגרת ועומק הסיביות שעדיין מאפשר 100 fps אוסף תמונות במערכת.
  5. שמור קובץ סדרת זמן (s) כרצף של קבצי TIF או כמו מצלמה מקורית/בפורמט מיקרוסקופ אם Bio-פורמטים14 בפיג יכול לפתוח את הקבצים בפורמט יליד.
  6. תמונה באזורים מרובים לאורך זמן. לשמור על העכבר על הבמה במיקרוסקופ עד 2 h. המתת חסד העכבר בסוף הדמיה.
    הערה: משך סדרת הזמן יהיה מבוסס על איזון הצורך בתמונה עבור מרווח זמן המחבק את השונות, בעוד לא להשפיע על הכדאיות של הרקמה. המשך של סידרת הזמן עשוי גם להיות מוכתב על-ידי שיקולים של גודל קובץ; סדרה של 1 דקות זמן של 1024 x 1024 פיקסל 16-bit תמונות שנאספו ב 100 fps יפיק קובץ שהוא 12 GB בגודל. שיקולים של גודל קובץ עשויים גם להכתיב גודל מסגרת ועומק סיביות בשימוש. אין מגבלות גודל מפורשות בתוך צוות.

3. להגדיר את רשת כלי הדם באמצעות TrakEM2 בפיג

הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר שמירת העבודה בכל נקודה שהיא בסעיף 3.

  1. הורד והתקן פיג'י מ-https://imagej.net/Fiji/Downloads.
    הערה: גירסה 1.51 n של פיג'י שימש עבור פרוייקט זה, וניתן להורידו מ-https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. שים לב כי ב-Windows, יש להתקין את פיג'י במרחב המשתמש ולא בקבצי תוכניות.
  2. פתח את קובץ הסרט בפיג באמצעות קובץ > פתיחה או שימוש בקובץ > ייבוא > רצףתמונות. בחרו תמונה בודדת מהתמונות היציבות בין התמונות שבהן קל לראות את הטופולוגיה של רשת כלי הדם. בחר ' תמונה ' > שכפל ושכפל את התמונה הבודדת שנבחרה (לא את המחסנית) ושמור את התמונה בתיקיה חדשה. אל תכלול רווחים בשמות קבצים או תיקיות.
  3. הגדר פרוייקט TrakEM2 ריק חדש על-ידי בחירת קובץ > חדש > TrakEM2 (ריק). בחר את התיקיה החדשה המכילה את התמונה הבודדת מהסרט כתיקיית הפרוייקט. חלונות הTrakEM2 יפתחו.
  4. לחצו לחיצה ימנית באזור העבודה הראשי ובחרו ' יבא > ייבוא תמונה'. נווטו לתמונה הבודדת שנשמרה בשלב 3.3 ובחרו בה.
  5. לחצו לחיצה ימנית באזור העבודה הראשי שוב ובחרו ' הצג > שינוי גודל בד ציור/ערכת שכבות '. לחץ שמאלה בחלון העבודה הראשי. התמונה תמלא את אזור העבודה.
  6. כדי לבחור את האזורים בתמונה המכילים את הרשת של כלי הדם, בחירת רשימת הגדרות אזור ההתקנה ב-TrakEM2. בחלון TrakEM2 קטן יותר (תבנית, אובייקטים של פרוייקט, שכבות) לחץ לחיצה ימנית על "• כל דבר". בחר בהוסף רשימת אזורי> צאצא חדשה.
  7. בחלון TrakEM2 קטן יותר, גרור "תבנית > כל דבר" אל "אובייקטי פרוייקט > פרוייקט". לאחר מכן גרור "תבנית > כל דבר > • רשימת אזורים" אל "אובייקטי פרוייקט > פרוייקט > דבר". תחת "אובייקטי פרוייקט > פרוייקט > כלום", רשימת האזורים יהיו נוכחים כעת.
  8. בחלון TrakEM2 הראשי תחת הכרטיסיה מרחב Z, נוצרה רשימת אזורים בעלי תווית עמודה. לחץ כדי לבחור בו. בחלון TrakEM2 הראשי בחר גם בכלי מברשת צבע. הקש Shift וגלגל את גלגל העכבר כדי לבחור גודל מתאים עבור מברשת הצבע, לדוגמה, קטן יותר מקוטר הכלי. כדי לשמור את בקרת הTrakEM2 לעיתונות + S מפתחות.
  9. צבעו את רשת כלי הדם בעזרת הכלי מברשת צבע. כדי למחוק הקישו Alt תוך שימוש בכלי מברשת צבע. אין לכלול אזורים מחוץ לפוקוס. שמור לעתים קרובות באמצעות Control + S.
  10. כאשר התוויות של הרשת כלי הדם הושלמה, לחץ לחיצה ימנית בחלון TrakEM2 הראשי ובחר ייצוא ≫ אריאליסטים כתוויות (tif). בחלון המוקפץ בחר את קנה המידה 100% וייצא את כל רשימת האזורים. סגור חלונות TrakEM2 ובחר כן לשמירת הפרוייקט.
  11. דמותה של האריאליסטים תיפתח ועשויה להופיע כתמונה שחורה ריקה. בתפריט הראשי של פיג'י, בחר בתמונה > התאים > בהירות/ניגודיות. בחלון B & C לחץ על לחצן אוטומטי והארבליסט יהפוך לגלוי. בתפריט הראשי של פיג ' י בחר בתמונה > טבלאות בדיקת מ> היפוך lut. שמור תמונה זו של תוויות שחורות על רקע לבן וסגור את התמונה.
  12. פתח את קובץ התוויות בפיג. בחר תוספים > שלד > ששלד. שמור את התמונה השלד כטיף. . השתמש בשלד הקובץ tif כאחד מקבצי הקלט הדרושים להפעלת ניתוח זרימת הצוות. בעת שמירת הקובץ, אל תשתמש ברווחים בשם הקובץ.
  13. ערוך באופן ידני את קובץ השלד בהתאם לצורך, על-ידי הצבת פער (באמצעות הכלי צבע) בציור הקו לדוגמה, במיקומים שבהם הסניפים בתוך היישום לא נלכדו, מכיוון שהם יוצאים ממישור התמונה.

