פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב לניתוח נטל טרשת עורקים בעכברים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות את השפע, המיקום והגודל של נגעים טרשת עורקים בבעלי חיים שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה וניתוח של שמן אדום O מוכתם כולו אבי העורקים נגעים במודל עכבר היפרליפידמיה מפרצת
במאמר זה
סיכום
תקציר
Apolipoprotein E (Apoe)- או קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (Ldlr)-עכברים היפרליפידמיים לקויים הם שני המודלים הנפוצים ביותר למחקר טרשת עורקים. הם משמשים כדי לחקור את ההשפעה של גורמים גנטיים שונים וסוגי תאים שונים על היווצרות נגע טרשת עורקים, כמו גם לבדוק את הפיתוח של טיפולים חדשים. בידוד, כריתה של אבי העורקים כולו, וכימות של שמן אדום O מוכתם נגעים טרשת עורקים הם שיטות מורפומטריות בסיסיות המשמשות להערכת נטל טרשת עורקים. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה כירורגית ממוטבת, צעד אחר צעד כדי לנתח, perfuse-fix, לבודד, כתם, תמונה ולנתח נגעים טרשת עורקים באב העורקים של העכבר עם שמן אדום O. מכיוון שנגעים טרשת עורקים יכולים להיווצר בכל מקום בכל עץ אבי העורקים, כל שיטת הכתמת שמן אבי העורקים האדומה O יש את היתרון של הערכת לוחות עמוסי שומנים בדם באבי העורקים כולו וכל הענפים בעכבר אחד. בנוסף להכתמת שמן אדום O, אבי העורקים המלאים המבודדים הטריים יכולים לשמש למגוון של הפריה חוץ גופית וניסויים in vivo ובידודי תאים.
מבוא
מחלת לב כלילית, גורם מוביל לתמותה בארה"ב, נגרמת בדרך כלל על ידי טרשת עורקים, תהליך שמוביל להצטברות של פלאק בתוך קירות עורקים1. עכברים אפו- ו- Ldlr-נוטים להיפרליפידמיה הם מרכזיים בחקירות של טרשת עורקים וסיבוכיה ופיתוח הטיפולים2,3,4,5. כימות של נגעים טרשת עורקים מאבי העורקים en face הוא ניתוח נקודת קצה חשוב להערכת ההשפעה של מניפולציה גנטית בסוגי תאים שונים. זה גם עוזר ללמוד טיפולים חדשניים שנועדו להשפיע על ייזום מחלות טרשת עורקים, התקדמות ורגרסיה. נגעים טרשת עורקים יכולים להיווצר בכל מקום באבי העורקים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
mT/mG (מלאי מס ' 007676), ו Apoe-/- (מניות מס '002052) עכברים נרכשו ממעבדת ג'קסון. עכברי Myh11-CreERT2 היו מתנה מסטפן פרובמנס (זמין ממעבדת ג'קסון כמלאי מספר 019079). עכברי Tgfbr2fl/fl התקבלו מהרולד ל. מוזס (אוניברסיטת ונדרבילט). כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ייל.
