מאמר שיטה

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

DOI:

10.3791/61210

⸱

13 במאי 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute for Public Health and the Environment (RIVM), 2Institute for Risk Assessment Sciences (IRAS)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לבדיקות רעילות של חלקיקים הנישאים באוויר, פותחו מערכות חשיפה לממשק נוזלי אוויר (ALI) לבדיקות חוץ גופיות על מנת לחקות תנאי חשיפה מציאותיים. זה מציב דרישות ספציפיות על מודלים תרבות התא. סוגי תאים רבים מושפעים לרעה מחשיפה לאוויר (למשל, התייבשות) ונשארים בני קיימא רק לכמה ימים. זה מגביל את תנאי החשיפה שניתן להשתמש בהם במודלים אלה: בדרך כלל ריכוזים גבוהים יחסית מוחלים כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים, אשר מתיישבים במהירות) בתוך פרק זמן קצר. תנאי ניסוי כאלה אינם משקפים חשיפה מציאותית לטווח ארוך לריכוזים נמוכים של חלקיקים. כדי להתגבר על מגבלות אלה השימוש בקו תא אפיתל הסימפונות האנושי, Calu-3 נחקר. תאים אלה יכולים להיות תרבותיים בתנאי ALI במשך מספר שבועות תוך שמירה על מורפולוגיה בריאה מונולייר יציב עם צמתים הדוקים. בנוסף, מודל סימפונות זה מתאים לבדיקת ההשפעות של חשיפות חוזרות ונשנות לריכוזים נמוכים ומציאותיים של חלקיקים הנישאים באוויר באמצעות מערכת חשיפה של ALI. מערכת זו משתמשת בזרימת אוויר רציפה בניגוד למערכות חשיפה אחרות של ALI המשתמשות בערפילית אחת המייצרת ענן. לכן, מערכת הזרימה הרציפה מתאימה לחשיפה חוזרת וממושכת לחלקיקים הנישאים באוויר תוך ניטור רציף של מאפייני החלקיקים, ריכוז החשיפה והמינון המועבר. יחד, מודל הסימפונות הזה, בשילוב עם מערכת החשיפה לזרימה רציפה, מסוגל לחקות תנאי חשיפה מציאותיים וחוזרים ונשנים לשאיפה שניתן להשתמש בהם לבדיקת רעילות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאות פגיעות לחשיפה לשאיפה לחלקיקים הנישאים באוויר. כדי להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של חלקיקים הנישאים באוויר, חלה התקדמות בפיתוח מערכות חשיפה לממשק נוזלי אוויר (ALI)1,2,3,4,5. מערכות החשיפה של ALI מאפשרות מודלי חשיפה רלוונטיים ומציאותיים יותר בהשוואה לחשיפה מסורתית שקועה באמצעות מדיום תרבותי המשנה את המאפיינים והקינטיקה של החלקיקים6. מערכות החשיפה של ALI מציבות דרישות ספציפיות במודלים של תרבות התאים, שכן למודלים אין מדיום תרבותי ולכן חומרים מזינים בצד האפור. מודלים רבים של תאים מושפעים לרעה על ידי להיות תרבותי וחשוף באוויר (למשל, ייבוש) ורק להישאר קיימא במשך כמה ימים. זה מגביל את תנאי החשיפה שניתן להשתמש בהם במודלים אלה: בדרך כלל ריכוזים גבוהים יחסית מוחלים בתוך פרק זמן קצר כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים, אשר מתיישבים במהירות). תנאי ניסוי כאלה אינם משקפים חשיפה ריאלית ארוכת טווח לריכוזים נמוכים של חלקיקים; לפיכך, ניתן להטיל ספק ברלוונטיות של התוצאות. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פרוטוקול התרבות והחשיפה למודל הסימפונות המורכב מקו תאי האפיתל הסימפונות האנושי Calu-37 היה אופטימיזציה.

רוב דגמי הריאות במבחנה המשמשים לחשיפה ל- ALI מכילים קווי תאים אחרים כגון A549, BEAS-2B ו- 16HBE14o- (16HBE) או תאים ראשיים כבסיס8. קווי תאים אלה יש את החיסרון כי הם נשארים קיימא רק כמה ימים כאשר מתורבת על עלי. בנוסף, חלק מקווי תאים אלה מתגברים כאשר הם מתרבים לתקופה ארוכה מ -5 ימים. לבסוף, תאי A549 מפספסים צמתים הדוקים פונקציונליים ולכן אינם יכולים ליצור מחסום הדוק הדרוש כדי לחקות את הריאות9,10. תאי אפיתל ראשוניים עשויים להיות אפשרות טובה לחשיפה ALI כפי שהם יכולים להיות תרבותיים ב ALI במשך שבועות. עם זאת, תאים ראשוניים שונים מאצווה לאצווה, קשים יותר לתחזוקה, והם יקרים יותר בהשוואה לקווי תאים, מה שהופך אותם פחות מתאימים לבדיקות רעילות וסינון. בעת השוואת קווי תא אפיתל אנושיים שונים (16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B), רק תאי Calu-3 ממלאים את כל הקריטריונים הדרושים לחשיפה מציאותית וחוזרת על עצמה של ALI: הם נשארים בני קיימא במשך שבועות בעודם מתרבים ב- ALI, מספקים שלמות מחסום גבוהה, אינם מגזימים, וקלים לתרבות ולתחזוקה. תאים Calu-3 מקורם אדנוקרצינומה והם מסוגלים לייצר ריר11,12. ישנם חוסר עקביות בשאלה אם התאים יכולים לפתח ריסונים11,13. תאים Calu-3 הם גם מודל מתאים ללמוד וירוס סיניסיטיאלי בדרכי הנשימה (RSV) זיהומים להדביק תאי אפיתל דרכיהנשימה ciliated 14.

