מאמר שיטה

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

DOI:

10.3791/61651

⸱

10 בספטמבר 2020

 , 
1Department of Entomology, The Ohio State University, 2Insect Transformation Facility, Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9 משמש יותר ויותר כדי לאפיין את תפקוד הגנים באורגניזמים שאינם מודל. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור שורות נוק-אאוט של Culex pipiens, מהכנת תערובות הזרקה, להשגה והזרקה של עוברים יתושים, כמו גם כיצד לגדל, לחצות, מסך מוזרק יתושים וצאצאיהם עבור מוטציות הרצויות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתושי קולקס הם הווקטורים העיקריים של מספר מחלות המשפיעות לרעה על בריאות האדם ובעלי החיים, כולל וירוס הנילוס המערבי ומחלות הנגרמות על ידי נמטודות פילריות כגון תולעי לב של כלבים ופילהזיס. לאחרונה, עריכת הגנום CRISPR/Cas9 שימשה כדי לגרום למוטציות מכוונות אתר על ידי הזרקת חלבון Cas9 שהיה מורכב עם RNA מדריך (gRNA) לעוברים טריים של כמה מיני חרקים, כולל יתושים השייכים לג'נרה אנופלס ו- Aedes. מניפולציה והזרקת יתושי Culex הוא קצת יותר קשה כמו יתושים אלה להטיל את ביציהם זקוף רפסודות ולא בנפרד כמו מינים אחרים של יתושים. כאן אנו מתארים כיצד לעצב gRNAs, מורכבים אותם עם חלבון Cas9, לגרום יתושים נקבות של Culex pipiens להטיל ביצים, וכיצד להכין ולהזריק עוברים שהונחו לאחרונה עבור microinjection עם Cas9 / gRNA. אנו גם מתארים כיצד לגדל ולמסך יתושים מוזרקים למוטציה הרצויה. התוצאות הייצוגיות מראות כי טכניקה זו יכולה לשמש כדי לגרום מוטציות מכוונות אתר בגנום של יתושי Culex, עם שינויים קלים, ניתן להשתמש כדי ליצור מוטציות null גם במינים אחרים יתושים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתושי קולקס מופצים ברחבי האזורים הממוזגים והטרופיים של העולם ומעבירים מספר וירוסים קטלניים כולל וירוס הנילוס המערבי1, דלקת המוח סנט לואיס2, כמו גם נמטודות פילריות הגורמות לתולעת לב כלבים3 ופיליאזיס4. חברי מתחם Culex pipiens, הכולל Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens ו- Cx. pipiens molestus, מראים וריאציות בולטות בהיבטים רבים של הביולוגיה שלהם. לדוגמה, בעוד Cx. quinquefasciatus ו Cx. pipiens molestus אינם מסוגלים להיכנס לתרדמת overwintering5,6, Cx. pipiens pipiens להציג תגובות עונתיות חזקות ולהיכנס diapause בתגובה לימים קצרים7,8. בנוסף, Cx. pipiens molestus נוטים להיות אנתרופופיליים יותר בעוד Cx. pipiens ו Cx. quinquefasciatus הם יותר זופילי6. עם זאת, בארצות הברית ובמקומות רבים אחרים בעולם, מינים אלה שזורים זה בזה, אשר יש השלכות חזקות על העברת מחלות כמו כלאיים של Cx. pipiens pipiens ו Cx. פיפיינס molestus הם מזינים אופורטוניסטיים והם לנשוך הן ציפורים ובני אדם9, ובכך לשמש וקטורים גשר עבור וירוס הנילוס המערבי. לימוד היבטים מרתקים אלה ואחרים של הביולוגיה של יתושי קולקס הופרע, בין היתר, משום יתושי קולקס מעט יותר קשה לגדל במעבדה מאשר יתושי Aedes, המייצרים ביצים עמידות בפניייבוש וייבוש 10 ומכיוון שכלים מולקולריים פונקציונליים אינם מפותחים באותה מידה עבור מינים קולקס.

