מאמר שיטה

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

10.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61167

⸱

10 במאי 2020

 ,  , 
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

במאמר זה

סיכום

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (<50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

תקציר

הבידוד של מיוציטים לבביים חדריים מלב בעלי חיים ולבבות אנושיים היא שיטה בסיסית במחקר לב. קרדיומיוציטים בעלי חיים מבודדים בדרך כלל על ידי עירוי כלילית עם אנזימי עיכול. עם זאת, בידוד cardiomyocytes אנושי הוא מאתגר כי דגימות שריר הלב האנושי בדרך כלל אינם מאפשרים זינגה כלילית, פרוטוקולי בידוד חלופי לגרום לתשואות נמוכות של תאים קיימא. בנוסף, דגימות שריר הלב האנושי הן נדירות ותו זמינות רק באופן קבוע במוסדות עם ניתוח לב באתר. זה פוגע בתרגום של ממצאים מהחיות לקרדיומיוציטים אנושיים. מתואר כאן הוא פרוטוקול אמין המאפשר בידוד יעיל של מיוציטים חדריים מגוף שריר הלב אנושי ובעלי חיים. כדי להגדיל את יחס פני השטח לנפח תוך מזעור נזק לתא, רקמת שריר הלב פרוסות 300 μm עבה נוצרים מדגימות שריר הלב עם ויברטום. פרוסות רקמות מתעכלות לאחר מכן עם פרוטאז וcollagenase. עכברוש שריר הלב שימש כדי לבסס את הפרוטוקול ולכרות את התשואות של מיוציטים קיימא, סידן סובלני על ידי ספירת תאים ציטומטרי זרימה. השוואה עם שיטת נתח רקמות הנפוץ הראה תשואות גבוהות באופן משמעותי של cardiomyocytes בצורת מוט (41.5 ± 11.9 לעומת 7.89 ± 3.6%, p < 0.05). הפרוטוקול תורגם לכישלון ולא נכשל שריר הלב האנושי, שם התשואות היו דומות כמו שריר הלב חולדה, ושוב, גבוה באופן ניכר מאשר עם שיטת נתח רקמות (45.0 ± 15.0 לעומת 6.87 ± 5.23 תאים / מ"ג, p < 0.05). במיוחד, עם הפרוטוקול שהוצג ניתן לבודד מספרים סבירים של cardiomyocytes אנושי קיימא (9-200 תאים / מ"ג) מכמויות מינימליות של רקמה (<50 מ ג). לפיכך, השיטה ישימה על שריר הלב בריא ונכשל הן מלבבות האדם והן מלב בעלי החיים. יתר על כן, ניתן לבודד מיוציטים מרגשים והתכווצות מדגימות רקמות אנושיות המאוחסנים עד 36 שעות בתמיסה קרדיופלגית קרה, מה שהופך את השיטה שימושית במיוחד עבור מעבדות במוסדות ללא ניתוח לב באתר.

מבוא

טכניקה שסללה את הדרך לתובנות חשובות על פיזיולוגיה cardiomyocyte היא הבידוד של cardiomyocytes חדרי חיים מלבבות שלמים1. cardiomyocytes מבודד יכול לשמש כדי ללמוד מבנה תאי נורמלי ותפקוד, או את ההשלכות של ניסויי vivo; לדוגמה, כדי להעריך שינויים אלקטרופיזיולוגיה תאית או צימוד התכווצות-ריתוך במודלים של בעלי חיים של מחלות לב. בנוסף, cardiomyocytes מבודד יכול לשמש עבור תרבות תאים, התערבויות תרופתיות, העברת גנים, הנדסת רקמות, ויישומים רבים אחרים. לכן, שיטות יעילות לבידוד cardiomyocyte הן בעל ערך בסיסי למחקר לב בסיסי ותרגום.