מלבד דגם התא, מערכת חשיפה אוטומטית (AES) משמשת לחשיפה לנוזל האוויר לתרסיסים15,16. ל- AES יש את היתרון שהוא משתמש בזרימת אוויר רציפה כדי לחשוף את דגם התא לתרסיסים. זאת בניגוד למערכות חשיפה אחרות לנוזלי אוויר, שבדרך כלל משתמשות בריכוזים גבוהים יחסית בתוך פרק זמן קצר כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים שמתיישבים במהירות)17,18,19. מערכות ענן אלה אינן משקפות חשיפה ריאלית ארוכת טווח לריכוזים נמוכים של חלקיקים. על ידי החלת זרימת אוויר רציפה באמצעות AES, מודל התא יכול להיחשף לריכוז נמוך של חלקיקים על פני תקופה ארוכה יותר, המשקף תנאי חשיפה מציאותיים. יתרון נוסף על פני מערכות ענן הוא של- AES יש אפשרות לחבר מכשירי אפיון חלקיקים, המאפשרים מדידה של גודל החלקיקים, ריכוז המספרים והמסה לאורך זמן. מגבלה של AES היא שהיא משתמשת בזרימות אוויר גבוהות יחסית בין 10 מ"ל לדקה ו 100 מ"ל / דקה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיום תרבות התא (CCM)

  1. הכן בקבוק של 500 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי (MEM) בתוספת גלוטמין.
  2. הוסף 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (כלומר, 100 U / mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין).
  3. הוסיפו 5 מ"ל של תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA).
  4. הוסף 10 מ"ל של אמפיטריצין B (אופציונלי).
  5. הוסף 50 מ"ל של FBS (חום מושבת, אנא בצע את פרוטוקול ATCC עבור איון חום; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20גוידס/AnimCellCulture_Guide.אשקס, עמוד 19)).

2. תת-פריסה של תאי Calu-3

הערה: תאים Calu-3 הם תרבית T75 או T175 צלופשים תרבות התא ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2. תאים מועברים ב 60-80% מפגש כל 7 ימים עם חידוש CCM כל 2-3 ימים. CCM נשפך ו CCM טרי (T25 = 5 מ"ל, T75 = 15 מ"ל, ו T175 = 25 מ"ל) הוא pipetted לתוך הבקבוק ואת הבקבוק ממוקם בחזרה לתוך החממה. יש להעביר תאים לפחות 2x לאחר הפשרה, לפני השימוש בניסויים, או לפני ההקפאה, ויש להעבירם לא יותר מ 25x בסך הכל.

  1. ודא אם הבקבוק הוא 60-80% מפגש על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ אור.
  2. יוצקים את CCM מהבקבוקון.
  3. שטפו את התאים 2x עם 5 מ"ל של 1x פתרון מלח מאוזן של הנקס (HBSS) ללא סידן וללא מגנזיום. השלך את HBSS לאחר כל שטיפה. HBSS מסיר סרום, אשר מעכב טריפסין.
  4. הוסף 3 מ"ל של טריפסין-EDTA עבור T75 (4 מ"ל עבור T175) ומניחים את הבקבוק בחזרה לתוך החממה ב 37 °C (77 °F) ו 5% CO2 עבור 10-15 דקות. בדוק לאחר 10 דקות, להבטיח את התאים הפכו מנותקים מפני השטח בקבוק. במקרה התאים גדלים >80% confluency, הם לא להתנתק באמצעות טריפסין 0.05% ו trypsin 0.25% ניתן להשתמש.
  5. הוסף 6 מ"ל (כלומר, להכפיל את נפח טריפסין-EDTA הוסיף במקור) של CCM לבקבוק בעדינות לטלטל את הבקבוקים כדי להבטיח ערבוב תקין. זאת כדי להבטיח שהטריפסין נוטרל על-ידי ה- FBS ב- CCM ופעילותו בתאים הופסקה. אם טריפסין מותר להישאר במגע עם התאים במשך זמן רב מדי הם לא לחבר מחדש כאשר הוכנס בקבוק תרבות תא חדש.
  6. יוצקים את התוכן המלא של הבקבוק לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
  7. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 130 x g, להבטיח כי צנטריפוגה מאוזנת כראוי.
  8. להחזיר את הבקבוקון המכיל את התאים בחזרה לתנאים אספטיים ולהסיר את supernatant בעדינות, מבלי להפריע גלולה. ניתן לשפוך את supernatant ואת שאר pipetted את, הבטחת גלולה לא מופרע.
  9. Resuspend גלולת התא ב 1 מ"ל של CCM על ידי pipetting למעלה ולמטה עד שכל התאים מושעים (כלומר, אין גלולה או agglomerates התא נצפו). ניתן להוסיף CCM נוסף כדי לדלל את השעיית התא.
  10. לספור את התאים, הן מתים וחיים, ב 1 מ"ל של CCM באמצעות hemocytometer. במידת הצורך לספירה נכונה, לדלל את התאים ב 3 או 4 מ"ל.
  11. השהה את התאים לאמצעי האחסון CCM הנדרש והוסף את השעיית התא לכל בקבוקון. כדי להשיג כ 80% מפגש בשבוע, זרע 2 x 106 תאים T75 או 6 x 106 תאים T175.
  12. בעדינות לטלטל את הבקבוק ולאחר מכן למקם אותו בחזרה לתוך האינקובטור ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
  13. החלף ב- CCM טרי כל יומיים-שלושה ותת-תרבות כאשר התאים מגיעים ל- 60-80% מפגש.

3. זריעת תאים Calu-3 על מוסיף תרבות

הערה: תוספות זמינות עם גדלי נקבוביות שונים. גדלי נקבוביות קטנים (למשל, 0.4 מיקרומטר) יש את היתרון כי התאים לגדול בקלות רבה יותר והוא יכול להשיג מחסום טוב כבר לאחר 5 ימים culturing בתנאים שקועים, כפי שנמדד על ידי התנגדות חשמלית אפיתל טרנס (TEER). עם זאת, כאשר מעוניינים טרנסלוקציה חלקיקים, נקבוביות אלה הם קטנים מדי יהיה ללכוד את החלקיקים. לכן, גדלי נקבוביות גדולים יותר (למשל, 3 מיקרומטר) נבחרים בדרך כלל כדי לבדוק חלקיקים. בעת שימוש בגודל נקבובי גדול יותר, התאים זקוקים לפרקי זמן ארוכים יותר (למשל, 7-10 ימים של culturing בתנאים שקועים) כדי להשיג TEER טוב.