4. הכן את רצף הסרטים לניתוח סגל

  1. פתח את קובץ הסרט בפיג באמצעות קובץ > פתוח או קובץ > ייבוא > רצף תמונות. בחרו תקופת זמן של רצף התמונות לניתוח זרימה (יכולות להיות שניות לדקות, מאות לעשרות אלפי מסגרות), בהן מיקום הרקמה נשאר יציב לאורך זמן, למעט במהלך הנשימה.
  2. בחר תמונה ≫ שכפל ושכפל את החלק שנבחר ברצף על-ידי הקלדה במספרים של מסגרות ההתחלה והסיום. בדוק את מרחבי התמונה וכיול זמני תחת מאפייני תמונה > ותקן במידת הצורך. שמור את קובץ התמונה כ-TIF (או כAVI לא דחוסה). . הסרט הזה tif דרוש כקובץ קלט להפעלת ניתוח צוות. אל תכלול רווחים בשם הקובץ.

5. התקנת מאקרו של צוות בפיג

הערה: (חשוב) תיקיות מרובות בתוך ספריות המשנה של התיקיות של פיג'י יש שמות קבצים דומים, חלק באותיות גדולות, חלק לא. ודא שהתיקיות הנכונות נבחרות בעת התקנת צוות.

  1. הורד את פקודות המאקרו של הצוות מ-https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
  2. כדי להתקין, פתח תחילה את תיקיית ה-פיג'י.
    1. ב-Windows מצא את התיקיה בה מותקנת פיג'י במרחב המשתמש, הנפוץ ביותר בשולחן העבודה. ב-MacOS מצא את הסמל של פיג'י בתיקייה יישומים, לחץ לחיצה ימנית ובחר פתח.
  3. בתיקיה פיג'י, פתח את תיקיית התוספים. בתוך תיקיית התוספים, פתח את התיקיה ' פקודות מאקרו '. העתק צוות. ijm לתוך תיקיה זו של פקודות מאקרו: השתמש בפקודה.
  4. בתיקיה פיג'י, פתח את תיקיית התוספים. העתק STAFF_Dir. jar לתוך תיקיית התוספים הזאת: Fiji\plugins\ STAFF_Dir. jar.
  5. בתיקיה פיג'י, פתח את תיקיית פקודות המאקרו. בתוך תיקיה זו של פקודות מאקרו, פתח את תיקיית ההפעלה האוטומטית. העתק STAFF_Loader. ijm לתוך תיקיית ההפעלה האוטומטית הזאת: Fiji\macros\AutoRun\ STAFF_Loader. ijm.
  6. הפעל את פיג'י וודא התקנת מאקרו. כדי לאמת את ההתקנה, בחר באפשרות תוספים > פקודות מאקרו. כאשר מותקן כראוי את התפריט הנפתח יכלול: פתח-ליצור פרוייקט, שלד לנתח, לערוך מרווחי זמן, לנתח זרימה ולייצר מפה מרחבית.
  7. אם פקודות אלה אינן קיימות בתפריט ' פקודות מאקרו ', בחר באפשרות תוספים > פקודות מאקרו > התקן, פתח את התיקיה fiji\ps\usns, בחר בקובץ. ijm ולאחר מכן לחץ על לחצן אישור . הפקודות אמורות להופיע כעת בתפריט התוספים > פקודות מאקרו .

