מאמר שיטה

הכנת דגימות ביולוגיות לספקולציה בטמפרטורה קריוגנית באמצעות ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה

DOI:

10.3791/60849

⸱

27 במאי 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Grenoble Alpes, INSERM UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), 2CNRS, UMR 5254, Université Pau & Pays Adour, E2S UPPA, Institut des Sciences Analytiques et de Physicochimie pour l'Environnement et les Matériaux, 3Institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRS, Université Paris Diderot, 4OSUG, UMS 832 CNRS, Université Grenoble Alpes, 5FAME and FAME-UHD beamlines, ESRF, the European Synchrotron, 6ID16A beamline, ESRF, the European Synchrotron

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג הליך מפורט להכנת קריאוסמפלים ביולוגיים לניסויים ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן מבוססי סינכרוטרון. אנו מתארים את כל השלבים הנדרשים כדי לייעל את הכנת הדגימה ואת שימור ההקפאה באמצעות דוגמאות של הפרוטוקול עם תאי סרטן ופיטופלנקטון. שיטה זו מספקת תקן אוניברסלי של הכנת קריו לדוגמה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקר היסודות עם ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן (XAS) מעניין במיוחד כאשר חוקרים את תפקידן של מתכות במערכות ביולוגיות. הכנת דגימות היא הליך מפתח ולעתים קרובות מורכב, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות. למרות שטכניקות צפייה ברנטגן נמצאות בשימוש נרחב, עדיין לא הופץ פרוטוקול מפורט למשתמשים בטכניקה. יתר על כן, שינוי מצב כימי הוא מדאיג, וטכניקות מבוססות cryo מומלץ לנתח את הדגימות הביולוגיות במצב הידרציה כמעט ילידי שלהן כדי לספק את השימור המרבי של שלמות כימית של התאים או הרקמות. כאן אנו מציעים פרוטוקול הכנה תאית המבוסס על דגימות שהשתמרו ב-cryo. הוא מודגם במחקר ספקטרוסקופיית ספיגת קרני רנטגן של סלניום בתאים סרטניים ברזולוציה גבוהה ברזולוציה גבוהה של אנרגיה, ובמחקר של ברזל בפיטופלנקטון. פרוטוקול זה יכול לשמש עם דגימות ביולוגיות אחרות וטכניקות רנטגן אחרות שעלולות להיפגע על ידי הקרנה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של ביו-טרנספורמציות תאיות של יסודות חיוניים או רעילים דורש טכניקות ספקולציה עם רגישות גבוהה ואמור למזער את שלבי הכנת הדגימה שלעתים קרובות נוטים לשינוי של מינים כימיים.

יסודות פיזיולוגיים כמו סלניום וברזל ידועים כקשים במיוחד לחיזוי בשל הכימיה המורכבת שלהם, תנוחות שונות של מיני הסלניום או הברזל, והריכוז הנמוך שלהם ב-ppm (mg/kg) או אפילו בתת-ppm. לפיכך, המחקר של speciation של אלמנטים אלה על ידי XAS יכול להיות מאתגר ביותר. סינכרוטרון XAS ובמיוחד פלואורסצנציה ברזולוציה אנרגטית גבוהה שזוהתה XAS (HERFD-XAS), המאפשרת יחס אות-לרקע נמוך מאוד1, זמינים במקורות סינכרוטרון כדי לחזות אלמנטים מדוללים מאוד במטריצות ביולוגיות מורכבות 2,3. מדידות פלואורסצנציה-XAS קונבנציונליות יכולות להתבצע באמצעות גלאי מצב מוצק (SSD) עם רוחב פס אנרגיה ~150-250 eV, על קו הקרן CRG-FAME במתקן הקרינה האירופי סינכרוטרון (ESRF)4, בעוד שמדידות HERFD-XAS זקוקות לספקטרומטר מנתח גבישים (CAS), עם רוחב פס אנרגיה ~1-3 eV, על קו הקרן CRG-FAME-UHD ב- ESRF2 . פוטונים פלואורסצנטיים מופלים ביחס לאנרגיה שלהם באמצעות תהליכים אלקטרוניים או אופטיים בהתאמה.

הכנת הקריו-דגימה חיונית כדי לשמר מבנים ולשמור על שלמות כימית קומפוזיציונית, ובכך לאפשר ניתוח קרוב למצב הטבעי הביולוגי5. יתר על כן, ניתוחים שבוצעו בטמפרטורות קריוגניות נמוכות עד כדי 10 K באמצעות קירור קריוגני הליום נוזלי (LN2), מאפשרים לנזקי קרינה להאט ולשמר את הספקולציה היסודית עבור XAS. למרות שסקירות מסוימות על טכניקות XAS המיושמות על דגימות ביולוגיות מדווחות על הצורך להכין ולנתח דגימות בתנאים קריוגניים (למשל, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), אף אחת מהן אינה מתארת בבירור את הפרוטוקול המפורט הקשור. בפרסום זה, שיטה להכנת קריו של תאים סרטניים ומיקרואורגניזמים פלנקטון מתוארת עבור HERFD-XAS speciation של Se8 ו- Fe9 בטמפרטורה קריוגנית.

תרגול טוב להכנת דגימה וסביבה במהלך מדידות ספקטרוסקופיה XAS חדישות דורשות 1) התקנה; 2) הליך ניתוח המגביל ככל האפשר את השפעות נזקי הקרינה; ו-3) מדגם (או ייחוס תרכובת מודל) הומוגני ככל האפשר ביחס לגודל קרן הפוטונים של קרני הרנטגן. הפריט הראשון נלקח בחשבון על ידי ביצוע הרכישה בטמפרטורה נמוכה, באמצעות קריוסטאט הליום נוזלי. הפריט השני מטופל על ידי ביצוע כל רכישה על שטח טרי של הדגימה על ידי הזזתו ביחס לקורה. לבסוף, בהתחשב במצב השלישי, דגימות (גלולות) והפניות (אבקות) מותנות בכדורי תפזורת לחוצים על מנת להגביל את הנקבוביות ואת אי-ההומוגניות ככל האפשר, וכדי למנוע חספוס ביחס לגודל הקרן על משטח הדגימה הנבדק בקרן רנטגן. אנו מסבירים כיצד הפרוטוקול מתמודד עם כל הנקודות הללו.

השתמשנו בקו תאי הערמונית האנושיים PC-3 (פוטנציאל גרורתי גבוה) ובקו תאי השחלות OVCAR-3 (המהווה עד 70% מכלל מקרי סרטן השחלות) כדי לחקור את התכונות האנטי-פרוליפרטיביות כלפי תאים סרטניים של ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs), ו-Phaeodactylum tricornutum diatom כמין מודל לחקר רצף הברזל בפיטופלנקטון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת כדוריות התאים הסרטניים האנושיים PC-3 ו- OVCAR-3 עבור דגימת סלניום

הערה: הפרוטוקול הבא מותאם מ- Weekley et al.10. כל הצעדים צריכים להתבצע תחת מכסה מנוע תרבית תאים תחת תנאים והגבלות של בטיחות ביולוגית ברמה 2, תוך שימוש בטכניקות אספטיות.

  1. ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאים של Malassez. זרעו 150,000-200,000 תאים לכל בקבוקון עבור קו התאים PC-3 ו-300,000 תאים עבור קו התאים OVCAR-3.
  2. תאי זרעים בצלוחיות T-75 (שלושה צלוחיות לכל מצב כדי שיהיו להם טריפליקטים) במדיית תרביות התאים המתאימה (טבלה 1) מתחת למכסה הזרימה הלמינרית.
  3. השאירו את תרביות התאים לגדול באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואטמוספרה לחה עם 5% CO2 עד שהן מגיעות למפגש של 80%. בדרך כלל, קווי תאי סרטן הערמונית PC-3 מכפילים את עצמם לאחר 24 שעות בעוד שקווי תאי סרטן השחלות של OVCAR-3 נמשכים 72 שעות. את הצלוחיות יש להשאיר באינקובטור.
  4. בינתיים, דיללו את ה-Se-NPs המשמשים לטיפול לריכוז סופי התואם את ה-IC20 (ריכוז מעכב כדי להשיג 20% מוות תאי) שנקבע מראש על ידי בדיקת ה-MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטרזוליום ברומיד) שנקבעה מראש על ידי בדיקת ה-MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטרזוליום ברומיד) להערכת ציטוטוקסיות. ריכוזים אלה הם ספציפיים לכל סוג Se-NPs אך גם ספציפיים לקו התאים הנחקר.
    1. הניחו את תמיסת מלאי הננו-חלקיקים (2 מ"ג/מ"ל של אלבומין בסרום בקר [BSA] או Se-NPs מצופה צ'יטוזן) באמבט מים באולטרסאונד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    2. דיללו את תמיסת ה-Se-NPs על ידי דילולים סדרתיים במדיום תרבית תאים שלם כדי להגיע לריכוזי עבודה. בין כל דילול, מערבולת במשך דקה אחת.
  5. להכין שליטה חיובית סלניום עם מלח סלניום מדולל לטיפול.
    1. הכינו תמיסת מלאי נתרן סלניט מימית (1 מ"ג/מ"ל) בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל. יש לערבב 1 מ"ג של אבקת נתרן סלניט עם 1 מ"ל של מים אולטרה-פורים.
    2. וורטקס פתרון המניה למשך דקה אחת.
    3. דיללו את תמיסת מלאי הנתרן סלניט על ידי דילולים סדרתיים במדיום תרבית תאים שלם כדי להגיע לריכוזי עבודה.
      הערה: אל תשכחו לטפטף מספר פעמים לפני כל דילול על מנת ליצור הומוגניזציה של התמיסה.
  6. לחשוף את התאים הסרטניים לטיפולי סלניום.
    הערה: יש לחזור על חלק זה של הפרוטוקול עבור כל ננו-חלקיק (NP) שנבדק. כאן, NPs הם משני סוגים, BSA ו chitosan מצופה Se-NPs, בתוספת הפקדים. תמיסת הנתרן סלניט היא השליטה החיובית ואין טיפול בשליטה השלילית.
    1. פתחו את שלושת הצלוחיות T-75 המכילות את התאים במכסה הזרימה הלמינרי.
    2. הסר את המדיום ושטף את התאים בעדינות 2x עם 5 מ"ל של מי מלח מחוממים (37 מעלות צלזיוס) ביציאת פוספט (PBS).
    3. בעדינות, בצד התחתון של הבקבוקון ולא ישירות על שכבת התא, מוסיפים 15 מ"ל מהטיפול בכל בקבוקון באמצעות פיפטה אוטומטית המצוידת בפיפטות פלסטיק סטריליות 25 מ"ל. מניחים את המכסים על הצלוחיות. אין לסגור את המכסים בחוזקה.
      הערה: כפי שמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4, פתרונות הטיפול חייבים לעבור החייאה מראש כדי להיות הומוגניים.
    4. השאירו את שלושת הצלוחיות אופקית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואטמוספרה עם 5% CO2 למשך 24 שעות.
  7. הכנת כדורי התא
    1. לשטוף בעדינות את התאים 2x עם 5 מ"ל של PBS מחומם (37 °C) ישירות בבקבוקי T75.
    2. הוסיפו 6 מ"ל של מדיום תרבית תאים מחומם (37 מעלות צלזיוס) על שכבת התא בבקבוקון T-75 באמצעות נער פיפטה המצויד בפיפטות פלסטיק סטריליות של 10 מ"ל.
    3. אספו את התאים על ידי גירוד עדין באמצעות מגרד תאים. השתמש במגרד תא אחד לכל בקבוקון.
    4. באמצעות פיפטה בוי ופיפטה של 10 מ"ל, שאפו לנוזל ושטפו בחזרה את התא/המדיום על פני הבקבוקון על מנת לאסוף את כל התאים. חזור על שלב זה מספר פעמים כדי לנתק ולהתאים אישית את התאים. לאסוף את המדיום המכיל את התאים בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל.
    5. סובבו כלפי מטה ב-250 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאפו לסופר-נטנט.
    6. יש לשטוף את התאים על ידי החייאה שלהם ב-5 מ"ל של PBS.
    7. סובבו כלפי מטה ב-250 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את ה-supernatant ושחקו על שלבים 1.6.5 ו-1.6.6 2x כדי להיפטר מכל העקבות הנותרים של הטיפול.
    8. בצעו החייאה של התאים ב-1 מ"ל של PBS והעבירו אותם לצינור פוליפרופילן של 1.5 מ"ל. לבסוף, סובבו אותם כלפי מטה במהירות של 250 x g למשך 5 דקות ב-RT. איור 1 מייצג את גלולת התא המתקבלת לאחר צנטריפוגה והששלכת הסופרנאטנט.
    9. הסר בעדינות את כל חומר העל PBS באמצעות פיפטה של 200 μL.
      הערה: היזהרו שלא לגעת בכדור התא ולפגוע בו. באופן אידיאלי, הכדור צריך להיות 2-3 מ"מ גבוה או עבה, עם קוטר של 3-6 מ"מ. עבור שורת התאים PC-3, נדרשים 9 x 106-10 x 106 תאים עבור הבדיקה. עבור קו התאים OVCAR-3, נדרשים 8 x 106-9 x 106 תאים (איור 1). סביר להניח שתאים מסוימים יאבדו במהלך שלבי שטיפת החיץ הבאים. ככל שמספר התא גבוה יותר, כך הכדור יהיה טוב יותר.
  8. הקפאת הבזק של כדורי התא
    1. צללו את החלק התחתון של צינור ה-1.5 מ"ל המכיל את הכדור בחנקן נוזלי (LN2) לרמה של גלולת התא.
    2. בתא כפפות המטוהר במלואו עם אטמוספירה אינרטית כגון גז חנקן, אספו את גלולת התא על ידי הקשה עדינה על צינור 1.5 מ"ל על פני השטח השטוחים של בלוק נחושת מקוררLN 2-מקורר (איור 2). לאחר מכן הכדור נאסף ללא אובדן תאים.
      הערה: השתמש בציוד להגנת ההקפאה, מעיל מעבדה, נעליים סגורות, כפפות קריו ומגן פנים או משקפי בטיחות לטיפול ב-LN2 .
    3. במידת הצורך, ניתן להשתמש במחט מקוררת LN2 כדי לעזור להוציא את הכדור.
      הערה: גלולת התא הקפוא שנוצרה יכולה להתפצל. צעדים אלה חייבים להתבצע בתוך כמה דקות ולהסתמך על המיומנות והמהירות של החוקר.
    4. מידות הכדור הקפוא חייבות להתאים למחזיק הדגימה cryostat. באמצעות הציוד המתואר, אם גלולת התא גדולה מ-2 מ"מ בגובהה ומעט קטנה יותר מהחור של מחזיק הדגימה המשמש ל-XAS, ניתן להשתמש בדגימה ישירות. אם לא, או אם רצוי משטח שטוח לניתוח, יש להכין כדור גלילי בתפזורת, שעדיין שומר על הכדור במצבו הקפוא. אם גלולת התא מקוטעת, ניתן להשתמש בשלבים הבאים באופן אידיאלי בתא כפפות המטוהר במלואו עם אטמוספירה אינרטית.
  9. הכנת הכדורים הגליליים הקפואים בתפזורת
    1. טבלו את כל החלקים של מכבש הידראולי ידני שיהיו במגע עם הדגימה ב-LN2 (איור 3A; מבלט בקוטר 3 או 5 מ"מ מת, עובש, בוכנה/משיכת חוטים).
    2. העבירו את שברי הכדורים הקפואים במהירות לתבנית העמוסה במות הכדורים המתאימים (איור 3B).
    3. גלולה מהירה עם מכבש הידראולי. מספיק שימוש ב-1.5 טון לכדור בקוטר 5 מ"מ או 0.5 טון לכדור בקוטר 3 מ"מ (איור 3C).
      הערה: לאחר כל הכנת גלולה עם מכבש הידראולי, יש להפשיר ולייבש את כל החומרים כראוי באמצעות גז חנקן כדי למנוע בעיות עם הכפור והלחות הנותרים.
    4. אספו את הכדור הגדול של תאים קפואים במהירות והניחו אותו בקריו-טיוב מתאים לאחסון.
    5. אחסן אותו בחזרה במיכל LN2 לאחסון לטווח ארוך.
    6. מעבירים ומעלים את כדורי הקריו לניתוח. הכדור המאוחסן בקריו-טוב מקורר LN2 מועבר למחזיק דגימת קריוסטאט 77 K מצופה מראש בנוזל N2 (איור 4, כפי שמשמש לקו קרן CRG-FAME-UHD). שלב זה צריך להתבצע מהר ככל האפשר, אך יכול להימשך מספר דקות. לאחר מכן העבירו את בעל המדגם לקריוסטט ושמרו אותו על 10 K במהלך כל ניתוח ה-XAS.
      הערה: שלבים 1.9.3 ו- 1.9.6 קשים מכיוון שהם צריכים להיעשות במהירות על מנת למנוע היווצרות כפור שתחסום את הבוכנה ואת התבנית. חלופה אחרת היא לבצע את הצעדים הללו תחת אוהל פלסטיק המטוהר במלואו בגז חנקן. מסת הנחושת הקרירה LN2 מאפשרת לכדור להישמר קפוא.

2. הכנת תאי הפלנקטון לצורך דגימת ברזל

הערה: מי ים סינתטיים המשמשים לפרוטוקול זה הוכנו על ידי הוספת מלחי ים מים אולטרה-פוריים, חומצה מורפולינו פרופנסולפונית, אמוניום חנקתי, נתרן חנקתי, נתרן מטאסיליקט פנטהידרט, נתרן פוספט מונובאסיק, מלאי ויטמינים, מלאי מתכות עקבות, מלאי אנטיביוטיקה וחיץ HEPES ב- pH = 7.9. הריכוזים של כל רכיב מצוינים בטבלת החומרים. פרטים על התרבות ניתן למצוא בכתובת Sutak et al.11

  1. צנטריפוגה בתרבית דיאטום P. tricornutum בצינור פוליפרופילן 50 מ"ל ב-1,100 x g למשך 6 דקות והעברת הכדור לבקבוקון עם מדיום רענן.
  2. תנו לתרבות לגדול במי ים סינתטיים בתא גידול למשך 24 שעות.
  3. צנטריפוגה של תרבית הפלנקטון במשך 6 דקות ב-1,100 x גרם והעבירה את הכדור לתוך מדיום טרי המכיל Fe-citrate (1 μM בתרבית הסופית). דגירה למשך 72 שעות.
  4. הכן את תאי הפלנקטון
    1. צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 1,100 x גרם ולשטוף עם בינוני ללא ברזל.
    2. מעבירים את הכדור לצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל, שוטפים במים אולטרה-פורים וצנטריפוגה 2x למשך 3 דקות ב-1,100 x גרם. הסר את ה-supernatant.
    3. צללו את החלק התחתון של צינור הפוליפרופילן 1.5 מ"ל המכיל את הכדור ב-LN2 כמתואר בשלב 1.8.
    4. העבירו את התאים הקפואים בעובש הקפוא LN2 ולחצו במהירות באמצעות מכבש כדורי XRF (איור 3 ואיור 7) כמתואר בשלב 1.9.
    5. הסר את הכדור ואחסן אותו במיכל LN2 לאחסון לטווח ארוך.
    6. עקוב אחר שלב 1.9.6 (ראה איור 4 עבור ההעברה למחזיק הדגימה של cryostat).