  1. הכן את השעיית התא עם ריכוז ידוע לאחר שלבים 2.1–2.10.
  2. לדלל תאים לריכוז של 5 x 105 תאים / מ"ל ב CCM מראש עבור 6 מוסיף היטב או 2.5 x 105 תאים / מ"ל עבור 12 מוסיף היטב.
  3. קח צלחת תרבות התא עם מוסיף ומניחים בתנאים אספטיים.
  4. מלא את הצד הבסיסי עם 2 מ"ל של CCM מראש עבור 6 מוסיף היטב, או 1 מ"ל עבור 12 מוסיף היטב. בעת הוספת מדיום התרבות, מוציאים את ההכנסה באמצעות פינצטה.
  5. בזהירות לערבב את ההשעיה התא על ידי pipetting למעלה ולמטה. פיפטה 1.0 מ"ל עבור 6 מוסיף היטב ו 500 μL עבור 12 בארות מוסיף (שווה ערך 100,000 תאים / ס"מ2) על החלק העליון של הממברנה בתרבות התא להוסיף עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר. עבור נקבוביות μm 3.0, להגדיל את צפיפות התא ל 128,000 תא / ס"מ2.
  6. מכסים את צלחת תרבית התא ואת הדגירה ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2.
  7. שנה את CCM כל יומיים-שלושה.
  8. תן לתאים להיות משולבים במשך 7 ימים בתנאים שקועים לפני שתמשיך לתרבות ב ALI.
  9. מדוד טיר.
    1. קח Voltohmmeter אפיתל בתוספת שופסטיק אלקטרודה סט לטעון את מערכת הסוללה לילה.
    2. נתק את הוולטומטר מהמטען וחבר את אלקטרודת מקל האכילה.
    3. נקה את האלקטרודה עם 70% אתנול.
    4. מניחים את האלקטרודה ב- CCM על ידי הצבת האלקטרודה הארוכה יותר במדיית התרבות החיצונית עד שהיא נוגעת בתחתית המנה ומניחה את האלקטרודה הקצרה יותר במדיה מבלי לגעת בקרום.
    5. התחל עם הוספה ריקה ללא תאים. המתן עד שהמדידה תתייצב ותכתוב את ההתנגדות באוהמס. מדידה זו היא ההתנגדות של קרום הכנס ללא תאים (כלומר, התנגדות ריקה).
    6. חזור על המדידה עבור כל הוספה והפחת את ההתנגדות הריקה כדי להשיג את ההתנגדות האמיתית.
    7. לניתוח נתונים, הכפל את ערכי ההתנגדות על-ידי שטח הפנים של ההוספה Ω x ס"מ2. עבור 6 להחדיר היטב, שטח הפנים הוא 4.67 ס"מ2. לכן, אם נמדדת התנגדות של 600 אוהם והרקע הוא 120 אוהם, ההתנגדות היא 480 אוהם, אשר לאחר מכן מוכפל על ידי שטח הפנים של 4.67 ס"מ2 עבור סך של 2,241.6 אוהם x ס"מ2. על ה- TEER להיות >1,000 Ω x ס"מ2 כדי להמשיך.
  10. הסר את ה- CCM מהצד ה- apical של התוספות.
  11. הוסף 2 מ"ל של CCM מראש עבור 6 גם ו 1 מ"ל עבור 12 מוסיף היטב לצד basolateral של הבאר (כלומר, תחת תוספת תרבות התא). CCM צריך לגעת בקרום מלמטה, אבל לא לדלוף על החלק העליון של הכנס.
  12. בשלב זה תאים נחשפים באופן נקודתי לאוויר, אשר מכונה culturing ב ALI.
  13. תאי תרבות ב ALI באינקובטור ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 במשך 7 ימים לפני החשיפה.
  14. החלף את CCM הבסיסי כל 2-3 ימים. התאים יכולים לשמש ב ALI במשך 6 שבועות.

4. הכנת מערך החשיפה

הערה: סעיפים 5-7 מתארים הכנות לחשיפת חלקיקים באמצעות תחנת חשיפה אוטומטית (AES, ראה טבלת חומרים). ההתקנה עבור ערפילית חלקיקים ואפיון תואמת גם למערכות חשיפה אחרות של ALI מיצרנים אחרים. כדוגמה, החשיפה לחלקיקים מתוארת להלן. מערכות כאלה יכולות לשמש גם לחשיפות אחרות, כגון רגישים, עשן סיגריות ופליטת דיזל. איור 1 מציג את ה- AES ומודול החשיפה. איור 2 מציג ייצוג סכמטי של כיוונון החשיפה, כולל כל המכשירים האחרים.