6. לכמת את זרימת כלי הדם באמצעות צוות

  1. צור פרוייקט חדש.
    1. בחר בתוספים > פקודות מאקרו > פתח את Project ועקוב אחר ההנחיות כדי ליצור או לעדכן קובץ תצורה.
    2. בתפריט ' פתח את פרוייקט ', נווט אל ובחר את מדריך הכתובות של project, את תיקיית קובץ הקלט ואת קבצי הקלט הסרט.. טיף ושלד. טיף ערוך את שמות קבצי הפלט המיושבים באופן אוטומטי אם יש צורך בכך.
    3. ערכי קלט עבור אורך הקטע הקצר ביותר (20 μm), מהירות מקסימלית נמדדת (2,000 μm/s) ומהירות מקסימלית ממופה (1,000 μm/s).
      הערה: התוצר של אורך הקטע הקצר ביותר ומסגרות לשנייה מעניקה את מהירות הזרימה המרבית שניתן תיאורטית למדוד. מהירויות זרימת הקפילר הגבוהה ביותר שדווחו בספרות הן סביב 2,000 μm/s15. בכבד, הבחנו כי זרימת נימי מהירויות ממוצעים בדרך כלל סביב 300 μm/s ולעתים רחוקות חריגה 1,000 μm/s.
    4. הקלידו את הערכים בגודל פיקסל וקצב מסגרות לרצף התמונות (ממטא-נתונים של תמונה או מהערות נסיוניות). ערכים אלה מחייבים קלט מהמשתמש. בדוק את תיבת תיקון הבהוב אם לתמונות יש הבהוב בעוצמת הרקע המחזורית.
    5. בחר פרמטרים עבור ההדמיה הטובה ביותר של הנתונים. בחר מהירות מרבית הממופה כדי לכלול כ-95% מהנתונים כך שהנתונים ימופו לאורך הטווח המלא של סרגל הצבעים. צוות מפות במהירות גבוהה החוצה לקצה במהירות גבוהה של סולם הצבעים.
  2. . לנתח את השלד
    1. בחר תוספים > פקודות מאקרו > לנתח שלד. . השלד קובץ tif ייפתח ומנהל אזור הריבית (ROI) ייפתח ויפעל.
      הערה: שלד לנתח מסווג כל פיקסל על ידי מספר השכנים שלה כמו בנקודת קצה, בצומת, או בתוך קטע. עבור כל פלח מספר מזהה (מספר ID), אורך ענף מכויל והקואורדינטות המרחבית של קצות ההסתעפות נרשמות.
    2. המתן להופעת מזהי מקטע בשלד, רשימת הפלחים תופיע במנהל הROI, ומוקפץ המציין שקובץ ה-ROI Manager עבור השלד נשמר. לחץ על אישור.
    3. לוודא כי בין תנועות נשימה, השלד נשאר על המקום שבו כדוריות הדם האדומות לעבור דרך נימי (למשל, לא את הקצה ולא מחוץ לנימים). הצג את המקטעים המסומנים ככיסוי בסרט, על-ידי פתיחת קובץ הסרט ולאחר מכן גרירת קובץ ה-zip של ROI אל הסרט הפתוח. הפעל את הסרט עם המקטעים המצופים.
  3. בחר מרווחי זמן.
    1. בחר תוספים > פקודות מאקרו > בחר מרווחיזמן. המתן בזמן שהמאקרו יוצר kymograph ממקטע אחד במשך הזמן הכולל עבור הסרט. מתוך kymograph זה, המשתמש בוחר מרווחי זמן לניתוח. השתמש בבקרה + + מפתחות כדי להגדיל את הגודל של kymograph במידת הצורך.
    2. הכלי בחירת המלבן מופעל באופן אוטומטי. צייר מלבן מסביב לכל מרווח זמן. נקודת התחלה טובה עבור אורך מרווח זמן הוא 1-2 מרווח בין הנשימות, אשר גלויים כאזורים מטושטשים אופקיים ב-kymograph.