עריכת הגנום CRISPR/Cas9 היא טכנולוגיה רבת עוצמה ששימשה להערכת הביולוגיה של מספר מיני יתושים חשובים11,12,13, כולל יתוש הבית הדרומי, קולקס קווינקפסיאטוס14,15,16. טכנולוגיה זו, שפותחה על ידי ג'ניפר דודנה ועמנואל שרפנטייה, מנצלת הגנה חיידקית טבעית מפני וירוסים על ידי אנדונקולאזים הקשורים ל- CRISPR (חלבוני Cas; ראו סקירה של ואן דר אוסט ואח '17). כאשר מוזרקים לעוברים מן החי, חלבוני Cas9 בשילוב עם RNA מדריך מתאים יכולים לייצר הפסקות כפולות בתוך הגנום. זה נעשה לעתים קרובות ביותר באמצעות חלבון Cas9 המורכב עם RNAs מדריך, אשר מכוון פעילות אנדונוקלאז לאזור מסוים של הגנום. לאחר שחלבון Cas9 יצר הפסקה כפולה ספציפית לאתר, המכונות התאיות מנסות לתקן את ההפסקה באמצעות אחד משני מנגנונים. הראשון כרוך קשירת שני הקצוות יחד באמצעות הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), אשר נוטה לשגיאה ולעתים קרובות מייצר כניסות ומחיקות מחוץ למסגרת בגנום שיכול לגרום חלבונים לא פונקציונליים, ובכך ליצור מוטציה נוק-אאוט. לחלופין, המכונות הסלולריות עשויות להשתמש בתיקון מונחה ההומולוגיה (HDR) על-ידי מציאת רצפים דומים כדי לתקן נכון את ההפסקה. רצף דומה עשוי להיות מסופק על ידי הכרומוזום השני בתוך האורגניזם (ראה סקירה18). עם זאת, אם הרצף המתוקן מתאים בדיוק לרצף המקורי, חלבון Cas9 יוכל שוב לחתוך את הדנ"א. לחלופין, החוקרים יכולים לכלול גם פלסמיד תורם המכיל רצפים הומולוגיים משני צדי אתר החיתוך של רצף היעד עם רצף תיקונים חלופי – לעתים קרובות חלבון סמן פלואורסצנטי, גרסה שונה של הגן המקורי או שינוי אחר – שניתן להעתיק ולהכניס לגנום, או "דפק פנימה".

תזמון הוא קריטי בעת הזרקת עוברים, וזה במיוחד המקרה בעת שימוש עריכת הגנום CRISPR /Cas9 כדי ליצור מוטציות בחרקים. הסיבה לכך היא שלחלבון Cas9 ול-gRNAs יש את היכולת הגדולה ביותר ליצור מוטציות רק כאשר העובר נמצא במצבו הסינכיציאלי, לפני שנוצרים ממברנות תאיות וכאשר גרעינים מרובים נגישים בתוך העובר. עבור יתושים, גרעינים להגיע לפריפריה ~ 2-4 שעות לאחר oviposition, בהתאם לטמפרטורה19, ולכן microinjection מוצלח חייב להתרחש לפני הפעם. בנוסף, חלבון Cas9 יחתוך כל DNA גרעיני שהוא יכול לגשת אליו, כך הפרט הנובע ההזרקה יכיל פסיפס של תאים, חלקם בעלי המוטציה הרצויה, ואחרים לא. על מנת שהמוטציות הללו יירשו בהצלחה, חלבון Cas9 חייב לחתוך DNA השוכנים בקו הנבט שיוליד את הביצים והזרע העתידיים. כדי להבטיח כי מוטציות נוצרות בחיידק עדיף להזריק את כל החומרים קרוב למיקום של תאי הקוטב בתוך העובר, שהם אבותיו של חיידק החרקים. תאי הקוטב ממוקמים ליד הקצה האחורי של עוברים Culex 20. בנוסף להזרקת עוברים, חובה לפתח תוכנית זהירה לחצייה וסינון צאצאים על מנת לזהות את המוטציה הרצויה.

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור gRNAs ולרכב אותם עם חלבון Cas9 להכנת תערובות הזרקה, כמו גם כיצד לגרום יתושים נקבות של פיפיינס Culex להטיל ביצים וכיצד להכין ולהזריק ביצים אלה לעריכת גנום CRISPR / Cas9 בתיווך. בנוסף, אנו מתארים כיצד לגדל, לחצות ולמסך מוזרקים עוברים וצאצאיהם כדי לאשר כי המוטציה הרצויה הושגה. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו מוטציות Null עבור גן של עניין, מחזור, בזן Buckeye של Culex pipiens. זן זה הוקם במקור בשנת 2013 מיתושים שנאספו בשטח בקולומבוס, אוהיו ומתוחזק על ידי מעבדת Meuti. פרוטוקול זה יכול לשמש למחקרים נוספים הדורשים עריכת גנום CRISPR/Cas9 יתושי קולקס, כמו גם מינים אחרים של יתושים, ובאופן כללי יותר, רלוונטי לשימוש בעריכת הגנום CRISPR/Cas9 לכל מיני חרקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברוב מוסדות המחקר, פרוטוקול בטיחות ביולוגית מאושר חייב להיות במקום לפני חרקים מהונדסים נוצרים או נשמרים כדי להבטיח כי אורגניזמים מהונדסים גנטית לא לברוח או להיות מוסרים ממתקן המעבדה. ייתכן שיחולו גם תקנות ממשלתיות נוספות. לפני תחילת פרויקט מסוג זה, בדוק את כל המדיניות והנהלים המוסדיים כדי לקבוע אילו מסמכים ואישורים נדרשים.