  1. לפני תחילת החשיפה באמצעות AES, חבר את המערכת למספר מכשירים למדידת מאפייני אירוסול; אלה נמדדים בזרם צדדי ממש לפני שהתרסיסים נכנסים לארון.
    הערה: מפצל זרימה משמש לחיבור הזרם הצדדי לציוד אפיון החשיפה. בדרך כלל, נעשה שימוש בציוד הבא: סריקת ממיר חלקיקי ניידות (SMPS), ממיר חלקיקים אופטי (OPS), מונה חלקיקי עיבוי (CPC), תנודות מיקרו איזון של אלמנטים מחודדים (TEOM). מדידות SMPS ו- OPS מבוצעות 1x לשעה ומשתמשות באותו צינורות ממפצל הזרימה. המפלגה הקומוניסטית של סין ו- TEOM מבצעות מדידה רציפה ונתונים משניהם נרשמים ביומן נתונים מדגם סנאי 2020. בנוסף, ריכוז מסה כבידתי נקבע באמצעות מיקרו איזון בלחות יחסית מבוקרת (40–70%) ותנאי טמפרטורה (21-23 מעלות צלזיוס). מסנני טפלון נשקלים לפני ואחרי כל חשיפה כדי לאשר את ריכוז החשיפה. כדי ללכוד את הפליטה, נעשה שימוש במסנן HEPA. ההתקנה כולל מהונדסים ננו חומרים (ENM) מתלים nebulizer ממוקמים כל בארון זרימה כדי למנוע כל חשיפה לאנשים. AES יכול לשמש לבדיקת סוגים רבים ושונים של ENMs, כולל מתכות תחמוצות מתכת.
  2. הכינו השעיה ננו-חומרית זמן קצר לפני החשיפה. בדרך כלל השעיה של 1% מוכנה כפתרון למניה. לדוגמה, להשעות 100 מ ג של ננו ב 10 מ"ל של מים טהורים.
    הערה: לחשיפה DQ12, 300 מ"ג משמש להשגת כ 2 מיקרוגרם / ס"מ2. סכום זה יכול לשמש בחשיפה אחת או מחולק על חשיפות חוזרות ונשנות (למשל, 300 מ"ג מושעה ב 30 מ"ל לחשיפה אחת או 21.5 מ"ג מושעה ב 2.15 מ"ל טרי כל יום במשך 3 שבועות של חשיפה חוזרת). ההשעיה מוכנה טרי בכל יום חשיפה. השעיית החלקיקים הוא sonicated במשך 16 דקות באמצעות sonication בדיקה. נפח פתרון המניה של 1% מותאם לנפח כולל של 100 מ"ל על ידי הוספת מים טהורים.
  3. שים את המתלה ENM בבקבוק קטן עם כובע ו stirrer מגנטי כדי למנוע התיישבות של החלקיקים. חבר את הבקבוק למשאבה פריסטלטית באמצעות צינור קטן והתאם את הזרימה ל-25 מ"ל/שעה.
  4. חבר את המשאבה peristaltic לחרבובית ספריי ולהתאים את ההגדרות כדי לאפשר אירוסוליזציה רציפה.
  5. זרבובית הריסוס מותקנת על צינור אלומיניום באורך 60 ס"מ (תא ערבוב, קוטר 15 ס"מ, מחומם ל-60 מעלות צלזיוס). ההתקנה מחוברת ל- AES באמצעות צינור נחושת באורך 1.5 מטר (קוטר 15 ס"מ). על גבי AES משפיע מסיר את כל אירוסולים גדול מ 2.5 מיקרומטר.
  6. חבר את זרבובית התרסיס ל-3 מוטות אוויר דחוסים באמצעות שני בקרי זרימה המוניים (MFC) כדי לאפשר ערפילית של מתלים. זרימה אחת של 14 L / min משמש זרבובית ספריי, MFC השני לערבוב של האוויר בצינור.
  7. יום לפני תחילת החשיפה, להפעיל את AES כדי לאפשר את הארון להגיע לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  8. הפעל את זרימת האוויר ואת הלחות בארון 2 שעות לפני תחילת החשיפה, כדי להגיע 85% לחות. הפעל את החימום של תאי החשיפה שבהם מוסיף עם התאים יוצבו.
  9. הפעל את מיקרו איזון הקוורץ (QCM) והגדר את הערך ההתחלתי ב- 0 באמצעות התוכנה. התחל ברישום. כל 10 s המסה נמדדת ומתבטאת כמו ng / cm2.
  10. מחממים את מדיית תרבות התא ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים (~ 20 - 30 דקות).

5. הכנת תאי קאלו-3 לחשיפה

הערה: לחשיפה טיפוסית של ALI באמצעות ה- AES, יש צורך ב- 15-20 תוספות עם שכבת תא משולבת. אלה מורכבים 3 פקדי אוויר נקי, 3 פקדי אינקובטור שיטופלו באופן דומה לתוספות האחרות ללא חשיפה ב- AES, 6-8 מוסיף לחשיפה לתרסיס (בהתאם לשימוש ב- 0, 1 או 2 מיקרובלנס), 1-3 תוספות למדידות בקרה (כגון שחרור LDH מרבי) ו - 3 תוספות חילוף למקרה שה- TEER של חלק מהתוספות אינו מספיק. התאים צריכים לציין TEER של >1,000 Ω x ס"מ2 כדי להמשיך.

  1. ביום הראשון לחשיפה, לשטוף תאים 1x עם CCM, לבדוק מורפולוגיה של התא, ולמדוד את TEER של מודל התא באמצעות Voltohmmeter. התאים צריכים ליצור מונולייר הדוק ללא רווחים.
  2. שים 2 מ"ל/1 מ"ל של HEPES אגירה CCM ללא FCS לצד basolateral של 6 באר /12 גם צלחות ולהעביר את התרבות מוסיף עם תאים ללוחות החדשים.
    הערה: במהלך החשיפה, לא קיים CO2 ב- AES. לכן, מדיום תרבות אגירה HEPES (25 mM HEPES) משמש במהלך הובלה וחשיפה. מדיום זה משמש הן עבור התאים החשופים ב- AES והן עבור תאי הבקרה של החממה.
  3. במקרה הזמן להעביר את תרביות התא AES הוא יותר מ 5 דקות, לשים את התאים באינקובטור נייד של 37 °C (69 °F) במהלך ההובלה.