קרדיומיוציטים מיונקים קטנים, כגון מכרסמים, ומיונקים גדולים יותר, כגון חזירים או כלבים, מבודדים בדרך כלל על ידי תסיסה כלילית של הלב עם פתרונות המכילים קולאזנס גולמי ו/או פרוטאזים. זה תואר כשיטה "תקן זהב" לבידוד cardiomyocyte, וכתוצאה מכך תשואות של עד 70% של תאים קיימא2. הגישה שימשה גם עם לב אנושי, וכתוצאה מכך ניבים cardiomyocyteמקובל 3,,4,5. עם זאת, מכיוון שזמיה כלילית אפשרית רק אם הלב השלם או טריז שריר הלב הגדול המכיל ענף עורק כלילי זמין, רוב דגימות הלב האנושיות אינן מתאימות לגישה זו בשל גודלן הקטן והיעדר כלי דם מתאימים. לכן, הבידוד של קרדיומיוציטים אנושיים הוא מאתגר.

דגימות שריר הלב האנושי מורכבות בעיקר נתחי רקמה בגודל משתנה (כ 0.5 x 0.5 x 0.5 ס"מ עד 2 x 2 ס"מ), שהושגו באמצעות ביופסיות אנדומיוקרדיאליות6, myectomiesמחיצה 7, השתלות VAD8, אומלבבות מושתלים 9. ההליכים הנפוצים ביותר לבידוד cardiomyocyte להתחיל עם טחינה הרקמה באמצעות מספריים או אזמל. מגעים מתא לתא משובשים לאחר מכן על ידי טבילה במאגרי סידן או סידן נמוך. זה מלווה שלבי עיכול מרובים עם תמציות אנזים גולמי או אנזימים מטוהרים כמו פרוטאזים (למשל, שלושה נסיפסין), קולגן, היאלורונידאז, או אלסטאז, וכתוצאה מכך התפוררות של מטריצה חוץ תאית ושחרור של קרדיומיוציטים. בשלב סופי וקריטי, יש לשחזר בזהירות ריכוז סידן פיזיולוגי, או שנגרם נזק תאי בשל פרדוקסהסידן 10,,11,,12. גישת בידוד זו נוחה אך בדרך כלל לא יעילה. לדוגמה, מחקר אחד מצא כי כמעט 1 גרם של רקמת שריר הלב נדרש כדי להשיג מספר מספיק של cardiomyocytes מתאים לניסויים הבאים13. סיבה אפשרית לתשואות נמוכות היא השיטה הקשה יחסית של טחנת הרקמה. זה עלול לגרום נזק במיוחד cardiomyocytes ממוקם בשולי הנתח למרות מיוציטים אלה נוטים ביותר להשתחרר על ידי עיכול אנזימטי.

היבט נוסף שעשוי להשפיע על יעילות הבידוד ואיכות התאים המתקבלים מדגימות אנושיות הוא משך הזמן של איסכמיה של רקמות. רוב הפרוטוקולים מזכירים זמני הובלה קצרים למעבדה כתור מוקדם לתוצאות טובות. זה מגביל את המחקר של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים למעבדות עם מתקני ניתוח לב בקרבת מקום. יחד, הגבלות אלה פוגעות באימות ממצאים חשובים ממודלים של בעלי חיים בקרדיומיוציטים אנושיים. פרוטוקולי בידוד משופרים המאפשרים תפוקות קרדיומיוציט גבוהות מכמויות קטנות של רקמות, רצוי ללא נזק רציני לאחר זמני הובלה ממושכים, ולכן רצויים.

מתואר כאן פרוטוקול בידוד המבוסס על העיכול האנזימטי של פרוסות רקמת שריר הלב דקה שנוצר עם vibratome14,15. אנו מוכיחים כי בידוד מפרוסות רקמות הוא הרבה יותר יעיל מזה מחתיכות רקמה טחון עם מספריים. השיטה המתוארת לא רק מאפשרת תפוקה גבוהה של cardiomyocytes אנושי קיימא מכמויות קטנות של רקמת שריר הלב, אלא גם ישימה דגימות המאוחסנות או מועברות בתמיסה קרדיופלגית קרה עד 36 שעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בחולדות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש Mittelfranken, בוואריה, גרמניה. איסוף ושימוש בדגימות רקמת לב אנושית אושר על ידי ועדות הביקורת המוסדיות של אוניברסיטת ארנגן-נירנברג ואוניברסיטת רוהר בוכום. מחקרים נערכו על פי הנחיות הצהרת הלסינקי. המטופלים נתנו את הסכמתם הכתובה לפני איסוף רקמות.