1. עיצוב gRNAs והכנת תערובות הזרקה

  1. עצב 2-5 gRNAs עבור כל גן יעד כמו כמה gRNAs לעבוד טוב יותר מאחרים. gRNAs המתמקדים בגן של עניין ניתן לעצב באופן ידני או תוכניות חינם, כגון Chop-Chop, ניתן להשתמש.
  2. פריימרים לעיצוב ולהזמנה שיגבירו שברי 100-200 bp סביב כל gRNA. באופן אידיאלי, האתר לחתוך צריך להיות ממוקם בערך בשליש האמצעי עד מחצית של המוצר PCR. שים לב כמה bp בכל אתר של החתך יופק.
  3. השג gRNAs.
    1. לרכוש gRNAs מחברות מסחריות כגון טכנולוגיות DNA משולבות, פישר סיינטיפיק, Genescript ואחרים. זו האפשרות הקלה ביותר.
    2. לחלופין, ליצור gRNAs במעבדה באמצעות הגברת PCR כדי ליצור את התבניות עבור סינתזה איזותרמית הבאה. ראה הפרוטוקול המתואר על ידי פורט ואח'21 ו Kistler ואח '22.
    3. לספק gRNAs באמצעות plasmid כי הוא מוזרק לתוך עוברים. במקרה זה, gRNA צריך להיות מונע על ידי מקדם U6 (ראה 23,24 לפרטים).
  4. השג את חלבון ה-Cas9.
    1. להזמין Cas9 מסחרי ממספר חברות כולל פישר סיינטיפיק. זו האפשרות הקלה ביותר.
    2. הפוך חלבון Cas9 לטהר במעבדה על פי Basu ואח'25 ו Kistler ואח '22.
    3. הזריקו MRNA Cas9 לעוברים, שם הוא יתורגם מאוחר יותר לחלבון Cas9 פעיל. ניתן לסנתז את ה- MRNA של Cas9 במעבדה באמצעות תמלול במבחנה22 או לרכוש מספקים כגון סיגמא.
      הערה: חלבון Cas9 המתורגם חייב להכיל אות לוקליזציה גרעינית (NLS) על מסוף C, ולכן NLS חייב להיות נוכח גם ב- Cas9 mRNA המוזרק.
    4. חלבון Express Cas9 ב-vivo באמצעות הבעה מבוססת פלסמיד. במקרה זה, עדיף לקבל את הביטוי של Cas9 על plasmid מונע על ידי מקדם עוברי כי כבר מאופיין היטב במיני היעד.
      הערה: עד כה, מקדמים עובריים לא היו מאופיינים היטב יתושי Culex, ולכן הזרקת חלבון מטוהר או Cas9 mRNA מומלץ.
  5. מורכב gRNAs עם חלבון Cas9, מותאם Kistler ואח'22.
    1. אם הזרקת חלבון Cas9 עם ה- GRNA יחד (מומלץ), ודאו שהריכוזים הסופיים של חלבון Cas9 הם 300 ננוגרם/μL והריכוז הסופי של גרם רנ"א יחיד הוא 80 מיקרוגרם/μL. מערבבים את החלבון ואת ה-gRNA הבודד בצינור PCR של 0.2 מ"ל.
    2. דגירה במשך 20 דקות על קרח.
  6. בדיקת gRNAs עם מבחנה במבחנה (למשל, ערכת סינון sgRNA מדריך-it).
    1. להגביר את השברים סביב אתר החיתוך עבור כל gRNA באמצעות PCR.
    2. הפעל את מוצרי ה- PCR על ג'ל כדי להבטיח שהם בגודל הנכון. לאחר מכן, לטהר מוצרי PCR ולרצף אותם כדי להבטיח שהם למקד את אזור הגנים הנכון.
    3. לערבב 200 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר שאריות עם 1 μL של מאגר התגובה Cas9, 1 μL של BSA, 1.5 μL של Cas9:gRNA מורכב ולהביא את נפח התגובה הכולל ל 15 μL. דגירה במשך 5 דקות ב 37 °C.
    4. הפעל את המוצר על ג'ל שוב. אם חלבון Cas9 בהצלחה לחתוך את המוצר PCR, הרצועה העיקרית צריכה להיראות קלוש יותר רצועות קטנות נוספות צריך להיות נוכח. שים לב לירידה בגודל של מוצר PCR המקורי, ואם תרצה, לחשב את הירידה בעוצמת הרצועה כדי להעריך את יעילות החיתוך.
  7. הכנת תערובת ההזרקה הסופית
    1. עבור כל gRNA שחתך בהצלחה את מוצר ה- PCR הממוקד שלו, ערבבו נפחים של כל Cas9 ו- gRNA לצינור 0.5 מ"ל, כך שהנפח הסופי יישאר 300 ng/μL של חלבון Cas9 ו- 80 ננוגרם / μL של כל gRNA.
    2. יש לאחסן את ה-Cas9 וה-gRNAs המורכבים במהירות של -80 °C (70 °F) עד להזרקה.