6. טיפול ב- AES במהלך חשיפה

  1. ב- AES, מלא את מודולי החשיפה ב- CCM עם אגירת HEPES ללא סרום עגל עוברי (FCS). כמות CCM תלויה ביחידה בה נעשה שימוש ובסוג הוספת תרבית התאים. זכור כי כדי לשמור על התאים ב ALI, המדיום צריך להגיע לתחתית הממברנה, אבל לא צריך לדלוף על גבי הממברנה. בעת שימוש ב- 6 מוסיף באר, הוסף 6 מ"ל של CCM במאגר HEPES למודולי החשיפה.
  2. מעבירים את התוספות עם תאים מהלוחות למודולי החשיפה באמצעות פינצטה סטרילית. בדוק כי אין בועות אוויר בצד basolateral של התאים ולהסיר כל CCM בצד apical של מוסיף. במקרה שיש כמה בועות אוויר בצד הבסיסי, בעדינות להפוך את מוסיף באמצעות פינצטה סטרילית עד שהם מוסרים. שמור את הצלחות המכילות CCM באינקובטור להעברה לאחר חשיפה.
  3. השתמש בתצוגת מסך המגע כדי לבחור משך חשיפה, קצב זרימת אוויר ושיפור תצהיר אלקטרוסטטי. ניתן להשתמש בתצוגה גם לבדיקת לחות וטמפרטורה. בדרך כלל, משך חשיפה של 4 שעות נבחר, עם קצב זרימה של 50 מ"ל / דקה על מוסיף ב 37 °C (69 °F) ו 85% לחות.
    הערה: המודולים ברמה הראשונה (איור 1) משמשים לחשיפה לאוויר נקי; מוסיף ברמה זו משמשים כפקדי חשיפה לאוויר נקי. מודולים אחרים ברמה השנייה והשלישית יכולים לשמש לחשיפה לתרסיס, כולל שני מודולים למיקרובלנס גביש קוורץ (QCM) למדידת תצהיר באינטרנט.
  4. בדיקת הדליפה צריכה להתבצע לפני תחילת החשיפה. הדליפה צריכה להיות פחות מ 5 מ"ל / דקה. בצע את ההוראות המופיעות בתצוגת AES. לאחר סיום בדיקת הדליפה, ניתן להתחיל בחשיפה. במקרה של דליפה, יש לבדוק את הצינור.
  5. בסוף החשיפה, פתחו את הדלת של מודול AES, פתחו את מודולי החשיפה, הניחו את תרבית התאים מחזירה ללוחות תרבות התאים והעבירו את הצלחות לחממה הניידת.
  6. לאסוף את המדיה מן המודולים (כלומר, דגימות חשופות) ומהלוחות (כלומר, פקדי אינקובטור) לניתוח מאוחר יותר, כגון מדידת לקטט דהידרוגנאז (LDH).
  7. במעבדה לתרבות התאים, העבירו את תוספות תרבית התאים ללוחות מלאים ב-CCM סטנדרטי טרי. שים את צלחות תרבות התא באינקובטור עד החשיפה הבאה או עד הניתוח.
  8. לאחר יום החשיפה הסופי, לשים את מוסיף באינקובטור עד למחרת.
  9. ביום שלאחר החשיפה הסופית, הוסף CCM לצד apical כדי למדוד TEER באמצעות Voltohmmeter. לאסוף הן apical ו CCM basolateral בנפרד לניתוח של ציטוקינים.
  10. הסר את כל CCM ולבצע בדיקה של יכולת הקיום של התא על-ידי הוספת, לדוגמה, מגיב התפשטות לצד ה- apical.

7. ניקוי AES

  1. ממלאים את מודולי החשיפה במים, ממתינים דקה ומוציאים את המים. לאחר מכן, למלא את המודולים עם 70% אתנול, להשאיר אותו במשך 10 דקות, ולהסיר את האתנול. נקו את חצוצרות החשיפה גם עם 70% אתנול.
  2. לעצור את בקרת לחות 85%, אבל להשאיר את הטמפרטורה של הארון ב 37 °C (69 °F) לניסוי הבא.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מספק שיטה לפולחן וחשיפת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים ב- ALI המחקה תנאי חשיפה מציאותיים וחוזרים ונשנים לשאיפה שניתן להשתמש בהם לבדיקת רעילות. המאפיינים של מודל התא ושל מערכת החשיפה חיוניים להשגת מודל חשיפה לשאיפה מציאותית שניתן להשתמש בו לחשיפות חוזרות ונשנות. התוצאות על מאפיינים אלה מוצגות להלן.

דרישות ובחירה של מודל התא

בעת בחירת מודל תא מתאים, יש לקחת בחשבון את המאפיינים הבאים:

  1. מודל התא צריך להיות מסוגל ליצור monolayer confluent עם צמתים הדוקים מתפקדים כדי לחקות את מחסום הריאות.
  2. דגם התא אמור להציג ביצועים מיטביים כאשר הוא נחשף שוב ושוב לאוויר ממוזג (טמפרטורה ולחות).
  3. מודל התא צריך להגיב לחשיפה.

מחקר זה התחיל עם ארבעה קווי תא אפיתל אנושיים שונים: 16HBE, Calu-3, H292, ו BEAS-2B. כל אלה נמצאים בשימוש נרחב עבור בדיקות רעילות של ננו וכימיקלים. מתוך ארבעת קווי התאים, רק תאי Calu-3 מילאו את כל הדרישות לעיל. התאים יצרו מונולייר עם צמתים הדוקים (איור 3) שנשאר מחסום יציב לאורך זמן כפי שנמדד על ידי TEER, בעוד שקווי התאים האחרים לא יצרו מחסום או הראו ירידה בתפקוד המחסום כאשר הם מתרבים ב- ALI (איור 4). בנוסף, H292 ו- BEAS-2B נטו לגדול יתר על הרה לשכבות תאים מרובות כאשר הם מתורבתים לתקופה ארוכה יותר. פולחן התאים השקוע המסורתי ופולחן ALI היו שונים מאוד, כי אצל החומרים המזינים של ALI היו זמינים רק מהצד הבזולטרלי והתאים נחשפו לתנאים יבשים בצד הקופי. תנאים אלה יכולים לגרום ללחץ על מודלים התא, אשר ניתן לראות על ידי מדידת הכדאיות של התא לאורך זמן. קווי התאים 16HBE, H292 ו- BEAS-2B הראו כולם שחרור LDH מוגבר כאשר הם מתרבים ב- ALI, בעוד שתאי Calu-3 הראו שחרור LDH קל בלבד (איור 5).