חולדות Wistar נקבה (150-200 גרם) הושגו מסחרית, מותאם על ידי הזרקת 100 מ"ג/ק"ג של תיופנטל נתרן תוך-פריצינלי, והמתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם ואחריו ניקור חזה וחתך של הלב. דגימות רקמת לב אנושית נאספו מהליבה השמאלית-חדרית במהלך השתלת מכשירי סיוע מכניים, מניתוח מיסטרה של מחיצה, מטטרולוגיה של ניתוח מתקן של פאלוט, או מקיר החדר השמאלי החופשי של לבבות שנשתלו. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד מרקמות חדר האדם. הבידוד של קרדיומיוציטים חולדה בוצע בהתאם, אבל עם אנזימים שונים (ראה טבלת חומרים). זרימת עבודה סכמטית של הפרוטוקול מאוירת באות 1.

1. הכנת מאגרים, פתרונות ואנזימים

  1. הכן מאגרים ופתרונות כמפורט בטבלה 1.
  2. מחממים פתרונות 1, 2, 3 והפתרון של Tyrode ששונה ל- 37°C. אחסן את פתרון החיתוך ב- 4 °C עד לשימוש.
    הערה: עבור 1-2 פרוסות שריר הלב בסך הכל כ 15 מ"ל, 8 מ"ל, ו 5 מ"ל של פתרונות 1, 2, ו 3 נדרשים לבידוד בצלחת אחת 35 מ"מ תרבות רקמות. קנה מידה בהתאם לבידודים בו-זמנית במנות מרובות. פתרון חיתוך ניתן להקפיא ולהיות כל הזמן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
  3. לשקול 1 מ"ג של חלבון XXIV (ראה טבלת חומרים)לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל prechilled ולאחסן על קרח עד לשימוש. זה לעיבוד מדגם אחד. להגדיל את הסכום בהתאם. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
  4. לשקול 8 מ"ג של קולגן CLSI (ראה טבלת חומרים)לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל prechilled ולאחסן על קרח עד לשימוש. זה לעיבוד מדגם אחד. להגדיל את הסכום בהתאם. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
    התראה: תחבשו מסכת פנים או תעבדו מתחת למכסה מנוע אדים כדי למנוע שאיפת אבקת אנזימים.
    הערה: פעילות האנזימים עשויה להשתנות בהמון שונה. לכן, הריכוז האופטימלי עשוי להיות שונה ויש לקבוע עם כל אנזים שנרכש לאחרונה16.

2. אחסון והובלה של רקמת שריר הלב

  1. לאחסן ולהעביר דגימות לב אנושיות בקירור, 4 ° C חיתוך פתרון(שולחן 1).
  2. השתמש באותו פתרון לעיבוד רקמות נוסף וחיתוך ויברטום.
    הערה: ביופסיות ודגימות לב כירורגיות יש להעביר באופן מיידי לפתרון חיתוך ב 4 °C ולאחר מכן ניתן לאחסן או להעביר ב 4 ° C לכל היותר 36 שעות לפני היישום של פרוטוקול זה.

3. עיבוד וחיתוך של הרקמה

הערה: הפרוטוקול לחיתוך רקמות עוקב פישר ואח'15.