1. עכברים
- לייצר MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- ו MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרוטוקול זה, נגעים טרשת עורקים בעכברים TGFβR2iSMC-Apoe נותחו לאחר 4 חודשים בדיאטת HCHF7. בנוסף לטרשת עורקים נרחבת, עכברים אלה פיתחו מפרצות אבי העורקים בבית החזה ובבטן, כפי שדווח בעבר. בהשוואה לעכברים אפו-/- עכברים, קירות אבי העורקים של עכברי TGFβR2iSMC-Apoe הראו טרשת עורקים חמורה, מה שמקשה על ניתוח הנגעים (איור 2C,D,E). בנוסף, המפרצות נרחבות במיוחד מתחת לאבי העורקים העל-טבעי, המזכירות מאוד מפרצות אבי העורקים האנושיות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Apolipoprotein E (Apoe) ו צפיפות נמוכה ליפופרוטאין קולטן (Ldlr) עכברים לקויים שימושיים לחקר פיתוח וטיפול של טרשת עורקים. חוקרים יכולים להעריך את ההשפעה של גנטיקה ומניפולציות טיפוליות על ייזום מחלות הקשורות לטרשת עורקים, התקדמות ורגרסיה באמצעות מכתם שמן אדום O של אבי העורקים כולו. שמן אבי העורקים אדום O כתמים וכימות נגע הוא נקודת הקצה הסטנדרטית זהב למחקר טרשת עורקים. טכניקה זו היא זולה ואינה דורשת ציוד מיוחד10. עם זאת, זה לא קל להשיג באיכות גבוהה שמן אדום O.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה, בין השאר, על ידי קונסורציום ביולוגיה משותף Microgrant שסופק תחת מענק NIH P30AR070253 (P.-Y.C.), ו HL135582 (MS. ). אנו מודים לר' וובר ול.ל. קון על תחזוקת העכברים המשמשים במחקר זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 מ"ל צינור אפנדורף | DENVILLE | C2170 | |
| 10 מ"ל מזרק | BD | 302995 | |
| 16% פורמלדהיד | Polysciences | 18814-10 | |
| 70% אתנול | VWR | RC2546.70-5 | לניקוי כלי החיתוך |
| שעוות דיסקציה שחורה | CR Scientific | C3541 | |
| שמן תירס | סיגמא | C8267 | ממס לטמוקסיפן |
| DNeasy דם & ערכת רקמות | QIAGEN | 69506 | לבידוד DNA מאוזן העכבר |
| Dulbecco' s תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (1X DPBS), pH 7.4 | Gibco | 14190-144 | |
| מספריים עדינים | כלי מדע עדינים | 14059-11 | כדי לחתוך את עור העכבר ולפתוח את כלוב הצלעות |
| Fisherbrand Economy שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה | פישר סיינטיפיק | 12-550-A3 | |
| דיאטה עתירת כולסטרול עתירת שומן | דיאטות מחקר | D12108 | כדי לגרום לטרשת עורקים |
| הדמיה תוכנה | המכונים הלאומיים לבריאות | תמונה J | כימות נגע אבי העורקים |
| איזופרופנול | VWR | JT9079-5 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | כדי לנקות את שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית |
| McPherson-Vannas מספריים קפיציות מיקרו חיתוך | ROBOZ | RS-5602 | כדי להפריד בין הלב לאבי העורקים ולחתוך את ענפי |
| אבי העורקים ואבי העורקיםתוכנת בקרת מיקרוסקופ | Olympus DP בקר | להדמיית אבי העורקים | |
| סיכות Minutien | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| מחט-25G | BD | 305124 | |
| ספוג לא ארוג | McKesson | 94442000 | |
| שמן אדום O | Sigma | O-0625 | כדי להכתים את נגעי טרשת העורקים |
| Pall Acrodisc מזרק סטרילי מסננים עם סופר ממברנה | VWR | 28143-312 | לסינון עובד שמן אדום O |
| פתרון מספריים קפיץ | כלים מדעיים | עדינים 15021-15 | לנתח ולנקות את אבי העורקים |
| תוכנה סטטיסטית | GraphPad | Prism 8 | ניתוח סטטיסטי |
| סטריאומיקרוסקופ | ניקון | SMZ1000 | לדיסקציה של אבי העורקים |
| סטריאומיקרוסקופ | אולימפוס | SZX16 | להדמיית אבי העורקים |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | כדי לגרום לרקומבינציה של Cre-loxP |
| Tissue-Tek O.C.T Compound, Sakura Finetek | VWR | 25608-930 | |
| פינצטה בסגנון 4 | מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים | 0302-4-PO | כדי לחתוך את עור העכבר ולפתוח את כלוב הצלעות |
| פינצטה סגנון 5 | מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים | 0302-5-PO | לנתח ולנקות אבי העורקים |
מקורות
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
- Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Plump, A. S., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