לאחר מכן נבדקה תגובת מודל קאלו-3 לחומרים. כחומר שליטה חיובי, LPS ניתנה באמצעות ערפיליות לצד האפי של המודל. המינון שהופקד היה 0.25 מיקרוגרם / ס"מ2. תאי קאלו-3 הראו תגובה לליפוליסכריד (LPS) על ידי עלייה בשחרור LDH ובשחרור אלפא של גורם נמק הגידול (TNF-α)(איור 6).

לבסוף, המונולאייר קאלו-3 נחשף לננו-חומרים של סיליקה קוורץ (DQ12) (IOM, אדינבורו). סיליקה גבישית יכולה לגרום לסיליקוזיס ועלולה גם לגרום לגידולים בריאות. לכן, הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן (IARC) סיווגה סיליקה גבישית כקבוצה I מסרטן אנושי20. מנגנון הפעולה של סיליקה גבישית נחשב באמצעות אינדוקציה של דלקת מתמשכת הנגרמת על ידי משטח תגובתי שלה21,22,23. מספר מחקרי vivo הן בחולדות והן בעכברים מדווחים על אינדוקציה של שינויים דלקתיים והיסטופטולוגיה, כולל גידולים ופיברוזיס, לאחר חשיפה לשאיפה לסיליקה גבישית24,25,26,27,28,29. כל ההשפעות הללו נצפו לאחר חשיפה חוזרת ונשנית ו/או מעקב ארוך טווח. מודל Calu-3 שימש כדי לחקור אם התצפיות ממחקרי in vivo ניתן לחקות באמצעות מודל במבחנה שיכול להיחשף שוב ושוב על עלי.

Calu-3 תאים נחשפו במשך 3 שבועות רצופים, 5 ימים בשבוע, 4 שעות ביום כדי DQ12. המינון שהופקד נמדד באמצעות QCM. המינון המופקד הממוצע היה 120 ng / cm2 ליום, עם מנה מצטברת של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2, בדומה למינונים גרימת השפעה vivo. מאפייני חלקיקים אחרים מוצגים בטבלה 1. לאחר 3 שבועות של חשיפה, DQ12 לא גרם להשפעות משמעותיות ב- TEER, בכדאיות התא ובשחרור חלבון כימותרפי מונוציט 1 (MCP-1), בהשוואה לבקרת האוויר הנקי (איור 7). ככל שצפויה רעילות רבה יותר של DQ12 בהתבסס על נתוני in vivo, תגובתיות החלקיקים נבדקה באמצעות בדיקה תאית על פי הפרוטוקול הממוטב במסגרת GRACIOUS של פרויקט האיחוד האירופי (תוצר 5.3). התגובה של אצוות DQ12 הייתה נמוכה מהצפוי (איור 8), סדרי גודל נמוכים יותר בהשוואה לחלקיקי הבקרה החיוביים פחמן שחור (CB). חוסר תגובתיות זה עשוי להסביר את היעדר תגובת רעילות במודל Calu-3.

figure-results-1
איור 1: תחנת החשיפה האוטומטית (AES).
הדמות השמאלית מראה את החלק החיצוני של הארון עם לוח המגע. ל- AES שלוש רמות עם מודולי חשיפה: הרמה העליונה לחשיפות לאוויר נקי, והרמה האמצעית והתחתונה לחשיפות אירוסול. האיור הנכון מציג את מודול החשיפה שבו ממוקמים תוספות עם תאים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ייצוג סכמטי של כיוונון החשיפה.
משמאל לימין: 1) המתלה ENM מחובר זרבובית ספריי באמצעות משאבה peristaltic; 2) באמצעות אוויר דחוס זרבובית ספריי ערפילית המתלים ENM ובאמצעות תא ערבוב האירוסולים מובלים AES; 3) רגע לפני הכניסה ל- AES, מכשירי אפיון אירוסול מחוברים: SMPS, OPS, CPC ו- TEOM. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תמונה מייצגת של תאי Calu-3 לאחר שהתבצבות בממשק הנוזלי-אוויר (ALI) למשך 10 ימים.
פלואורסצנטי מיקרוסקופיה תמונה של תאים Calu-3 לאחר culturing ב ALI במשך 10 ימים. חלבון צומת הדוק ZO-1 מוכתם בירוק, גרעינים של התאים מוכתמים בכחול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: התנגדות חשמלית טרנספיתליאלית (TEER) של ארבעה קווי תאים שונים במהלך תקופת תרבות של 21 ימים.
ערכי TEER של 16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B כאשר הם מתורבתים במשך 21 יום: 7 הימים הראשונים שקועים, ולאחר מכן 14 ימים ב- ALI. ערכי TEER תוקנו עבור התנגדות הרקע של ההוספה והוכפלו על-ידי שטח הפנים של ההוספה. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של שש הוספות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: שחרור LDH של ארבעה קווי תאים שונים במהלך תקופת תרבות של 21 ימים.
שחרור LDH של 16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B כאשר הוא מתורבת במשך 21 ימים: 7 ימים שקועים, ואחריו 14 ימים ב- ALI. ערכי LDH המוצגים הם יחסיים למהדורת LDH המרבית לכל סוג תא. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של חמש הוספות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: השפעות תאיות בתאי Calu-3 החשופים ל- LPS.
תאים Calu-3 נחשפו באמצעות ערפילית ענן ל 0.25 מיקרוגרם / ס"מ2 LPS. (A)המרת WST-1. (B)שחרור LDH. (C)שחרור TNF-α לאחר חשיפה LPS. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים ערכים ממוצעים וסטיות תקן של שלוש הוספות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: השפעות תאיות בתאי Calu-3 החשופים לננו-חומרים DQ12.
Calu-3 תאים נחשפו במשך 3 שבועות (4 שעות ליום, 5 ימים בשבוע) כדי DQ12 nanomaterials, על 120 ng / cm2 ליום, מינון מצטבר של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2. (A) ערכי TEER. (B)שחרור LDH. (C)MCP-1 שחרור לאחר חשיפה DQ12. כל הסימנים וקווי השגיאה מייצגים ערכים ממוצעים וסטיות תקן של שלוש הוספות עבור הפקדים ושש הוספות עבור החשיפה ל- DQ12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: תגובתיות תאית של DQ12.
DQ12 היה דגירה עם 2ʹ,7ʹ-Dichlorofluorescein Diacetate (DCFH-DA) בדיקה כדי לזהות תגובתיות פני השטח שלה. כשליטה חיובית, חלקיקי פחמן שחור (CB) נכללו. בהשוואה ל- CB, DQ12 יש תגובתיות משטח נמוך מאוד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מסת חלקיקים (μg/m3)מספר חלקיקים (#/cm3)גודל חלקיק ניידות (nm)סטיית תקן גיאומטריתגודל חלקיק אופטי (μm)
2969 (418)83983 (10215)66.62.51.1 (1.3)