  1. גזירה של בלוק הרקמה
    התראה: רקמת לב אנושית עלולה להיות מדבקת. השתמש תמיד בבגדי מגן ובצע את תקנות הבטיחות של המוסד שלך. לטפל בזהירות להבים בשימוש להשליך במכולות בטיחות.
    1. מניחים את הדגימה בצלחת תרבות רקמות של 100 מ"מ מלאה בתמיסת חיתוך קרה של 20 מ"ל ולשמור על צלחת מקורר של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הסר עודפי רקמה פיברוטית ושומן אפיארדיאלי עם אזמל. במקרה של דגימה transmural, להסיר שכבות trabeculae ורקמות ליד אנדוקארדיום.
      הערה: רקמה פיברוטית נוקשה ומופיעה לבנה. שומן הוא בדרך כלל רך ומופיע לבן לצהוב. שכבות טרבקולה ורקמות אנדוקרדיאליות ניתן לזהות מהרכב הרקמה הרופפת שלהם וכיוון סיבים לא מיושר בהשוואה שריר הלב של שכבות epicardial
    3. לעיבוד ויברטום אופטימלי, לחתוך בלוקים רקמה מלבנית של כ 8 מ"מ x 8 מ"מ x 8 מ"מ עם אזמל מדגימה רקמות גדולה יותר. עבור ביופסיות קטנות יותר לדלג על שלב זה ולעבור להטביעה agarose.
  2. הטבעת רקמת לב באגזום בנקודת התכה נמוכה
    1. להרתיח 400 מג של נקודת התכה נמוכה agarose ב 10 מל של תמיסת חיתוך ב זכוכית.
      התראה: לבש כפפות ומשקפיים בטיחות כדי למנוע כוויות. לטפל בכלי זכוכית חמים רק עם בלאי הגנה מפני חום.
    2. מלאו מזרק של 10 מ"ל בג'ל אגרוז חם ומומס. לאטום את המזרק ולאפשר agarose כדי לשוויון באמבט מים 37 מעלות C לפחות 15 דקות.
    3. השתמשו במקציות כדי למקם את דגימת הלב הקצוצות או הביופסיה לצלחת נקייה של תרבות רקמות של 35 מ"מ עם האפיקארדיום פונה כלפי מטה ולהסיר נוזל עודף עם ספוגית סטרילית.
    4. יוצקים את האנגרוז המוגן (שלב 3.2.2) על הרקמה על ידי ריקון המזרק. לאבטח את הרקמה נגד תנועה עם ממחטות תוך שפיכת agarose. ודא כי הרקמה שקועה לחלוטין agarose.
    5. מניחים מיד את המנה על קרח ולתת לאגרוז להתבסס במשך 10 דקות.
  3. חיתוך שריר הלב
    1. הר סכין גילוח חדש למחזיק הלהב של הרטט ולכייל את הרטט על-ידי כוונון הסטת z של הלהב במידת האפשר.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש ברטט עם התקן כיול בסיוע אינפרא-אדום כדי ליישר את הלהב במיקום אופקי עם סטיית z מינימלית (הסטה מדודה <0.1 μm).
    2. השתמשו באזמל כדי לחסום רקמת א-גרוז שמתאימה למחזיק הדגימה של הויברטום. כדי להבטיח יציבות, ודא כי הרקמה עדיין שקועה מספיק באגרוז (שולי agarose - 8 מ"מ).
    3. לתקן את בלוק agarose למחזיק הדגימה עם שכבה דקה של דבק cyanoacrylate ולחץ עדין.
    4. מניחים את מחזיק הדגימה עם הרקמה לתוך אמבט הרטט. ממלאים את האמבטיה בתמיסת חיתוך ולשמור על 4-6 °C לאורך כל העיבוד עם קרח כתוש, מלא במיכל הקירור בחוץ של vibratome.
    5. צור פרוסות בעובי 300 μm במהירות מתקדמת של כ-0.1 מ"מ לשעה, תדר נדנוד של 80 הרץ, משרעת רוחבית של 1.5 מ"מ וזווית להב של 15°. בעת טיפול פרוסות, להחזיק את agarose במקום הרקמה עצמה כדי למנוע נזק לרקמות. אחסן את הפרוסות בתמיסת החיתוך ב- 4 °C למשך 2 שעות לכל היותר, במידת הצורך.
      הערה: Cardiomyocytes הם מונחה במקביל epicardium. לכן, חשוב לחתוך במקביל epicardium כדי למנוע נזק מיוצייט מוגזם. מומלץ להיפטר מ-1-3 הפרוסות הראשונות, מכיוון שיש להשתמש רק בפרוסות אחידות של עובי קבוע לבידוד. עבור ביופסיות רקמות קטנות, עם זאת, רק להשליך את הפרוסה הראשונה.
    6. בדוק יישור cardiomyocyte תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי עם הגדלה של 40-100x.

