הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

11K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61155

⸱

15 במאי 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiobiology, Faculty of Military Health Sciences in Hradec Kralove, University of Defence, 2Department of Clinical Biochemistry and Diagnostics, University Hospital, 3Department of Oncology, Thomayer Hospital, Charles University, 4Department of Oncology and Radiotherapy, Faculty of Medicine, Charles University

במאמר זה

סיכום

סיליה העיקרית היא מבנים extracellular הקשורים centriole. זיהוי cilia ראשוני על ידי כתם immunofluorescent הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה מאוד. בפרוטוקול זה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal.

תקציר

cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1 של מחזור התא, להיות resorbed לפני המיטוזה. ניתן לדמיין cilia הראשי עם שיטות מתוחכמות מאוד, כולל מיקרוסקופאלקטרונים שידור, הדמיה 3D, או שימוש בתוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי. עם זאת, כתמי חיסון של cilia הראשי יש צורך לבצע שיטות אלה. פרסום זה מתאר פרוטוקול לזיהוי קל של cilia הראשי במבחנה על ידי הכתמת אצטילאט אלפא טובולין (אקסואנם) וגמא טובולין (גוף בזל). פרוטוקול כתמים חיסוני זה הוא פשוט יחסית ומביא לתמונות באיכות גבוהה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד ארבעה קווי תאים (C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) המבטאים cilia ראשי תוקנו, immunostained, ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal.

מבוא

cilia העיקריים הם חושיים, בודדים, קרום כבול, מבנים לא מוזגים הקשורים צנטריול אמו של התא. cilia העיקרי נמצאים על רוב תאי החוליות למעט תאי דם אדומים, adipocytes1, ו hepatocytes2. cilia הראשי נוצרים כמו אקסואנם מוארך מורכב על ידי microtubules, שהרכיב העיקרי שלהם הוא α-tubulin. האקסואנם גדל מגוף הבסאלי, המוערך מ-0.0. אורכו של cilia הראשי משתנה בין 2-10 μm; עם זאת, ממדיו יכולים להשתנות במהלך גליצילציה, רעב, היפוקסיה, מתח ציטוקוקס, או לאחר חשיפה לקרינהמיוננת 3,4,,5,6,7. בדרך כלל, תאים יש רק סיליום ראשוני אחד, אשר מעורב morphogenesis ותא איתות מסלולים חשובים להתפשטות תאיםובידול 8,9.

cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1, וororbed לפני הזנת מיטוזה בתהליך המשויך deacetylation טובלין בתיווך HDAC6 (histone deacetylase 6)10. הרגע המדויק של ספיגת cilia הראשי תלוי סוג התא ואת הביטוי של גנים המעורבים ישירות בתהליך זה, כגון אורורה A, Plk1, TcTex-111,,12,13. בהתאם לסוג התא, cilia הראשי לבטא סוגים שונים של קולטנים, ערוצי יון, ומסלולי איתות פעילים. אלה כוללים את קולטני האיתות החשובים ביותר המשפיעים על התפשטות והישרדות, EGFR, PDGFR ו- FGFR. כלולים גם כמה מסלולי איתות שעשויים להשפיע על הפונקציה של איברים אחד או יותר, כולל קיפוד, חריץ, ו Wnt. הודות קולטנים אלה ומסלולי איתות, cilia הראשי גם לבצע פונקציה chemosensory. פונקציה זו מאפשרת cilia הראשי לזהות ליגנדים ספציפיים עבור חריץ, הורמונים, וחומרים פעילים ביולוגית כגון סרוטונין או somatostatin. פונקציות ספציפיות אחרות המוצגות על ידי cilia ראשוני של אורכים שונים כוללים תגובה לשינויים בטמפרטורה, כוח המשיכה, osmolality14.

Cilia הראשי ניתן לדמיין באמצעות שיטות שונות, כגון הדמיה חיה, מיקרוסקופאלקטרון שידור, הדמיה 3D, או על ידי תוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי5,15,16,17. עם זאת, שיטות אלה הן מאוד מיוחדים ומתמשך מחקר צריך בסיסי, מהיר, ושיטות קלות להכתים cilia הראשי בכל שלב של המחקר. מתואר היא שיטה קלה ושימושית לזיהוי cilia הראשי בתאים תרבותיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה תרבות, פתרונות ומנות