טבלה 1: מאפייני חשיפה DQ12. ערכים מוצגים כממוצע עם סטיית תקן בסוגריים מרובעים.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים תחת ALI וחשיפת מודל הסימפונות הזה לתרסיסים או גזים. היתרון של שימוש בתאי Calu-3 הוא שהם יוצרים צמתים הדוקים, נשארים מונולאייר, מסוגלים לעמוד בזרימת האוויר, וניתן לתרבת במשך שבועות ב- ALI, בניגוד לסוגי תאים רבים אחרים (למשל, 16HBE, H292 ו- BEAS-2B). שימוש בתחנת החשיפה האוטומטית® VITROCELL (AES) יש את היתרון כי התאים יכולים להיחשף בתנאים מציאותיים ורלוונטיים כמו ריכוזים נמוכים ניתן להחיל באמצעות זרימת אוויר רציפה.

מערכות זרימה מתמשכות, כגון AES, יש יתרונות לעומת שימוש במערכות ענן3,32, אשר משתמשים ערפילית אחת של השעיה. הזרימה הרציפה מציאותית יותר ומשתנים רבים כמו קצב זרימה, לחות וטמפרטורה נשלטים. בנוסף, ניתן לשפר את התצהיר באמצעות שדה חשמלי. לבסוף, מאפייני תרסיס כמו גודל, ריכוז מספרים ומסה מנוטרים באינטרנט. החיסרון הוא שמערכות זרימה מתמשכות מורכבות יותר בהשוואה למערכות ענן. לכן, חשוב להפעיל ניסויי הכנה המתמקדים במאפייני החלקיקים של התרסיס והמינון המועבר על הכנס. ריכוז ההתחלה הראשוני של החלקיקים והגדרות AES לאחר מכן ניתן להתאים כדי להשיג את המינון הרצוי על התאים33. בהתאם לסוג החלקיקים הנבדקים, שיטת ייצור התרסיס יכולה להיות שונה. השימוש בתצהיר אלקטרוסטטי תלוי בסוג החלקיקים ופועל בצורה הטובה ביותר עבור חלקיקים מתכתיים. עבור חלקיקים עם מטען משטח חיובי שדה אלקטרוסטטי שלילי צריך להיות מיושם ולהיפך.

בחירת ריכוזי חשיפה יכולה להיות קשה עבור כל ניסוי חשיפה לנוזל אוויר. עבור חשיפות DQ12, המטרה הייתה להשיג מינון מצטבר כולל של 1 מיקרוגרם / ס"מ2 לאחר 3 שבועות חשיפה, 5 ימים בשבוע, 4 שעות ליום. מינון זה דומה מינונים שגרמו השפעה vivo21,25,27,32,33. בעת ביצוע החשיפות, הייתה שונות מסוימת בין ימי חשיפה שונים. למרות המינון שהופקד בפועל של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2 הוא גבוה יותר מאשר 1 מיקרוגרם / ס"מ2 כי היה מיועד, המינון יכול להיות נמוך מדי כדי לצפות בהשפעות במודל Calu-3. רק הבדלים קלים בתגובת TEER, הכדאיות והציטוקינים נצפו בין החשיפה לאוויר נקי לחשיפה ל-DQ12, והבדלים אלה לא היו מובהקים סטטיסטית. הסבר לתצפית כי חשיפה DQ12 במשך 3 שבועות לא לגרום השפעות משמעותיות בתאי Calu-3 היא כי מקרופאגים היו חסרים ממודל Calu-3. ייתכן, לאחר DQ12 ספיגת מקרופאגים לייצר ציטוקינים proinflammatory שעלולים להשפיע על תאים Calu-3. הסבר נוסף הוא כי אצווה DQ12 ששימש לניסויים לא היה תגובתי כצפוי. בעת שימוש ב- LPS כחומר בקרה חיובי, Calu-3 מראה תגובה, כפי שנמדד על ידי עלייה במהדורת LDH ועלייה במהדורת TNF-α. הדבר מצביע על כך שהמודל יכול לזהות רעילות.

מודל התא Calu-3 יש יתרונות רבים, כפי שנדון בסעיף התוצאות. יתר על כן, כאשר תרבותי במשך זמן רב יותר ב ALI, התאים Calu-3 יכול לגדול מבנים דמויי ריסים / ריסים13 לייצר ריר11,12,13. למרות יתרונות אלה, למודל יש מגבלות ביחס לרלוונטיות הפיזיולוגית שלו. קווי התא Calu-3 מקורם אדנוקרצינומה, ואילו 16HBE ו BEAS-2B מקורם רקמה בריאה. למרבה הצער, השניים האחרונים אינם מתאימים לחשיפה חוזרת ונשנית של ALI מכיוון שהם אינם נשארים מונולייר יציב לאורך זמן. מגבלה נוספת של מודל Calu-3 היא שהוא מייצג רק סוג תא יחיד. בריאה האנושית קיימים סוגי תאים מרובים המקיימים אינטראקציה ומגיבים באופן שונה לחשיפה. חלקיקים בשאיפה יפקידו באזורים שונים של הריאות בהתאם לגודל האווירודינמי שלהם. כאן החלקיקים יוצרים קשר עם מחסום תא האפיתל, כפי שמחקה מודל קאלו-3. בריאה האנושית, מקרופאגים מכתשיים נמשכים לחלקיקים, בולעים אותם ומנקים אותם מהריאות. מקרופאגים גם ממלאים תפקיד חיוני בתגובה הדלקתית לחשיפה לחלקיקים. לכן, נעשים מאמצים להרחיב את מודל Calu-3 על ידי הוספת מקרופאגים ראשוניים כדי לחקות את מחסום הריאות מקרוב יותר. החיסרון של מקרופאגים הוא שהם נשארים קיימא רק במשך כ 7 ימים כאשר תרבותי על גבי תאים Calu-3 ב ALI. לכן, יש לקרוא מקרופאגים מדי שבוע כדי להפוך את מודל Calu-3 הנוכחי למודל שיתוף פעולה. אופטימיזציה של פרוטוקול coculture הוא כרגע מתמשך.

בהתחשב לעיל, מודל הסימפונות Calu-3 הוא מודל מתאים לחשיפה חוזרת ונשנית אירוסולים של חומרים מסיסים חלקית כגון כימיקלים מעשן סיגריות LPS. חומרים מסיסים אלה לגרום לעלייה משמעותית בתגובות ציטוקינים בתאי Calu-3. לבדיקת חלקיקים בלתי מסיסים כגון פליטת דיזל ו- DQ12, יש צורך במודל קוקולטורה, מכיוון שהמאקרופאג'ים ממלאים תפקיד מכריע באינדוקציה של אפקטים על ידי חשיפה לחלקיקים.

לחשיפות המתוארות, נעשה שימוש בקרומים עם נקבוביות 3.0 מיקרומטר. הסיבה העיקרית לבחירת סוג זה של הכנסה היא כי ניתן לבדוק את טרנסלוקציה של ננו. בעת שימוש קטן יותר 0.4 מיקרומטר נקבובית גודל, agglomerates חלקיקים לא יוכלו לחצות את קרום הכנס. החיסרון בשימוש בגודל נקבובי גדול הוא שהתאים זקוקים לזמן ארוך יותר כדי לגדול במקביל וכי קשה יותר לדמיין את המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופיה קלה. כדי לבדוק שהתאים אכן יוצרים קו monolayer של מפגש, על ה- TEER להיות >1,000 Ω x ס"מ2 לפני תחילת החשיפה.

יחד, מודל הסימפונות Calu-3 המוצג כאן מתאים לשימוש לחשיפה חוזרת ונשנית לתרסיסים, לפחות עד 3 שבועות. המודל יכול לעמוד להיות תרבותי וחשוף באמצעות זרימת אוויר רציפה והוא מסוגל לזהות רעילות אפיתל הסימפונות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו ממומנת על ידי סיורים פרויקט האיחוד האירופי (כלים מעוגנים פיזיולוגית עבור סיכון ננו מציאותי aSsessment) ומשרד הבריאות, הרווחה והספורט ההולנדי (פרויקט V/050012). ברצוננו להודות לד"ר איבון סטאל וד"ר יאן ואן בנת'ם על הביקורתיים שכתבו את כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.01 M NaOHSigma AldrichS5881
0.1M (x10) PBSGibco14200-059
2',7'-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA)Sigma AldrichD6883
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride)Abcamab141525
Amphotericin Bתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ15290
תחנת חשיפה אוטומטיתתאי Vitrocell
WST-1Roche11644807001
צנטריפוגהEppendorf
CPCTSI inc., סנט פול מינסוטה, ארה"ב3022
ערכת זיהוי ציטוטוקסיות LDHRoche11644793001
DQ12IOMננו-חומרים
ELISA Ready-SET-GoFischer Scientific88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2World Precision Instruments Inc., FL, ארה"בEVOM2-STX2
FBS Greiner bio-one758093
מפצל זרימהTSI inc., סנט פול, מינסוטה, ארה"בדגם 3708
פלואורסצאין דיאצטט (F-DA)סיגמא אולדריץ'F7378
HBSSתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ14175
מיקרוסקופ אוראולימפוסCKX41
בקרי זרימת מסהMFC, ברונקהורסט, הולנד
מתנול (דרגה אנליטית)סיגמא אולדריץ'34860
מיקרובאלאנסSartorius, גטינגן, גרמניהME-5
מדיום חיוני מינימלי (MEM) + GlutaMAXThermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAAתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ11140
OPSTSI inc., סנט פול, מינסוטה, ארה"ב3339
עט/סטרפטוקוקוסתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.15140
פנול אדום חינם MEMGibco10500-064
מים טהוריםMerckMilliQ
SMPSTSI בע"מ, סנט פול מינסוטה, ארה"ב3936
זרבובית ריסוסשליק, קובורג, גרמניה
מסנני טפלוןPallR2PJ46
TEOMRupprecht & Patashnick NY, ארה"בסדרה 1400
בקבוק תרבית רקמותThermo Fisher Scientific Inc.690175, 658175 660175
Transwell מוסיףקורנינג3460, 3462
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific Inc.25300
טריפטן כחולסיגמא אולדריץ'T8154
מגיב התפשטות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49(2017).
  2. Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
  3. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32(2009).
  4. Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).
  5. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
  6. Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58(2016).
  7. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
  8. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  9. Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11 (10), 0165225(2016).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  11. Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).
  12. Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576(2019).
  13. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
  14. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).
  15. Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019).
  16. Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
  17. Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. , Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019).
  18. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40(2014).
  19. Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).
  20. Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).
  21. Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23(2018).
  22. Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).
  23. Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).
  24. Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).
  25. Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).
  26. Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58(2014).
  27. Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).
  28. Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).
  29. Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).
  30. Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11(2013).
  31. Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008(2009).
  32. van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).
  33. Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Calu 3

מאמרים קשורים