4. עיכול רקמות

  1. מניחים את לוחית החום על שייקר המעבדה וחממים אותה ל-37 מעלות צלזיוס. הפעל את שייקר המעבדה ב65 סל"ד.
  2. ממיסים את החלבונים (שהוכנו בשלב 1.3) ב-2 מ"ל של פתרון 1 (שלב 1.1 ו-1.2) ותדגירה ב-37°C עד לשימוש. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
  3. ממיסים את הקולגן (שהוכן בשלב 1.4) ב- 2 מ"ל של פתרון 1 (שלב 1.1 ו- 1.2) ותדגירה ב- 37 °C עד לשימוש. אין לערבב את החלבונים ואת הקולגן.
    התראה: ללבוש משקפי מגן וכפפות, כי אנזימים מומסים יכולים לגרום לפציעות עור ועין.
  4. הוסף סידן כלוריד (CaCl2)קולגן המכיל פתרון (מוכן בשלב 4.3) לריכוז סופי של 5 μM.
  5. השתמשו במרטטים כדי להעביר פרוסת רקמה מאמבט הרטט לצלחת נקייה של תרבות רקמות של 60 מ"מ מלאה בתמיסת חיתוך מקצטת מראש ב-5 מ"ל (שלב 1.1 ו-1.2) ולשמור על קרח.
  6. בזהירות להסיר את agarose מרקמות שריר הלב עם להב או משקולות.
    הערה: הימנע מתח עודף ולחץ גהה על פרוסות שריר הלב, כי הם יכולים לפגוע cardiomyocytes.
  7. כדי לבצע את השטיפה הראשונית, מניחים צלחת נקייה של תרבות רקמות 35 מ"מ על צלחת החום ומלאו אותה בתמיסה של 2 מ"ל (37°C) 1. מעבירים 1-2 פרוסות שריר הלב לצלחת המוכנה עם מפסים. שאף את הפתרון עם פיפטה 1 מ"ל ולבצע את שלבי השטיפה 2x כדי להסיר שרידים של פתרון חיתוך.
    הערה: אין לאכוף את פרוסות הלב. הפתרונות והפרוסות צריכים להישאר בטמפרטורה קבועה של 35 מעלות צלזיוס על לוח החום הנסער. כוונן את טמפרטורת לוחית החום במידת הצורך.
  8. הסר את הפתרון 1 מהצלחת והוסף 2 מ"ל של תמיסת החלבונים (שלב 4.2). דגירה במשך 12 דקות על צלחת החום ב 65 סל"ד.
  9. לשטוף 2x עם 2 מ"ל של פתרון טרום חם 1 (37 ° C).
  10. הסר את הפתרון 1 מהצלחת והוסף 2 מ"ל של פתרון קולגנאז (שלבים 4.3 ו- 4.4). דגירה לפחות 30 דקות על לוח החום ב 65 סל"ד.
  11. בדוק מיוציטים בודדים בחינם ב 30, 35, 40 דקות, וכו ', על ידי הצבת המנה תחת מיקרוסקופ אור. עבוד במהירות כדי למנוע קירור משמעותי של הפתרון.
    הערה: זמן העיכול הנדרש עשוי להשתנות בהתאם לחוקת הרקמה ולדרגת הפיברוזיס. ברגע הרקמה מקבל רך באופן ניכר ומנתק בקלות כאשר משך בעדינות, זמן העיכול האופטימלי כבר הגיע. אם יש מספיק רקמות זמינות, ניתן לעכל מספר פרוסות במקביל לתקופות עיכול שונות.
  12. כאשר הרקמה מתעכלת ומיוציטים בודדים גלויים (שלב 4.11), לשטוף 2x עם 2 מ"ל של פתרון טרום חמם 2 (37 ° C) ולמלא שוב עם 2 מ"ל.

5. ניתוב רקמות

  1. ניתכו את פרוסות הרקמה המעוכלות במלקות על ידי משיכת הסיבים בזהירות.
  2. בזהירות פיפטה מספר פעמים עם פיפת פסטר חד-פעמיים (קוטר פתיחה >2 מ"מ).
    הערה: השימוש במלחציים ו pipetting יכול לגרום למתח מכני ולגרום נזק cardiomyocyte. עם זאת, זהו צעד מכריע להפרדה של התאים. השתמש בממצקים עדינים כדי למזער נזק לתאים ולנתק בזהירות את הפרוסות לחתיכות קטנות יותר.
  3. בדוק את קרדיומיוציטים בצורת מוט משוחררים מתחת למיקרוסקופ האור.