    3. לחץ על מקש T או על הלחצן הוסף במנהל הROI כדי להקליט בחירות של מרווחי זמן. חזור על הפעולה עבור מרווחי זמן רבים ככל הנדרש. בצע בחירות ברצף מלמעלה (או משמאל) לתחתית (או ימינה) של kymograph.
    4. הערכת אפשרויות של פרמטרים (מתוך פרוייקט פתוח-יצירה) על-ידי בחירה במספר קטן של מרווחי זמן (3 עד 4) והשלמת ניתוח עבור מרווחים אלה בלבד, מאחר שניתוח זרימה (השלב הבא) יכול להימשך שעות עבור ערכות נתונים גדולות.
    5. לחץ על אישור ב הפוך ROI עבור כל חלון מרווח זמן כאשר תסיים. חלון מוקפץ מופיע כאשר המרווחים שנבחרו נשמרו בתיקיית הפרוייקט. לחץ על אישור.
  4. . לנתח את הזרימה
    1. בחר תוספים > פקודות מאקרו > נתח זרימה ותיבת הדו נתח את פרמטרי הזרימה פותח ומציג את הערכים שהוזנו בשלב הפתוח של פרוייקט. ערוך אם יש צורך ללחוץ על אישור.
    2. תיבת הדו ' שמות קבצים של פלט ' נפתחת ומציגה את השמות שהוזנו בשלב פתיחה-יצירה של פרוייקט. ערוך אם יש צורך ללחוץ על אישור.
    3. תיבת דו-שיח תיפתח ותישאל אם המשתמש מוכן להתחיל בניתוח. לחץ על אישור והניתוח יתחיל. המתן לתיבת דו-שיח שתיפתח כדי לציין מתי ניתוח הזרימה יושלם.
      הערה: הזמן הדרוש תלוי במהירות המעבד ובגודל של ערכת הנתונים.
    4. ודא שקבצי התוצאות אוחסנו כקבצי גליונות אלקטרוניים של תבנית. csv בתיקיית הפרוייקט.
      הערה: קבצי פלט כוללים: segment_velocities. csv מכיל ערכי מהירות בעלי ערכים חיוביים ושליליים המציינים כיוון זרימה. תאים המייצגים מקטעים פחות מהאורך המינימלי מכילים את הטקסט SHORT. תאים בעלי ערכי מהירות הגדולים מהמהירות המרבית שנמדדו מכילים את הטקסט OUT (עבור הסטה). kym_ang. csv מכיל זוויות kymograph הנמדד על ידי תוסף הכיווניות בפיג. good_fit. csv מכיל טוב של התאמה של עקומה להתפלגות של זוויות הנמדד מכל kymograph. הטוב ביותר של התאמה (< 0.8) יכול להצביע על נקודות מוסתרים הסתעפות בקטע, לשנות מהירות במהלך מרווח זמן, מנורה או חדר הבהוב אור.
    5. בדוק כדי לוודא שsegment_velocities. csv מכיל ערכים מועטים. אם יש מספר גדול של ערכי OUT, ודא שאורך הקטע המינימלי לניתוח אינו קטן מ-15-20 μm, ולאחר מכן הפעל מראש את הזרימה. אם ה-segment_velocities. csv החדש עדיין מכיל חלק גדול מערכי OUT, בדוק את תיבת התיקון של הבהוב ולאחר מכן הפעל שוב את ' נתח זרימה'.
  5. מייצרים מפות מרחבית.
    1. בחר תוספים > פקודות מאקרו > הפיק מפה מרחבית וחלון הפרמטרים של המפה המרחבית ייפתח, ויציג את הערכים שהוזנו בשלב הפתיחה ליצירת פרוייקט. ערוך במידת הצורך, או כדי להמשיך בבחירה ב'אישור'.
    2. צפה כרצף הזמני של מפות מרחבית של המהירויות זרימה נוצרת עם צבע המציין מהירות זרימה. הפלט נמצא בצורת מחסנית תמונה מסוג. tif עם תמונה אחת עבור כל מרווח זמן. גלול במחסנית. tif כדי להמחיש וריאציה מרחבית וטמפורלית בזרימה. שמור את המחסנית כקובץ AVI (לא דחוס לניידות מרבית) כדי לשתף כסרט.

7. ניתוח כמותי באמצעות פלט צוות

  1. פתח את הקובץ segment_velocities. csv בתוכנית גיליון אלקטרוני או ניתוח סטטיסטי. ערכים אלה כוללים סימן חיובי או שלילי המציין את כיוון הזרימה ביחס לנקודות ההתחלה/עצירה של קטע זה (שנרשמו בקובץ ROI של פלח).
  2. הפוך דף גיליון אלקטרוני חדש המכיל את הערכים המוחלט של כל ערכי המהירות. השתמש בערכים אלה כדי לחשב מהירות זרימה כוללת ממוצעת, מהירות זרימה ממוצעת עבור כל מקטעי כלי הדם לאורך זמן, מהירות זרימה עבור כל פלח כלי דם לאורך זמן, ולהפוך היסטגרמות של הפצות מהירות.
  3. חישוב ערכים סביב אזורים מורפולוגיים מסוימים או אזורי עניין אחרים על-ידי מציאת הקטעים הרלוונטיים הספציפיים בשלד המסומן בתווית ולאחר מכן ביצוע ניתוחים במקטעים הנבחרים הללו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח הצוות יוצר מפקד שלם של מהירויות מיקרוכלי דם על פני שדות מיקרוסקופ שלמים בתקופות של זמן הארכה משניות לדקות. תוצאות הנציג מוצגות באיור 1, איור 2, איור 3 ואיור 4. איור 1 מציג דוגמה של סדרת זמן של הרשת microvascular בכבד של העכבר, הדור של התמונה השלד המהווה משמש להגדיר את ציר הזרימה של מיקרוכלי דם, ואת המפה שנוצר על ידי צוות של פלחי כלי דם בודדים המזוהים עבור כימות. הצוות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, מיניטיזציה של התנועה במהלך הדמיה הקשה של הכבד הוא חיוני ליצירת סרטים הניתנים לשימוש עבור ניתוח זרימה קפילר באמצעות צוות. בשל הקרבה של הסרעפת, תקופות קצרות של תנועה המושרה נשימה מתרחשים, עם הכבד המאובטח חוזר למיקומו הראשוני אחרי כל נשימה. אבטחת הכבד חשוף בניתוח כנגד הצלחת התחתית coverslip באמצעות גזה, ואז הדמיה מלמטה באמצעות מיקרוסקופ הפוך משמש כדי לשתק את האיבר בין הנשימות16,17,18