3. הכנה ומדידה של תרכובת ייחוס

הערה: תרכובות ייחוס (מוצקות או נוזליות) המייצגות את המין וצפויות להימצא במערכת הביולוגית חייבות להיות מוכנות ומנותחות על ידי XAS לצורך השוואה עם דגימות ביולוגיות ניסיוניות. ניתן למצוא ספקטרום ייחוס גם במאגרי מידע 12,13,14 וניתן להשתמש בה בתנאי שתנאי המדידה (למשל, רזולוציה ספקטרלית) היו דומים לדגימות הניסוי.

  1. להפניות בתמיסה מימית, שקלו תרכובות ראשוניות בצורת אבקה או נוזל במצב אנאירובי או באטמוספרה אינרטית. הכינו רפרנסים רגישים לחמצון חוזר באטמוספרה אינרטית (כלומר, בתא כפפות אנאירובי או בקו שלנק, ראו איור 5 ואיור 6) כדי למנוע כל תגובה אוקסידו-רדוקטיבית ולשמור על השלמות הכימית של התרכובת, שיכולה להיות תגובתית מאוד ולא יציבה באוויר הסביבה). כאן, כל ההתייחסויות לסלניום הוכנו באמצעות קו שלנק ומים אולטרה-פורים שעברו דה-גז (איור 6). נוזל FeIII-מלאט ופריטין הוכנו באוויר הסביבה.
  2. ערבבו עם תמיסה מתאימה על מנת להגיע לריכוז סופי של 1% wt של היסוד הנחקר (כלומר, סלניום או ברזל) לאיסוף במצב פלואורסצנטי.
    הערה: מים Ultrapure הם הפתרון הנפוץ ביותר להכנת הפניות XAS. תוספת של גליצרול (15%-20%) נדרשת לנוזלים הנמדדים באמצעות פלואורסצנציה סטנדרטית של XAS כדי למנוע ממצאים הנובעים מעיפור קרני רנטגן על ידי גבישי קרח ואיכות משופרת של אות ה-XAS שנאסף באמצעות גלאי מצב מוצק. עם זאת, עבור HERFD-XAS, גליצרול אינו חובה. באמצעות ספקטרומטר מנתח גבישים במקום גלאי מצב מוצק, האנרגיה נבחרת ברזולוציה גבוהה במיוחד והדיפרקציה המושרה על ידי גבישי קרח אינה משפיעה על איסוף הנתונים של היסוד הנחקר1.
  3. שמרו ואחסנו את התמיסה המוכנה בבלון שלנק אטום (איור 5) או בצינור פוליפרופילן של 1.5 מ"ל עד למדידה באותם תנאים כמו הדגימות.
  4. עבור ייחוס מוצק, שקלו אבקות סלניום או אבקות תרכובת מדגם ברזל באוויר הסביבה או בתא כפפות אם המינים רגישים למחזר. כאן, הפניות FeII מוצקות (FeII-אצטט וויוויניט) הוכנו בתא כפפות גזי N2 בעוד FeIII (Fe(OH)3, ו- FeIII-פוספט) הוכנו באוויר הסביבה.
  5. שוקלים אבקת בורון ניטריד בטוהר גבוה ומערבבים עם אבקות התרכובות לדוגמה כדי להגיע לריכוז סופי של 1% wt של היסוד הנחקר (איור 7A).
  6. טוחנים לאבקה דקה באמצעות טיט למשך 15 דקות לפחות.
  7. הניחו את תערובת האבקה בתבנית כדי להכין כדורים עם המכבש ההידראולי (איור 7B, בדומה לאיור 3A עבור גלולת הדגימה).
  8. סגור את התבנית עם הבוכנה (איור 7C, בדומה לאיור 3B עבור גלולת הדגימה).
  9. לחץ כדי לקבל את הכדור בתפזורת (איור 7D, בדומה לאיור 3C עבור גלולת הדגימה).
  10. אחסן את הכדורים המוכנים בתפזורת בתא הכפפות עד שהם ינותחו באותם תנאים כמו הדגימות.
    הערה: הכדור בתפזורת נדבק לפעמים לבוכנות, בהתאם לקיבולת האבקה, למשל. הסרתו ברכות מבלי לשבור אותו אז יכול להיות קשה. במקרה כזה, יש להשתמש בהליך הבא באמצעות דיסקים של פולימיד (לדוגמה, Kapton).
  11. שים טיפה של אתנול על כל צד של הבוכנות שיהיה במגע עם האבקה (איור 8A).
  12. הכן שני דיסקים פולימידים בקוטר מעט קטן יותר מהבוכנות. עובי הפולימיד צריך להיות 10-25 מיקרומטר (דק יותר יהיה קשה לתמרן, עבה יותר יספוג יותר מדי פוטונים של קרני רנטגן במהלך הניתוח).
  13. שים את הדיסקים על הבוכנות. הם יידבקו על ידי פעולה נימית (איור 8B).
  14. הרכיבו את התבנית עם הבוכנה, הוסיפו את האבקה והכניסו את הבוכנה השנייה (איור 8C).
  15. לחץ (ראה שלב 3.11) והסר את הכדור הדחוס בתפזורת מהבוכנות.
    הערה: ניתן להרכיב את ההפניות המוצקות על מחזיק הדגימה הספציפי לקריוסטט כמו הדגימות (ראה שלב 1.8.6). ניתן להרכיב את הפניות הנוזליות על מחזיק הדגימה הספציפי לקריוסטט. ראו איור 9A עבור מחזיק מדגם קריוסטאט CRG-FAME. ניתן ליישם את אותו הליך באמצעות מחזיק דגימת CRG-FAME-UHD, המוצג באיור 4D, באמצעות ההליך הבא.
  16. הרכבה של הפניה נוזלית על מחזיק הדגימה cryostat.
    1. הגדר את סרט הפולימיד (לדוגמה, Kapton) (בעובי של 25 מיקרומטר) כדי לאטום צד אחד של החור במחזיק הדגימה ב-RT (איור 9B).
    2. באמצעות מזרק, למלא את החלל לאט עם הפתרון עד שהוא מגיע למעלה. הימנעו מבועות. יש למלא את המאגר (איור 9C, משמאל).
    3. אטמו את הצד השני של החלל באמצעות הקלטת (איור 9C, מימין).
    4. צללו את מחזיק הדגימה החתום לתוך LN2 (איור 9D, T0–T3).
    5. תגובה תרמית גורמת ל-LN2 לבעבע. המתן עד שהבעבע ייפסק, ויסמן את סוף התגובה (איור 9D, T3–T5).
    6. העבר את מחזיק הדגימה ב-77 K לתוך הקריוסטט של קו הקרן לפני שתתחיל באיסוף הנתונים (איור 9D, T6) או תשמור ב-LN2 Dewar.
      הערה: התמיסה הקפואה מתפשטת היטב בחלל ויוצרת כדור אחיד והומוגני (איור 9D, T7).

4. HERFD-XAS: הליך מדידה

  1. מטב את כל הגבישים מה- CAS בתנאי בראג ביחס לאנרגיית קו הפלואורסצנציה המעניינת. הליך זה יכול להיעשות עם תרכובת התייחסות מרוכזת.
  2. כייל את אנרגיית הקרן המונוכרומטית של האירוע באמצעות ייחוס שעבורו ידוע מיקום האנרגיה של קצה הקליטה (בדרך כלל רדיד מתכתי טהור). הפניה זו יכולה להיות ממוקמת בשלב שני לאחר הדגימה, במצב שידור כפול, על מנת להיות מסוגלים לבדוק את הכיול עבור כל ספקטרום שהתקבל ובסופו של דבר ליישר אותם לאחר הטיפול.
  3. מקם את הדגימה בקריוסטאט הליום נוזלי עבור דגימות ביולוגיות בהתאם להליך המתאים המתואר בשלב 1.9.6.
  4. סגור את הצריף הניסיוני בהתאם לכללי הבטיחות של סינכרוטרון.
  5. בצע את רכישת XAS בטווח אנרגיה המכסה את קצה הספיגה שנבחר.
  6. לאחר כל רכישה ספקטרלית, הזיזו את הדגימה לפחות פי שניים מגודל הקרן בכיוון התנועה לפני שתתחילו ברכישה חדשה.
    הערה: במקרה זה, המדידות בוצעו באמצעות גבישי Ge(440) כדי לבחור את קו Fe Ka1 ובאמצעות גבישי Ge(844) כדי לבחור אתSe K קו1. גודל הקרן בדגימה היה 200 x 100 מיקרומ"ר (H x V רוחב מלא חצי מקסימום). תנועת הדגימה בין כל רכישה הייתה 500 מיקרומטר בשני הכיוונים, על מנת לחקור הומוגניות מבנית ולנתח אזור חדש נקי מנזקי קרינה אפשריים קודמים בכל פעם. ספקטרום בודד משווים וממוזגים אם הם ניתנים להחלפה בתוך הרעש. המדידה נעצרת עבור מדגם נתון כאשר איכות הספקטרום הממוזג נכונה. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח נתונים באמצעות כל תוכנה המוקדשת לניתוח XAS, במיוחד אלה המאפשרים התאמה משולבת ליניארית של ספקטרום מנורמל, למשל אתנה וארטמיס (קבוצת התוכנה של דמטר)15, SixPack16, או Viper17. הסברים מלאים ומפורטים של ניתוח XAS נופלים מחוץ לתחום פרוטוקול זה וניתן למצוא אותם במאמרים אחרונים 18,19, חלקם מוקדשים באופן ספציפי יותר לדגימות ביולוגיות20. ספקטרום הייחוס של סלניום XANES כבר נאסף במסד הנתונים ספקטרום SSHADE21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרות העיקריות של תכשירים אלה היו לחקור את האינטראקציה בין ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs) ותאים סרטניים, לבין קשירת ברזל וריצוף בפיטופלנקטון.

ספקטרום HERFD-XANES של הסלניום במצב ההתחלתי (BSA Se-NPs) ובתאים דגירה במדיום תזונתי (BSA Se-NPs לאחר דגירה של 24 שעות) מוצגים באיור 10. התוצאות הראו כי סלניום ב-Se-NPs הראשוניים היה קיים הן כצורות Se(0) והן כצורות דמויות סלניט, בעוד שלאחר אינטראקציות עם תאי PC-3 הסלניום בתאים היה קיים בעיקר כ-Se(0), ובכך ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה שימש לחקר הצורה הכימית של סלניום וברזל בדגימות ביולוגיות על ידי ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן. הוא מתמקד בהכנת קריו ואחסון של דגימות ביולוגיות ותרכובות ייחוס, כמו גם במדידות HERFD-XAS.

הכנת קריו ואחסון
הכנת הקריו של כדורי הדגימה הביולוגית בתפזורת מאפשרת שימור השלמות הכימית של המינים הנמצאים בדגימות. זה חיוני, מכיוון ששינויים בספקולציה נצפו בעת שימוש בייבוש בהקפאה או ייבוש אוויר לצורך הכנה6. יש להשתמש בפרוטוקול זה ברגע שקו הקרן שנבחר למ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו אסירי תודה על התרומות הכספיות לפיתוח קו הקרן על ידי CEMHTI (אורלינס, צרפת, ANR-13-BS08-0012-01) ו- Labex OSUG@2020 (גרנובל, צרפת, ANR-10-LABX-0056). פרויקט FAME-UHD נתמך כספית על ידי "האמפרנט הגדול" הצרפתי EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), קונסורציום CEA-CNRS CRG ומכון INSU CNRS. אנו אסירי תודה על כל התרומות במהלך הניסויים ובמיוחד על כל האנשים שעבדו על BM30B ו- BM16. המחברים מכירים במתקן הקרינה האירופי של סינכרוטרון למתן זמן קרן קרינה של קרינת סינכרוטרון. אנו מכירים גם בפרויקט PHYTOMET ANR לתמיכה כספית (ANR-16-CE01-0008) ובפרויקט SEDMAC לתמיכה כספית (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמוניום חנקתיסיגמא-אולדריץ'A3795NH4NO3, 2.66 מ"ג/ליטר מים
תא אנאירובי תא אנאירובימעבדת קוי, ארה"ב מצויד במוניטור אנאירובי (CAM-12)
מלאי אנטיביוטיקהסיגמא-אולדריץ'A0166 לאמפיצילין, S9137 לסטרפטומיצין סולפט1 מ"ל/ליטר מים (אמפיצילין נתרן וסטרפטומיצין סולפט, 100 מ"ג/מ"ל)
אבקת בורון ניטריד
מגרד
Neubauer או Malassez
15 מ"ל ו-50 מ"ל
ציטראט ברזל Fe/ציטראט = 1/20Sigma-AldrichF3388תמיסה מימית של FeCl3 50 מ"מ ו-Na-ציטראט 1M pH 6.5
סרום בקר עובריGIBCOA31604-02Performance Plus, מוסמך פורמט One Shot, צלוחיות ממוצא אמריקאי
Sigma-AldrichZ707503TPP 150 סמ"
תא גידולSanyoSanyo MLR-352ב-20 מעלות; C ותחת משטר כהה בהיר 12:12 (3,000 לוקס)
מאגר HEPESSigma-AldrichH40341 גרם/ליטר של מים milliQ HEPES
סרוסי בדרגה גבוהה, OVCAR-3ATCC, Rockville, MDHTB-161טמפרטורת אחסון: טמפרטורת אדי חנקן נוזלי
אינקובטור אינקובטורב-37° C, אווירה לחה עם תמיסת אינסולין CO2 5%
מלבלב בקרSigma-AldrichI0516אינסולין 10 מ"ג/מ"ל ב-25 מ"מ HEPES, pH 8.2, BioReagent, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית
תאים מכבש הידראולי ידניSpecac, ארה"ב
צורנית ימית Phaeodactylum tricornutumאוסף תרביות רוסקוףRCC69http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
חומצה מורפולינפרופנסולפוניתסיגמא-אולדריץ'M3183MOPS, 250 מ"ג/ליטר מים מיליQ (pH 7.3)
מיקרוסקופ
PC-3ECCAC, סולסברי, בריטניה90112714טמפרטורת אחסון: טמפרטורת אדי חנקן נוזלי
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'P4333תמיסה מיוצבת, עם 10,000 יחידות פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין/מ"ל, מסוננת סטרילית, BioReagent, מתאימה לתרבית תאים
פיפטה-בוי25 מ"ל, 10 מ"ל ו-5 מ"ל פיפטות פלסטיק סטריליות
מוצרי תרבית פלנקטון, Mf מדיום: מלחי יםSigma-AldrichS988340 גרם/ליטר מים מילי-קיו. הרכב: Cl- 19.29 גרם, Na+ 10.78 גרם, SO42- 2.66 גרם, Mg2+ 1.32 גרם, K+ 420 מ"ג, Ca2+ 400 מ"ג, CO32- / HCO3- 200 מ"ג, Sr2+ 8.8 מ"ג, BO2- 5.6 מ"ג, Br- 56 מ"ג, I- 0.24 מ"ג, Li+ 0.3 מ"ג, F- 1 מ"ג
פינצטה מפלסטיקOxford InstrumentAGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (שינוי ATCC)GIBCOA10491-01תמיסה עם 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, 1.5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט, 110 מ"ג/ליטר (1 מ"מ) נתרן פירובט, 2.388 גרם/ליטר (10 מ"מ) מאגר HEPES ו-300 מ"ג/ליטר L-גלוטמין לשימוש מחקרי
ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs), מצופה BSA, 2 מ"ג/מ"לחברת NANOCS, ארה"בSe50-BS-1תמיסת Se-NPs מיוצבת BSA. גודל ממוצע כ -30 ננומטר. מאוחסן בטמפרטורה של 4& מעלות; C בחושך, מוגן מפני האור.
ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs), מצופה צ'יטוזן, 2 מ"ג/מ"לחברת NANOCS, ארה"ב11. Se50-CS-1Chitosan ייצב פתרון Se-NPs. גודל ממוצע כ -30 ננומטר. מאוחסן בטמפרטורה של 4& מעלות; C בחושך, מוגן מפני האור.
נתרן מטסיליקט פנטהידראטסיגמא-אולדריץ'71746Na2SiO3.5H2O, 22.8 מ"ג/ליטר מים MilliQ
נתרן חנקתיSigma-AldrichS5022NaNO3, 75 מ"ג/ליטר מי milliQ
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichS5011NaH2PO4, 15 מ"ג/ליטר
מים MilliQ T-75
מכסה מנועתרבית רקמות
מלאי קורט מתכתSigma-AldrichM5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 2298571 מ"ל/ליטר של מים (MnCl2.4H2O 200 מ"ג/ליטר, ZnSO4.7H2O 40 מ"ג/ליטר, Na2MoO4.2H2O 20 מ"ג/ליטר, CoCl2.6H2O 14 מ"ג/ליטר, Na3VO4.nH2O 10 מ"ג/ליטר, NiCl2 10 מ"ג/ליטר, H2SeO3 10 מ"ג/ליטר)
תמיסת טריפאן כחולה (0.4%)GIBCO15250061
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדוםGIBCO25300-054
מלאי ויטמיניםסיגמא-אולדריץ'T1270 לתיאמין, B4639 לביוטין, V6629 ל-B121 מ"ל/ליטר מים (תיאמין הידרוכלוריד 20 מ"ג/ליטר, ביוטין 1 מ"ג/ליטר, B12 1 מ"ג/ליטר)
אמבט מים 37& מעלות; ג
תא ספירת תאים 255475 סיגמא-אולדריץ' תאיםתמיסת מלח פוספט חוצץ (DPBS) של Dulbecco GIBCO 14190-094 ללא סידן, מגנזיום, פנול אדום צינורות אפנדורף 0.5 מ"ל ו-1.5 מ"ל פלקון ר אופטיצלוחיות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104(2012).
  2. Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
  3. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  4. Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
  5. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
  6. Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  7. Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
  8. Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
  9. Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
  10. Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  11. Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
  12. Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
  13. Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
  14. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  15. Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
  16. Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011(2005).
  17. Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
  18. Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
  19. Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
  20. Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
  21. Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
  22. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Biological Sample PreparationHigh Resolution XASSelenium SpeciationIron AnalysisCell Pellet PreparationLiquid Nitrogen StorageHelium CryostatSynchrotron Safety

מאמרים קשורים