6. שיקום ריכוז הסידן הפיזיולוגי

  1. לאט להגדיל את ריכוז הסידן מ 5 μM כדי 1.5 mM תוך כדי עצבנות ב 35 מעלות צלזיוס על צלחת החום. השתמש בפתרונות מניות של 10 מ"מ ו- 100מ"מ. שלבים מומלצים: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1,200, 1,500 μM. לאפשר לתאים להסתגל לרמות הסידן מוגברת במרווחי דגירה 5 דקות בין כל שלב.
  2. הסר נתחי רקמה מעומצמים בזהירות עם ממחטות או לסנן את מתלי התא דרך רשת ניילון עם גודל נקבוביות 180 μm בסוף עלייה בסידן.

7. הסרת סוכן ניתק מכני

  1. להפסיק את התסיסה ולהסיר לאט שליש מהפתרון (~ 700 μL) מההתחלה עם 1,000 μL pipette. הימנע משאיפה של cardiomyocytes.
    הערה: אם רקמה לא אוכלז הוסר, cardiomyocytes יצטברו במרכז המנה, אשר מקל על השאיפה של פתרון ללא תאים. אם לא, להעביר את פתרון התא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולאפשר לתאים לשקע במשך 10 דקות ב 35 ° C, לאחר מכן לשאוף 700 μL של supernatant ולהיפטר, לתוסף את התאים, להעביר אותם בחזרה לצלחת תרבות רקמות 35 מ"מ ולהמשיך עם שלב 7.2.
  2. להוסיף 700 μL של פתרון 3 לתאים, לחדש את התסיסה על לוח החום דגירה במשך 10 דקות.
  3. חזור על שלבים 7.1 ו- 7.2.
  4. להעביר את הפתרון 15 mL צנטריפוגה צינור ולאפשר cardiomyocytes לחשמל למינימום של 10 דקות ומקסימום של 30 דקות בטמפרטורת החדר או ספין ב 50 x g עבור 1 דקות. הסר את supernatant לחלוטין וsspend בפתרון של Tyrode שונה או מאגר הניסויים הרצוי.
    הערה: ניתן לאחסן Cardiomyocytes בתמיסה של Tyrode שונה (טבלה 1) במשך מספר שעות ב 37 °C ו 5% CO2 לפני השימוש.
  5. אמת את איכות התא עם מיקרוסקופ אור סטנדרטי בהגדלה של 40x ו- 200x.
    הערה: כ-30%-50% מהקרדיומיוציטים צריכים להיות בצורת מוט, חלקים ללא ממברנה, ולהציג פלגים צולבים ברורים. רק 5-10% מהתאים ה קיימא צריך להראות התכווצויות ספונטניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לאמת את יעילות הבידוד, הפרוטוקול שימש עם שריר הלב חולדה ומספר המיוציטים קיימא כתוצאה מכך הושווה למספרים שהושגו על ידי בידוד באמצעות זביה כלילית ועל ידי בידוד מחתיכות רקמות קטנות (בידוד נתחים, איור 2). בידוד נתחים ובידוד מפרוסות רקמות בוצעו מאותם לבבות. לבידוד באמצעות עירוי כלילית, עם זאת, כל הלב היה בשימוש. התסיסה הכלילית הניבה בעיקר קרדיומיוציטים בצורת מוט וקרוס-תיל. עם בידודים מפרוסות שריר הלב נצפו חלק נמוך יותר של תאים בצורת מוט, אבל המספר הכולל היה עדיין גבוה. לעומת זאת, לאחר בידוד מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות הבידוד של cardiomyocytes חיים הוקמה לפני יותר מ 40 שנים והוא עדיין תנאי מוקדם עבור גישות ניסיוניות רבות במחקר לב, זה נשאר טכניקה קשה עם תוצאות בלתי צפויות. בידוד Cardiomyocyte באמצעות שאיפה של העורקים הכליליים עם תמיסת אנזים משמש בדרך כלל עבור לבבות של בעלי חיים קטנים ומניב מספר גדול של תאים קיימא. עם זאת, זה דורש מערכת מורכבת יחסית ומומחיות. יתר על כן, רוב דגימות רקמה אנושית אינם מתאימים לשיטה זו, בשל גודלם הקטן או היעדר ענפי עורקים כליליים, מה שהופך שיטות חדשות לבידוד של cardiomyocytes אנושי רצוי. הפרוטוקול המתוא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לסופרים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לאנדראס דנדורפר ממרכז וולטר-ברנדל לרפואה ניסיונית, LMU מינכן, על העזרה בפרוטוקול החיתוך. על מתן דגימות רקמת שריר הלב האנושית ברצוננו להודות Ghazali Minabari וכריסטיאן היים מהמחלקה לכירורגיית לב, בית החולים האוניברסיטאי Erlangen, הנדריק Milting מן אריך & חנה קלסמן מכון, Ruhr-אוניברסיטת בוכום מוהנד Alkassar מהמחלקה לקרדיולוגיה ילדים, בית החולים האוניברסיטאי Erlangen. לתמיכה עם ציתום זרימה ברצוננו להודות סיימון Völkl ועמיתיו ממרכז המחקר תרגום (TRC), בית החולים האוניברסיטאי Erlangen. ברצוננו גם להודות לורנץ מקארגו וסלין גרינינגר מהמכון לפיזיולוגיה תאית ומולקולרית ארנגן על תמיכה טכנית מצוינת.