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מדווחים על אינטרסים מתחרים.

תודות

מחקרים שהוצגו כאן היו נתמכים על ידי מימון המכון הלאומי לבריאות (NIH U01 GM111243 ו NIH NIDDK P30 DK079312). לימודי המיקרוסקופיה שנערכו במרכז אינדיאנה למיקרוסקופיה ביולוגית. אנו מודים לדוקטור מלגורזאטה קמיקל לקבלת סיוע טכני עם מיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#5 מלקחייםFine Science Tools11251-20Dumont #5 מלקחיים Inox
C57BL/6 עכבריםJackson Labsזכר בן 9-12 שבועות
CannulaInstechBTPE-10צינורות פוליאתילן 0.011 x 0.024 אינץ'
מצלמת CMOSHamamatsuC11440-42U304.0LT Scientific CMOS
צלחת עם תחתית החלקהמיקרוסקופיה אלקטרונית SciencesWillCo תחתית זכוכית צלחת GWST5040
מספריים חיתוךכלים
פיג'י ImageJ תוכנתhttps://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
פלואורסצאין דקסטרןתרמו פישר, InvitrogenD1822דקסטרן, פלואורסצאין, 70,000 מגה-וואט, אניוני, ליזין ניתן לתיקון
ספוג גזהפישר22-415-5042x2 אינץ 'Dukal ספוגי גזה סטריליים כרית
חימוםReptithermRH-4בין עכבר לבמה
כרית חימוםSunbeam000732-500-000Uמעל עכבר
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוךNikonNikon TiE מיקרוסקופ הפוך
Isis מכרסם מכונת גילוח חשמליתBraun AesculapGT420
IsofluoraneAbbott GmbHPZN4831850
Luer stub מתאםפישר14-826-19Eמתאם קטטר
מיקרו מספרייםCastro Viejo
מיקרוסקופ אובייקטיביNikonPlan Fluor 20x, NA 0.75 מים
טבילה מחטפישר30 גרם x1/2
"מחט מחזיקOlsen-Hegar
מחמם אובייקטיביBioScience ToolsMTC-HLS-025בקר טמפרטורה עם מחמם אובייקטיבי
מדחום פי הטבעתBraintree Scientific, INCTH-5Aניטור טמפרטורת גוף העכבר
פקודותhttps://github.com/icbm-iupui/STAFF
מחרוזת תפרהרווארד ביוסיינס723288תפר שחור משי, 6-0, סליל
מדעיים ניתוח תמונות מאקרו

מקורות

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  3. Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
  4. Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
  5. Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  6. Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
  7. Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
  8. Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
  9. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  10. Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156(2011).
  11. Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369(1991).
  14. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  15. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  16. Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
  17. Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
  18. Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
  19. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052(2013).
  20. Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106(2013).
  21. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  22. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  23. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303(2015).
  24. Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
  25. Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341(2014).
  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Intravital MicroscopyFIJITrakEM2Skeleton Eyes
אנליזה מרחבית של תזרים שדות במיקרוvasקובלטורה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.