  1. Autoclave את כיסויי (22 x 22 מ"מ). הכינו 6 צלחות טובות. להפשיר סרום עוף עוברי (FBS) ופניצילין אנטיביוטי / סטרפטומיצין ולחמם את טמפרטורת התרבות בינונית לחדר (RT). השתמש ב- trypsin-EDTA (0.25%) ו- 1 PBS (פוספט אגירה תמיסת מלח עם סידן ומגנזיום) כדי לעבור את התאים.
  2. להכין טרי 4% paraformaldehyde (PFA) ב dH2O (800 מ"ג של PFA ב 20 מ"ל של dH2O). PFA חייב להיות מוכן טרי לכל ניסוי. מערבבים ומחמים את התמיסה ב-55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות במכסה המנוע. להתקרר ב RT. להוסיף 1 M נתרן הידרוקסיד עד הפתרון מתבהר (pH = 7.2–7.4). יש לאחסן ב-4°C עד שבוע אחד.
    הערה: PFA רעיל; תמיד ללבוש ציוד מגן אישי הולם ולהתכונן בשכונה כימית.
  3. להכין 500 מ"ל של מדיה תרבות, DMEM (Dulbecco של שונה הנשר של מדיום) המכיל 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 2% גלוטמין.
  4. להכין 13 מ"ל של 1% פתרון ג'לטין ב dHסטרילי 2O (130 מ"ג של ג'לטין ב 13 מ"ל של dH2O). השתמש 2 מ"ל של 1% ג'לטין עבור כל באר בצלחת 6 באר. תמשיך להיות סטרילי.
  5. נקה את מכסה המנוע של זרימת ה למינאר באמצעות 70% אתנול. מניחים את החומר הנדרש בתוך מכסה המנוע של זרימת ה למינאר לפני תחילת הניסוי.

2. תרבות תאים להכתמת אימונוציטוכימיה

  1. להפשיר את התאים (במחקר זה C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) באמצעות טכניקות סטנדרטיות וצלחת אותם במבחנות T75 בתוספת ~ 10-12 מ"ל של התקשורת המוכנה. דגירה ב 37 °C / 5% CO2/ 90% לחות יחסית (RH) עד התאים להגיע 70% confluence.
  2. מוציאים את התאים מהאינקובטור ומניאים אותם בכסה המנוע של זרימת ה למינאר. הסר את מדיית התרבות ושטוף את התאים לזמן קצר פי 2 עם PBS אחד. הוסף ~ 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך בקבוקון T75 דגירה ב 37 ° C עבור ~ 5 דקות. בדוק מעת לעת את המיקרוסקופ ההפוך כדי לפקח על ניתוק התא.
    הערה: זמן הדגירה תלוי בקו התא ולכן יש לקבוע אותו באופן אמפירי.
  3. בעדינות respenpent התאים ב 10 מ"ל של מדיה תרבות, pipetting בזהירות כדי ליצור מתלה תא יחיד. יש לשטוף את הבקבוקון שוב במידת הצורך.
  4. הנח את מתלי התא בצינור חסונים 50 מ"ל וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב ~ 200 x g. לשמן את supernatant, להוסיף 10 מ"ל של מדיה תרבות, בעדינות respenpen את הכדור. קח 20 μL של מתלה התא ולערבב יחס 1:1 עם טריפאן כחול לספור ציטומטר בעקבות השיטה הסטנדרטית.
  5. מניחים כיסוי אחד בתוך כל באר של צלחת 6 באר באמצעות פינצטה. לכסות את כיסויי עם ג'לטין על ידי שפיכת ~ 2 מ"ל לתוך בארות. כך יעזור לתאים לצרף את הכיסויים. מסירים את תמיסת הג'לטין ולתת לאוויר להתייבש לכמה דקות. כיסויי הכיסוי מוכנים כעת לטיפוח התאים. התחל את הטיפוח מיד.
  6. זרע 100,000 פיברובלסטים לתוך כל באר ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה תרבות. דגירה התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C / 5% CO2/ 90% RH. בשלב זה, ניתן לטפל בתאים בהתאם לצרכי המשתמש. טיפולים כדי לגרום ciliation תוארו בעבר4,5.
    הערה: מספר הזרעה הראשוני תלוי בזמן ההכפלה של התאים ויש לקבוע אותו בהתאם.

3. כתמי חיסון של סיליה ראשונית במבחנה

  1. לחמם את 4% paraformaldehyde ל RT. להכין פיפטות פסטר, 1x PBS (RT), מיכל פסולת, 15 מ"ל צינורות חסינים, micropipettes (0.5-10 μL, 20-200 μL, ו 100-1,000 μL) וטיפים. קח את התאים מהאינקובטור והניח אותם על הספסל.
    הערה: אין צורך לבצע את הליך ההכתמה בתנאים סטריליים. כל הפתרונות חייבים להיות ב-RT.
  2. הסר מדיה מכל באר. השאר את כיסוי הכיסוי בתוך הבאר. בעדינות רבה לשטוף את התאים 3x עם 2 מ"ל של 1x PBS. באמצעות פיפטה פסטר, להוסיף 2 מ"ל של 4% PFA לתוך כל באר כדי לתקן את התאים. דגירה במשך 10 דקות ב- RT. הסר את PFA ולשטוף 3x עם PBS 1x.
    הערה: השתמש תמיד בנפח מספיק כדי לכסות את כל כיסוי במהלך תקופות הדגירה. לעולם אל תיתן לתאים להתייבש. לעולם אל תשפוך את הפתרונות ישירות על מכסה.
  3. הכן 0.5% Triton X-100 ב- 13 מ"ל של 1x PBS 10 דקות לפני השימוש. מוסיפים 2 מ"ל לכל באר. דגירה במשך 15 דקות. יש לשטוף בעדינות פי 4 עם PBS אחד.
    הערה: Triton X-100 אינו מסיס PBS ב RT. לחמם את פתרון 0.5% Triton X-100 כדי 37 ° C באמבט מים כדי להמיס אותו.
  4. להפשיר סרום עז 5 דקות לפני השימוש. לדלל את סרום העזים ב 1x PBS ביחס 1:20 כפתרון חסימה. להוסיף 150 μL לכל כיסוי ותרגם במשך 20 דקות ב RT.
    הערה: להאריך את תקופת החסימה עד 60 דקות במידת הצורך. אין לשטוף את התאים לאחר חסימה עם סרום עזים.
  5. להפשיר את הנוגדנים העיקריים (כלומר, נגד אצטילאט אלפא טובלין ואנטי גמא טובלין) 5 דקות לפני השימוש. לדלל את הנוגדנים בנפרד ב 1x PBS כדלקמן: עכבר נגד אצטילאט אלפא טובלין ביחס 1:800 וארנב נגד גמא טובלין ביחס 1:300. הסר את פתרון החסימה. אל תתרחץ. להוסיף 150 μL של שני דילולנים נוגדנים לכיסויים ומדגם במשך 60 דקות ב RT.
    הערה: אם דגירה בן לילה להשתמש 500-1,000 μL של פתרונות נוגדנים העיקריים, לאטום את צלחת 6 באר עם סרט פרפין, ולאחסן ב 4 ° C. לחלופין, להשתמש 150 μL של נוגדנים דגירה בתא לחות.
  6. הסר את הנוגדנים הראשיים. לשטוף את כיסויי בעדינות רבה 3x עם 2 מ"ל של PBS 1x. הכן את הנוגדנים המשניים ב- PBS 1x על-ידי דילול נפרד של כבשים Cy3 נגד עכבר ואלכסה Fluor488 עז נגד ארנב ביחס 1:300. להוסיף 150 μL של שני דילולנים משניים לכיסויים. דגירה במשך 45 דקות ב RT בחושך.
    הערה: דגירה בחושך כדי למנוע פוטו-בליך. שילובים אחרים של נוגדנים משניים יכולים לשמש כצורך.
  7. הכן פתרון DAPI (4', 6-diamidino-2-פנילידול) בהתאם להוראות היצרן. לאחסן את האליציטוטים העודפים ב-20°C. דילול 10 μL מ aliquot מניות (1:5,000) ב 50 מ"ל של 1x PBS. הוסף 2 מ"ל של דילול זה לכיסויים. דגירה במשך 5 דקות ב RT בחושך.
    הערה: חשוב לערר את התאים בחושך כדי למנוע פוטו-בליך. ניתן לאחסן את דילול DAPI ב- 4 °C למשך עד חודש אחד.
  8. הכן 2 מחטים, שקופיות, פינצטה, ומדיה הרכבה. תייג את השקופיות.
  9. הסר את פתרון DAPI מהבארות. לשטוף 3x עם 1pBS. הצבת טיפה אחת של מדיה טעינה בכל שקופית. השתמש במחט כדי להרים בעדינות את הכיסוי מתחתית הבאר. הפוך את כיסוי הכיסוי באמצעות הפינצטה והינו אותו בעדינות על טיפת המדיה ההרכבה. בזהירות להסיר את כל בועות.
  10. הגן על השקופיות מפני אור ואחסן אותן למשך הלילה ב- 4°C.
  11. השתמש מיקרוסקופ פלורסנט או confocal עם הגדלה גבוהה כדי לדמיין את cilia הראשי.
    הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בחושך ב- 4 °C למשך עד חודשיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הכתמה החיסונית של cilia הראשי הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה. בניסויים אלה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. הסיליום הראשי זוהה באמצעות אצטילאט α-טובלין ו ơ-tubulin. ההערכה של cilia הראשי יכול להתבצע ברמות שונות וכל שינוי בהקשר זה יכול להיות קשור לחשיפה לקרינה מיוננת, חילוף חומרים של תאים (למשל, רעב), או טיפול כימי (למשל, cytostatics)5,,18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מספר מחברים תיארו שיטות מגוונות לזיהוי סיליה ראשית, לעתים גם מתארים שיטות קיבעון שונות שיכולות להשפיעעל הגילוי שלהם 6,20,21,22. ללא קשר, קשה למצוא פרוטוקול מלא וישיר לזיהוי. הזמינות המוכנה של שיטה כזו תהיה ללא ספק של סיוע רב לחקר חקירת cilia העיקרית, במיוחד בשלבים מוקדמים של מחקר או לשיטה מהירה וקלה כדי לבדוק את הנוכחות של cilia הראשי בקו התא הנבחר. לכן, פרוטוקול זה מתואר בפירוט רב ככל האפשר לז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מהלחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה של הרפובליקה הצ'כית - תוכנית פיתוח ארגונית ארוכת טווח היבטים רפואיים של נשק להשמדה המונית של הפקולטה למדעי הבריאות הצבאית, אוניברסיטת ההגנה; משרד החינוך, הנוער והספורט, צ'כיה (פרויקט מחקר ספציפי מס': SV/ FVZ201703) ו-PROGRES Q40/06. תודה גם לדניאל דיאז על עזרתו האדיב בתיקון בשפה האנגלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 6 בארותTPP92406מידות 128x86x22 מ"מ
Alexa Fluor488Jackson ImmunoResearch111-546-047AffiniPure F (ab')? שבר עז נגד ארנב IgG
נגד טובולין וגמא;Sigma-AldrichT5192ארנב פוליקלונלי אנטי עכבר IgG2a
C2C12ATCCCRL-1772Myoblast (עכבר)
Cy3Sigma-AldrichC2181אנטי עכבר IgG (מולקולה שלמה) F(ab′)2 שבר– נוגדן Cy3 המיוצר בכבשים
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)Sigma-AldrichD9542
Dulbecco´ s נשר שונה וחריף; s בינוניThermo Scientific11960044גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין, Gibco
Dulbecco ' s פוספט חוצץמלח סיגמא-אולדריץD8662עם MgCl2 ו-CaCl2, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים
סרום בקר עובריThermo Scientific16000044מסונן סטרילי, Gibco
L-גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'G7513
MEFATCCSCRC-1039פיברובלסטים עובריים של עכבר
טובולין חד-שבטי נגד אצטילציהSigma-AldrichT7451נוגדן טובולין מונוקלנטי אנטי-אצטיל המיוצר בעכבר
NHLFLonza CC-2512פיברובלסטים ראשוניים של הריאות (אנושיים)
סרום עיזים רגילJackson ImmunoResearch005-000-121
אבקת
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'P078110,000 יחידות פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין למ"ל ב-0.9% NaCl, סינון סטרילי
ProLong Diamond Antifade MountantThermo ScientificP36961
פיברובלסטים בעורמוענק באדיבות מאוניברסיטת צ'ארלס, הפקולטה לרפואה ב-Hradec Krá אוהב וקוטר;.
כיסוי מרובע מחליקיםThermo Scientific22X22-1.5זכוכית בורוסיליקט, 22x22 מ"מ, מרובע
Triton X-100Sigma-Aldrich11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Scientific25200072מסנן סטרילי, Gibco
' פרפורמלדהיד סיגמא-אולדריץ' 158127-500G

מקורות

  1. Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
  2. Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
  3. Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
  4. Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
  5. Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
  6. Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
  7. Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).
  8. Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
  9. Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
  10. Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
  11. Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
  12. Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
  13. Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
  14. Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905(2019).
  15. Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
  16. Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
  17. Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1(2019).
  18. Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
  19. Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
  20. Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
  21. Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
  22. Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).
  23. Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5(2017).
  24. Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11(2015).
  25. DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Mounting Media
זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.