עבודה זו נתמכה על ידי DZHK (המרכז הגרמני לחקר לב וכלי דם), על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) בבית החולים האוניברסיטאי של אוניברסיטת Erlangen-Nürnberg, ואוניברסיטת Erlangen-Nürnberg.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כימיקלים
2,3-בוטנדיוןמונוקסיםקארל רות'3494.1טוהר>99%
אלבומין סרום בקרקארל רות'163.2
CaCl2Carl Roth5239.2
קריאטין מונוהידראטאלפא AesarB250009
גלוקוזMerck50-99-7
HEPESCarl Roth9105.3
KClCarl RothP017.1
KH2PO4Carl Roth3904.2
L-חומצה גלוטמיתFluka Biochemica49450
אגרוז נקודת התכה נמוכהCarl Roth6351.5
MgCl2 x 6H2OCarl RothA537.1
MgSO4Sigma AldrichM-7506
NaClCarl Roth9265.1
NaHCO3Carl Roth8551.2
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
טאוריןסיגמא אולדריץ'T8691
<חזק>צבעים
Di-8-ANEPPSתרמו פישר סיינטיפיקD3167
Fluo-4 AMתרמו פישר סיינטיפיקF14201
פלואו-וולטתרמו פישר סיינטיפיקF10488
<חזק>אנזימים
קולגנאז CLS סוג Iוורת'ינגטון LS004196משמש לרקמות אנושיות ב-4 מ"ג/מ"ל
(פעילות: 280 יח'/מ"ג)
קולגנאז CLS סוג IIוורת'ינגטוןLS004176משמש לרקמת חולדה ב-1.5 מ"ג/מ"ל<בר/> (פעילות 330 יח'/מ"ג)
פרוטאז XIVסיגמא אולדריץ'P8038משמש לרקמת חולדה ב-0.5 מ"ג/מ"ל
(פעילות ≥ 3.5 יח'/מ"ג)
פרוטאינאז XXIVSigma AldrichP5147משמש לרקמות אנושיות ב-0.5 מ"ג/מ"ל
(פעילות: 7-14 U/mg)
<מנתח תאים חזק>חומר<>
(LSR Fortessa)BD Bioscience649225
צינור צנטריפוגה, 15 מ"לקורנינג430790
, 50 מ"לקורנינג430829
שייקר קומפקטיאדמונד Bü hlerKS-15 B בקרתכיוון תסיסה: אופקי
חד פעמי פלסטיק פסטור-פיפטותקארל רוטEA65.1לטריטורציה של תאים השתמש רק בפיפטות עם קוטר קצה פנימי ≥ 2 מ"מ
מלקחייםFST11271-30
HeatblockVWRBARN88880030
מסנן רשת ניילון, 180 ומיקרו; mMerckNY8H04700
TC Dish 100, StandardSarstedt83.3902
TC Dish 35, StandardSarstedt83.3900
TC Dish 60, StandardSarstedt83.3901
Vibratome (VT1200S)Leica1491200S001כולל VibroCheck לתיקון בסיוע אינפרא אדום של סטיית z
חזק צינור צנטריפוגה

מקורות

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116(2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47(2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168(2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים