מאמר שיטה

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

DOI:

10.3791/60616

⸱

8 במרץ 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליפידים הם מולקולות אמפיפתיים מגוונות האינן משונות במים. שומנים הם תורמים חיוניים לארגון ולתפקוד של ממברנות ביולוגיים, אחסון אנרגיה וייצור, איתות סלולרי, הובלה והעברה של חלבונים, ארגונית biogenesis, מוסדרות מוות תאים. בגלל שמרים להתחש סכביסים cerevisiae ס הוא חד חד-תאי איקריוטים לניתוח מולקולרי יסודית, השימוש בו כאורגניזם מודל עזר לחשוף מנגנונים המקשרים חילוף החומרים ליפיד ותחבורה תאיים לתהליכים ביולוגיים מורכבים בתוך תאים איקריוטית. הזמינות של שיטה אנליטית רב-תכליתית להערכה הכמותית האיתנה, הרגישה והמדויקת של מחלקות שומנים גדולות בתוך תא שמרים, חיונית לקבלת תובנות עמוקות במנגנונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתמש כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה מאסיבית (LC-MS/MS) עבור ניתוח כמותי של שומנים סלולריים מרכזיים של S. cerevisiae. שיטת LC-MS/MS המתוארת היא מגוונת ואיתנה. היא מאפשרת זיהוי וקוונפיקציה של מינים רבים (כולל צורות isobaric או איזואריק שונים) בתוך כל אחד 10 שיעורי השומנים. שיטה זו היא רגישה ומאפשרת זיהוי וכימות של כמה מינים שומנים בריכוזים נמוך כמו 0.2 pmol/μL. השיטה הוחלה בהצלחה על הערכת כיפות של תאי שמרים שלמים והאורגלים הטהרה שלהם. השימוש בתוספים אלטרנטיביים בשלב הנייד עבור הספקטרומטר ההמוני הגדול בשיטה זו יכול להגביר את יעילות האינון עבור מינים מסוימים של השומנים, ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לשפר את הזיהוי והכמת שלהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גוף של ראיות מציין כי שומנים, אחת המחלקות הגדולות של biomolecules, לשחק תפקידים חיוניים בתהליכים חיוניים רבים בתוך תא איקריוטית. תהליכים אלה כוללים את ההרכבה של bilayers השומנים המהווים את קרום פלזמה וממברנות המקיפים אורגלים סלולריים, הובלה של מולקולות קטנות על פני ממברנות התא, תגובה שינויים בסביבה החילוץ והתמרה האות תאיים, הדור והאחסון של אנרגיה, ייבוא וייצוא של חלבונים מוגבלים אורגלים שונים, סחר בסמים של חלבונים בתוך מערכת endomembrane הפרשת חלבון, ומספר מצבים של מוות תא מוסדר1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10

שמרים שלהניצנים, האורגניזם איקריוטית, בהצלחה בשימוש כדי לחשוף חלק מהמנגנונים המשמשים את התפקידים החיוניים של שומנים בתהליכים סלולריים חיוניים אלה4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,12/10/4, 19 ,16,17,18,19,20. ס. cerevisiae ס הוא אורגניזם מודל יקר לחשיפת מנגנונים אלה משום שהוא מוכן לטיפול מקיף ביוכימיים, גנטי, תא ביולוגי, ביולוגי כימי, מערכת ביולוגית, וניתוח מיקרופלואידיג21,22,23,24,25. התקדמות נוספת בהבנת מנגנונים שדרכם מטבוליזם השומנים והתחבורה התאיים תורמים לתהליכים הסלולריים החיוניים הללו מחייב טכנולוגיות מורכבות של ספקטרומטר המסה עבור האפיון הכמותי של lipidome הסלולר, הבנת המורכבות המולקולרית של lipidome ושילוב lipidomics כמותי לתוך פלטפורמת רב תחומיתשל מערכותביולוגיה1,2 27,28,29,30.

שיטות נוכחיות של המיקרופרומטריה כמותית בסיוע lipidomics של תאים שמרים ותאים של אורגניזמים אחרים איקריוטית אינם מספיק רב-תכליתי, חזק, או רגיש. יתר על כן, אלה שיטות בשימוש כרגע אינם יכולים להבדיל מינים שונים isobaric או איזואריק השומנים אחד מהשני. כאן נתאר שיטה רב-תכליתית, איתנה ורגישה המאפשרת שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים (LC-MS/MS) לניתוח כמותי של שומנים סלולאריים מרכזיים של S. cerevisiae ס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה סטרילית לשמרים מפני שמרים

  1. להכין 90 mL של מדיום מלאה YP המכיל 1% (w/v) תמצית שמרים 2% (w/v) bactopeptone.
  2. הכינו 90 mL של בינוני סינתטי מינימלי YNB המכיל 0.67% (w/v) שמרים חנקן בסיס ללא חומצות אמינו, 20 מ"ג/L l-histidine, 30 מ"ג/l l-leucine, 30 מ"ג/l ל-ליזין, ו 20 מ"ג/l uracil.
  3. חילוק 90 mL של מדיום מלאה YP באופן שווה לתוך 2 250 mL Erlenmeyer אייר צלוחיות (כלומר, 45 mL כל אחד).
  4. חלוקת 90 mL של המדיום הסינתטי YNB מינימלי לתוך 2 250 mL Erlenmeyer מבחנות (כלומר, 45 mL כל אחד).
  5. להפעיל את מבחנות עם מדיה YP ו-YNB ב 15 psi/121 ° צ' עבור 45 דקות לפני השימוש.

2. זן שמרים

  1. השתמש בסוג פראי זן BY4742 (Matα His3Δ1 Leu2Δ0 Lys2Δ0 ura3Δ0).

3. שמרים culturing במדיום YP מלאה עם גלוקוז

  1. אוטוקלב a 20% (w/v) פתרון מניות של גלוקוז ב 15 psi/121 ° צ' עבור 45 דקות לפני השימוש.
  2. להוסיף 5 מ ל סטרילי 20% (w/v) מניות פתרון של גלוקוז לכל אחד שני מבחנות Erlenmeyer אייר המכיל את המדיום YP סטרילי עבור ריכוז סופי של 2% גלוקוז (w/v).
  3. השתמש לולאה מיקרוביולוגית כדי לחסן תאים של זן סוג פראי BY4742 לתוך כל אחד שני מבחנות Erlenmeyer אייר המכיל את מדיום YP עם גלוקוז.
  4. תרבות התאים לילה ב 30 ° צ' עם הסיבוב רועד ב 200 סל ד.
  5. . קח מעיל של תרבות שמרים השתמש במיציטומטר כדי לקבוע את המספר הכולל של תאי שמרים לכל mL של התרבות.

4. העברת שמרים לתוך והוא במדיום הסינתטי מינימלי YNB עם גלוקוז

  1. להוסיף 5 מ ל סטרילי 20% (w/v) מניות פתרון של גלוקוז לכל אחד שני מבחנות Erlenmeyer אייר המכיל את המדיום YNB סטרילי לריכוז הסופי של 2% גלוקוז (w/v).
  2. השתמש בצנרת סטרילית כדי להעביר את הנפח של תרבות שמרים לילה המכיל את המספר הכולל של 5.0 x 107 תאים לתוך כל אחד מבחנות erlenmeyer אייר המכיל את המדיום ynb עם גלוקוז.
  3. תרבות התאים לפחות 24 שעות (או יותר, אם הניסוי דורש) ב 30 ° צ' עם הסיבוב רועד ב 200 סל ד.

5. הכנת ריאגנטים, עבדה אספקה וציוד להפקת שומנים בדם

  1. הכן את הפרטים הבאים: 1) כיתה גבוהה (> 99.9%) כלורופורם 2) כיתה גבוהה (> 99.9%) מתנול 3) 28% (v/v) הידרוקסידי הפתרון אמוניום הידרוקסיד במים טהורים; 4) חרוזי זכוכית (שטופים חומצה, 425-600 μM); 5) מערבולת עם מתאם הולם; 6) 15 מ"ל מהירות גבוהה זכוכית צנטריפוגה צינורות עם טפלון מרופדת בקבוקים; 7) 17:1 ו 2:1 תערובות של כלורופורם ו מתנול; 8) כלורופורם/מתנול (2:1) תערובת עם 0.1% אמוניום הידרוקסיד (v/v); 9) הפתרון ABC (155 מילימטר אמוניום ביקרבונט, pH = 8.0); 10) תערובת של תקני השומנים הפנימיים שהוכנו בתערובת 2:1 של כלורופורם ו מתנול כפי שמצוין בטבלה 1; ו -11) 2 מ"ל מדגם זכוכית מבחנות עם מכסי מרופדת polyטטרפלואורואתילן להפקת של שומנים סלולריים.

6. הכנת ריאגנטים, labware, וציוד עבור LC

  1. הכינו את הפרטים הבאים: 1) איטונטטריל/2-פרופנול/ננו-טהור מים (65:35:5) תערובת; 2) מערבולת עם מתאם הולם; 3) מsonicator אולטרה סאונד; 4) מבחנות זכוכית עם תוספות לצלחת; 5) מערכת LC מצויד במשאבה בינארית, מסיג גבול ומדגם אוטומטי; 6) טור סי18-שלב הפוך (2.1 מ"מ; 75 מ"מ; גודל הנקבוביות 130 Å; טווח של 1-11) משולב למערכת טרום-עמודה; 7) תערובת A: אספניטריל/מים (60:40); ו-8) תערובת ב: איזופנול (90:10).

7. השומנים החילוץ מתאי שמרים

  1. . קח מעיל של תרבות שמרים השתמש ב-הומוציטוטומטר או במדידה OD600 כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים שמרים לכל mL של התרבות.
  2. קח נפח של תרבות שמרים המכילה מספר כולל של 5.0 x 107 תאים (3.3 יחידות OD600). מניחים את הנפח הזה של התרבות לצינור מקורר 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
  3. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
  4. להוסיף 1.5 mL של מים קרים ננו-טהור ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
  5. הוסף 1.5 mL של פתרון ABC קר הקרח ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט את הגלולה תא ניתן לאחסן ב-80 ° צ' לפני חילוץ השומנים.
  6. , להתחיל בחילוץ השומנים. להפשיר את הגלולה על הקרח
  7. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-200 μL של מים קרים-ננו-זכים. העבר את ההשעיה התא ל 15 mL-כוח גבוה בורג הצינור העליון צנטריפוגה עם כובע מרופדת polyטטרפלואורואתילן. הוסף את הפרטים הבאים לצינור זה: 1) 25 μL של תערובת של תקני השומנים הפנימיים המוכנים בתערובת כלורופורם/מתנול (2:1); 2) 100 μL של 425-600 מיקרומטר מזכוכית שנשטפו בחומצה; ו 3) 600 μL של כלורופורם/מתנול (17:1) תערובת.
  8. מערבולת הצינור במהירות גבוהה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לשבש את התאים.
  9. מערבולת הצינור במהירות נמוכה עבור 1 h ב RT כדי להקל על החילוץ של שומנים.
  10. מודדת את המדגם עבור 15 דקות על הקרח כדי לקדם את משקעים החלבון ואת הפרדת השלבים מימית ואורגני אחד מהשני.
  11. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה קלינית ב 3,000 x g עבור 5 דקות ב-RT. זה צעד צנטריפוגה מאפשר להפריד את השלב העליון מימית מן השלב האורגני התחתון, אשר מכיל את כל שיעורי השומנים.
  12. השתמש בצפטה זכוכית בורוסיליקט כדי להעביר את השלב האורגני התחתון (~ 400 μL) לעוד 15 מ"ל בורג זכוכית מחוזק גבוה בראש צנטריפוגה עם כובע מרופד פוליטטאואתילן. אין לשבש את חרוזי הזכוכית או שלב המים העליון במהלך העברה. לשמור על השלב האורגני התחתון תחת הזרם של גז חנקן.
  13. הוסף 300 μL של כלורופורם-מתנול (2:1) התערובת לשלב העליון מימית הנותרים כדי לאפשר חילוץ של ספינגוליפידים ו-PA, PS, PI, ו-CL. מערבולת הצינור במרץ עבור 5 דקות ב RT.
  14. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה קלינית ב 3,000 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  15. השתמש בזפטה זכוכית בורוסיליקט כדי להעביר את השלב האורגני התחתון (~ 200 μL) נוצר לאחר צנטריפוגה לשלב אורגני שנאסף בשלב 7.13.
  16. השתמש בזרימת גז חנקן כדי לאדות את הממס בשלבים האורגניים המשולבים. סגור את הצינורות המכילים את הסרט השומנים תחת הזרימה של גז חנקן. אחסן את הצינורות האלה ב-80 ° c.

8. הפרדת שומנים שחולצו על ידי LC

  1. הוסף 500 μL של acetonitrile/2-propanol/ננו-טהור מים (65:35:5) תערובת לצינור המכיל את הסרט ליפיד שהתקבל בשלב 7.16. מערבולת צינור 3x עבור 10 s ב RT.
  2. נושא את התוכן של הצינור כדי אולטראסוניות sonication עבור 15 דקות. מערבולת צינור 3x עבור 10 s ב RT.
  3. קח 100 μL של מדגם מהצינור והוסף אותו לבקבוקון זכוכית עם הוספה המשמשת לצלחת. לחסל את בועות האוויר בתוך הכנס לפני שהוא הצועד לתוך הצלחת.
  4. השתמש במערכת LC להפריד בין מינים שומנים בדם בשלב ההפוך סי18 עמודה CSH מצמידים למערכת טרום העמודה (ראה טבלת חומרים). במהלך ההפרדה, יש לשמור על הטור ב55 ° c ובקצב הזרימה של 0.3 mL/min. לשמור את המדגם בצלחת wellplate
  5. השתמש בשלבים הניידים המורכבים מתערובת A (60:40 (v/v)) ותערובת B ((v) ו-"תרכובת" 90:10 (ב-v). למצב חיובי של זיהוי יוני אב שנוצר באמצעות מקור היונים אלקטרונון (ESI), במצב ESI (+), השלבים הניידים A ו-B מכילים אמוניום בריכוז הסופי של 10 מ"מ. עבור מצב שלילי של זיהוי יונים הורים, המצב ESI (-), השלבים הניידים A ו-B מכילים מסוג אמוניום אצטט בריכוז הסופי של 10 מ"מ.
  6. השתמש באמצעי אחסון מדגם של 10 μL עבור ההזרקה הן במצב ESI (+) והן ב-ESI (-).
  7. הפרד מין שומנים במינים שונים על ידי LC באמצעות הדרגה הבאה של LC: 0-1 דקות 10% (שלב ב'); 1-4 דקות 60% (שלב ב'); 4-10 דקות 68% (שלב ב'); 10-21 97% (שלב ב'); 21-24 דקות 97% (שלב ב'); 24-33 דקות 10% (שלב ב').
  8. הפעל כדורי סרק כדוגמה הראשונה, בין כל ארבע דגימות, וכדוגמה האחרונה. הפחת את הרקע כדי לנרמל נתונים.
  9. מייצג הכולל יון chromatogram מן LC/MS נתונים של שומנים שחולצו מתאים של סוג פראי זן BY4742 מוצג באיור 1.

9. ניתוח ספקטרומטרי מסה של שומנים מופרדים על ידי LC

  1. השתמש ספקטרומטר מסה מצויד HESI (מחומם לתרסיס ionization) מקור יון לנתח שומנים שהיו מופרדים על ידי LC. השתמש בהגדרות המפורטות בטבלה 2.
  2. השתמש במנתח התמרת פורייה כדי לזהות יוני אב (MS1) ברזולוציה של 60,000 ובטווח ההמוני של 150-2000 Da.
  3. השתמש בהגדרות המפורטות בטבלה 3 כדי לזהות יונים משניים (MS2).

10. זיהוי וכימות של שיעורי שומנים ומינים שונים על ידי עיבוד של נתונים גולמיים מ-LC-MS/MS

  1. לראות את הטבלה של חומרים עבור תוכנה לבצע זיהוי וכימות של שומנים שונים מקבצי LC-MS/ms raw. תוכנה זו משתמשת במסד הנתונים הגדול ליפיד, המכיל יותר מ-1,500,000 יונים ליפידים (MS1) ויוני הקטעים החזוי שלהם (MS2). התוכנה משתמשת גם MS1 פסגות עבור כימות השומנים ו MS2 עבור זיהוי השומנים. כרומאטוגרמה ייצוגית של שני צורות איזואריק פוספוליזה (34:0) שיש להם אותו ערך m/z אבל זמני שמירה שונים, כמו גם MS1 וMS2 ספקטרה שלהם, מוצגים באיור 2, איור 3, איור 4, בהתאמה.
  2. חיפוש קבצים גולמיים של LC-MS המכילים נתוני סריקה מלאה MS1 נתונים ונתוני MS2 התלויים בנתונים עבור חומצות שומן בחינם (FFA), קרדיאוליפין (קלרנית), פיטוגראמיד (PHC), פיטוספיליגוסין (מחשב הבית), זרחן (PE), פוספולידיליגליל (PG), פוספטרדיליינילינטול (PI), פוספדיליסרין (PS), וטריקלגלילרול (תג) שיעורי השומנים באמצעות הסובלנות m/z של 5 דפים לדקה עבור יוני מקודמי ו-10 דפים לדקה עבור יוני מוצרים. פרמטרי חיפוש אחרים מוצגים בטבלה 4. בצע את ההוראות המופיעות במדריך למשתמש של התוכנה. הזהויות של תקני השומנים הפנימיים ומינים שומנים בדם עם הרכב חומצת שומן יוצא דופן צריך להיות מאומת ידנית.
  3. כדי לזהות בקוונטייט שונים שיעורי השומנים ומינים בעזרת חלופות חופשיות מקור פתוח עבור תוכנת החיפוש ליפיד, השתמש במנתח נתונים ליפיד (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), Mzmine 2 (http://mzmine.github.io/), או xcms (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html) תוכנה כדי לעבד נתונים גולמיים מ-LC-ms/MS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה שלנו להערכה כמותית של שומנים סלולריים מרכזיים בתוך תא שמרים בעזרת LC-MS/MS היה רב-תכליתי וחסון. זה איפשר לנו לזהות ולכמת 10 שיעורים שונים ליפיד בתאי S. cerevisiae ס תרבותי במדיום הסינתטי מינימלי ynb מכיל בתחילה 2% גלוקוז. שיעורי השומנים הללו כוללים חומצות שומן בחינם (FFA), קלרנית, פיטוגראמיד (PHC), פיטוספילסין, מחשב, PE, PG, PI, PS ו-TAG (שולחן משלים 1). מינים מולקולריים רבים של כל אחד מהשיעורים הללו זוהו וכוללו באמצעות שיטת LC-MS/MS זו (טבלה משלימה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אמצעי הזהירות הבאים חשובים ליישום המוצלח של הפרוטוקול המתואר כאן:

1. כלורופורם ומתנול רעילים. הם מחלצים ביעילות חומרים שונים ממשטחים, כולל פלסטלינה, מעבדה ועור. לכן, לטפל אלה ממיסים אורגני עם זהירות על ידי הימנעות השימוש בפלסטיק בשלבים הכרוכים במגע עם כלורופורם ו/או מתנול, באמצעות פיפטות זכוכית בורוסיליקט עבור שלבים אלה, ושטיפה אלה הפיפטות עם כלורופורם ו מתנול לפני השימוש.

2. במהלך הפקת השומנים על ידי מתנול/כלורופורם (17:1) תערובת, השימוש בצינור זכוכית בורוסיליקט כד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה לחברים הנוכחיים ולשעבר של מעבדת טיטורנקו לדיונים. אנו מכירים את המרכז ליישומים ביולוגיים של המסה ספקטרומטריה והמרכז לגנומיקה מבנית ופונקציונלית (הן באוניברסיטת קונקורדיה) עבור שירותים יוצאי דופן. מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי (NSERC) של קנדה (RGPIN 2014-04482) ו האוניברסיטה האוניברסיטאי קונקורדיה קרן (CC0113). ק היה נתמך על ידי פרס הצטיינות באוניברסיטת קונקורדיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה מזכוכית במהירות גבוהה עם מכסים מרופדים טפלוןPYREX05-550
2 מ"ל בקבוקוני דגימת זכוכית עם מכסים מרופדים טפלוןפישר סיינטיפיק60180A-SV9-1P
2-פרופנולפישר סיינטיפיקA461-500
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA9554
Agilent 1100 סדרת LC מערכת Agilent טכנולוגיותG1312A
Agilent1100 WellplateAgilent TechnologiesG1367A
אמוניום אצטטפישר סיינטיפיקA11450
אמוניום ביקרבונטסיגמא9830
אמוניום פורמטפישר סיינטיפיקA11550
אמוניום הידרוקסידפישר סיינטיפיקA470-250
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinAvanti Polar Lipids750332
Centra CL2 צנטריפוגה קליניתThermo Scientific004260F
סרמידאוונטי ליפידים קוטביים860517
כלורופורםפישר סיינטיפיקC297-4
CSH C18 VanGuardWaters186006944מערכת טרום עמודה
חומצת שומן חופשית (19:0)Matreya1028
חרוזי זכוכית (שטופים בחומצה, 425-600 μ M)סיגמא-אולדריץ'G8772
גלוקוזפישר סיינטיפיקD16-10
המציטומטרפישר סיינטיפיק267110
L-histidineSigmaH8125
תוכנת חיפוש ליפידים (V4.1)Fisher ScientificV4.1LC-MS/MS תוכנת ניתוח
L-לאוציןSigmaL8912
L-ליזיןSigmaL5501
מתנולFisher ScientificA4564
פוספטידילכוליןאוונטי ליפידים קוטביים850340
פוספטידיל-אתנולמיןאוונטי ליפידים קוטביים850704
פוספטידילגליצרולאוונטי ליפידים קוטביים
פוספטידילינוזיטולאוונטי שומנים קוטבייםLM1502
פוספטידילסריןאוונטי ליפידים קוטביים840028
עמודה הפוכה CSH C18מים186006102
ספינגוזיןאוונטי ליפידים קוטביים860669
תרמו אורביטרפ ולוס MSפישר סיינטיפיקETD-10600
טריצילגליצרוללרודן, מאלמוTAG מעורב FA
סוניקטור אולטרסאונדפישר סיינטיפיק15337416
UracilSigmaU0750
מערבולתפישר סיינטיפיק2215365
תמצית שמריםפישר סיינטיפיקBP1422-2
בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינופישר ScientificDF0919-15-3
זן שמרים BY4742דהרמקוןYSC1049
840446

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  3. Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
  4. Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
  5. Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
  6. Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
  7. Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
  8. Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
  9. Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
  10. Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83(2019).
  11. Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
  12. Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
  13. Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
  14. Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
  15. Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
  16. Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
  17. Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
  18. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
  19. Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
  20. Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
  21. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  22. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  23. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  24. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  25. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
  26. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  27. Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
  28. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  29. Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
  30. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  31. Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
  32. Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C18

מאמרים קשורים