2. משיכה ושיפעול מחטים

הערה: זריקות מוצלחות והישרדות העוברים דורשות מחטים חדות(איור 1).

  1. השתמש במיקרו-קפילריה של בורוסיליקט בקוטר חיצוני בקוטר 1 או קוורץ. סיליקון microcapillaries במכסה המנוע אדים כימי לפני שנמשך.
    1. בקצרה, מניחים 3 מל של סיגמקוט לתוך זכוכית ואקום לצייר לתוך שנייה המכילה microcapillaries זכוכית לפחות 4 שעות, המאפשר פתרון סיליקון לאדות להתיישב על כל המשטחים של microcapillaries.
    2. לאחר מכן, לאט לאפשר לתא הוואקום להשוות ללחץ הסביבה על ידי פתיחה הדרגתית של שסתום stopcock ומאפשר אוויר לחזור לתא. המחטים מוכנות למשיכה.
    3. קרא תמיד את מדריך ההוראות של מושכי מחטים לפני השימוש.
      הערה: ההוראות שלהלן מפרטות כיצד להשתמש P-2000 לייזר מחט פולר למשוך מחטי זכוכית. חשוב לציין כי כל מושכי מחט אפילו של אותו מותג אינם מכוילים למשוך בדיוק את אותה מחט על פני יחידות שונות. המפתח להשגת מחטים טובות הוא להתחיל בערכה נתונה של פרמטרים ואז למשוך מחטים באמצעות פרמטרים שהם מעל ומתחת לערכים אלה. בדוק את המחטים בכל אחד מהפרמטרים האלה על ידי הערכת כמה טוב המחט חודרת עוברים וכמה טוב תערובת ההזרקה זורמת מהמחט. לחדד את הפרמטרים עד מחט מתקבל כי קל לפתוח או שיפוע, זה פירסינג עוברים בצורה חלקה וזה מספק הזרקה לערבב בקלות.
  2. משיכת מחטים באמצעות P-2000 מחט לייזר מושך
    1. הפעל את מושך מחט הלייזר ולאפשר לייזר להתחמם במשך 15 דקות לפני המשיכה הראשונה.
    2. לתכנת את המכונה עבור סוג של צינור microcapillary זכוכית (זכור כל פרמטרי משיכת מחט הם נקודת התחלה מאז פולטי מחט אינם מכוילים לייצר את אותה מחט על פני כל המושך):
      קוורץ: חום = 730; פיל = 4; Vel = 40; דל = 122; פול = 156
    3. לאחר תכנות מושך המחט, לטעון microcapillary ומהדק אותו במקום, דואג רק לגעת בקצה הצינור microcapillary ולא את האזור כי יהיה מחומם על ידי הלייזר.
    4. לאחר הידוק המיקרו-קפילארי, הניחו את האגודל והאצבע על מוטות האצבעות ואז שחררו את מוטות המשיכה על ידי לחיצה על המעיין משחרר אחד בכל פעם.
    5. לסחוט אגודל ואפרף כדי למשוך את הסורגים באופן מלא יחד.
    6. מקם את הצד השני של הצינור microcapillary מהדק שלה, כך שחלק קטן של הצינור משתרע משני הצדדים. הדקו את המלחציים וודאו ששני המלחציים צמודים באצבעות ושהם מחזיקים את "מוטות המשיכה" במקומם.
    7. סגור את תכריכי המגן על הממשוך.
    8. לחץ על כפתור המשיכה והלייזר יתחיל לחמם את הזכוכית, המצוינת באור "לייזר דולק" האדום הממוקם מתחת לתכריכים. המשיכה הושלמה כאשר מוטות המשיכה מופרדים לחלוטין, מלווים בחבטה מתכתית.
    9. ודא כי אור "לייזר על" אינו מואר לפני הרמת התכריכים.
    10. החזק את הקצה הקטן של הצינור microcapillary המשתרע מעבר למהדק עם אגודל ואפרף ולשחרר את המהדק. ואז להרים את הצינור microcapillary מתוך מהדק.
    11. השתמש במלקחיים כדי למקם בזהירות את הצינור microcapillary לתוך צלחת פטרי מרובע מרופד בסרט דו צדדי. ודא בעת הנחת המחט לתוך תיבת ההחזקה כי הקצה האחורי של המחט נוגע ראשון ואת המחט הוא הוריד בעדינות למקומו, כך הקצה החד לא ניזוק.
  3. משיכת מחטים באמצעות PC-10/PC-100-משיכת מחטים
    1. הגדר את מושך PC-10 באמצעות 4 משקולות והגדר את הטמפ'ר ל- 50 °C (50°F) עבור משיכה של שלב אחד.
    2. מניחים מיקרו-קפילארי מזכוכית בורוסיליקט לתוך המהדק העליון. לאחר מכן הרימו את המהדק התחתון המשוקלל למקומו והידקו את החלק התחתון של המיקרו-קפילארי, ודאו כי הנימי נמצא בעמדה למשוך שתי מחטים טובות. זהו מחזור משיכה ארוך למדי, אבל זה מייצר מחטים טובות עבור שיפוע.
  4. מחטים משופעות.
    הערה: שיטה זו של שילול רטוב נותנת משוב בזמן אמת על גודל הפתיחה היחסי של המחט.
    1. להרכיב את הצלחת שוחקת ואת טבעת שמירה של משופע המחט. ודאו שהצד האפור של הלוח השחוק מכוון כלפי מעלה בין טבעת התמך העליונה והתחתון. הדקו את הברגים בטבעת התמרה, לסירוגין מבורג לבורג כדי להבטיח שכל בורג מתהדק באופן שווה. הצלחת השוחקת וטבעות התמרה ייקראו להלן הרכבת הטחינה.
    2. מניחים 13 טיפות (~ 520 μL) של שמן הדוכן על המשטח השטוח האופטי, ולאחר מכן מניחים את הרכבת הטחינה על גבי הצלחת. הנח את ההרכבה מתחת למיקרוסקופ ניתח ולאחר מכן הפעל את המשענת. קצת שמן נוסף לעומת ההמלצה של סאטר משמש, כמו זה שומר על צלחת שוחקת מסתובבת לתקופה ארוכה יותר כאשר נעשה שימוש בשילוב עם שיטת שילול רטובה זו.
    3. הוסיפו 1% פתרון Photo-Flo למשטח הטחינה והעבירו את הפתיל למיקום כך שהוא שקוע בתמיסת פוטו-פלו.
    4. תדליק את האוויר במקור הראשי. לאחר מכן מניחים מחט בורוסיליקט משוך לתוך המחזיק ומהדקים את טבעת התמך. הפעל את האוויר על הרגולטור ולהגדיל עד הלחץ הגיע 26 PSI.
    5. צופה מהצד, להוריד את המחט באמצעות ידית ההתאמה גסה עד שהוא כמעט נוגע במשטח נוזלי Photo-Flo.
    6. התאם את המיקרוסקופ כדי לאתר את המחט בשדה הראייה. התחל בהגדלה הנמוכה ביותר והגדל את ההגדלה. להתאים בזהירות את המיקום של המחט באמצעות ידית הכוונון גס עד שהוא רק נוגע פני השטח של נוזל Photo-Flo.
    7. באמצעות ידית ההתאמה גסה וממשיך להסתכל מתחת למיקרוסקופ, להוריד את המחט עד שהוא קרוב למשטח שוחק אבל לא נוגע בו.
    8. באמצעות ידית ההתאמה העדינות, בזהירות ובאיטיות להוריד את המחט, לשים לב היטב למחט ואת הצל זה משאיר על פני השטח שוחק של השילול. כאשר המחט והצל שלה נראים כאילו הם עומדים לגעת במשטח השחוק, המשיכו להוריד את המחט אפילו לאט ובזהירות רבה יותר.
    9. לסירוגין בין לתת למחט "שיפוע" על ידי הורדתו על פני השטח שוחקים, ולאחר מכן להרים אותו. לפני הרמת המחט, שים לב במהירות את ההגדרה על המיקרומטר על ידית ההתאמה העדינות, כך שניתן יהיה להוריד את המחט לאותה תנוחה או, במידת הצורך, למיקום מעט נמוך יותר. זכור לשמור את המחט מתחת לשכבה הנוזלית פוטו-פלו. לאחר המחט כבר הרים מעל פני השטח שוחק, לעצור ולהפעיל מחדש במהירות את הסיבוב של השיפוע כדי לבדוק בועות. אם המחט כבר משופע כראוי, בועות אוויר צריך לזרום מתוך המחט לתוך פוטו-פלו. אם הצלחת לא נעצרה, סביר להניח שהבועות לא יהיו גלויות עד שפתיחת המחט תהיה גדולה מדי.
    10. אם לא מופיעות בועות כאשר המחט מורמת מעל פני השטח השוחקים והשופע נעצר, חזור על הליך השופע, הורדת המחט למיקום מעט נמוך יותר על המיקרומטר הממוקם על ידית ההתאמה העדינות, הרמת המחט, עצירת צלחת השופע ובדוק בועות אוויר. חוזרים על הפעולה עד שיופיע זרם קטן אך יציב של בועות.
    11. לאחר בועות אוויר נוכחים, לבדוק את גודל הפתיחה היחסי על ידי עצירת הצלחת שוחקת והורדת לחץ האוויר, וציין את PSI שבו היווצרות בועה מפסיק, שכן זהו אינדיקציה יחסית לגודל של פתיחת המחטים משופעות. ככל שהלחץ נמוך יותר שבו האוויר מפסיק לברוח מקצה המחט, כך פתח המחט גדול יותר. מחטים משופעות עד לנקודה שבה בועות מפסיקות לברוח מהמחט ב 18-20 PSI מציין כי המחט יש פתח קטן יחסית צריך לגרום נזק מינימלי לעובר כאשר נעשה שימוש microinjections.
    12. לאחר בדיקת פתיחת המחט, להגביר את לחץ האוויר ל 26 PSI כדי למנוע נוזל מלהיכנס למחט. לאחר מכן הרימו את המחט מעלה ומחוץ לשכבת Photo-Flo באמצעות ידית ההתאמה המחוספסת. חשוב לציין כי כל עוד האוויר זורם מתוך המחט Photo-Flo אינו נכנס למחט, ולכן החלק הפנימי של המחט מוגן מפני זיהום.
    13. ברגע שהמחט יוצאת מהפוטו-פלו, כבה את האוויר והסר את המחט ממחזיק המחט.
    14. בעזרת מלקחיים, מניחים את המחט המשופעת החדשה בצלחת פטרי שיש לה סרט דביק דו צדדי או חימר דוגמנות כדי לשמור אותה במקומה. חזור על התהליך עד 10-20 מחטים משופעות כבר מיוצרים.

3. האכלת דם הדור ההורי של יתושים

  1. זחלים אחוריים של יתושי Cx. pipiens בתנאי יום ארוכים חד משמעיים (>13 שעות של אור ליום) ב 25-27 °C (27 °F) כדי להבטיח כי יתושים לא להיכנס רדום overwintering שלהם או דיאפזה.
  2. שבעה עד עשרה ימים לאחר הופעת השיא של המבוגרים, הכינו את מערכת ההזנה של קרום המוטק על ידי חיבור יחידות החימום לאספקת החשמל. התאם את הטמפרטורה של כל יחידה ל 37 °C (טמפרטורת הגוף הפנימית האנושית) או 41 °C (טמפרטורת הגוף הפנימית עוף) באמצעות בורג ההתאמה בחלק העליון של היחידה. ודא כי הטמפרטורה הנכונה כבר הגיע באמצעות מדחום חשמלי.
  3. הכינו את מאגר ארוחות הדם להאכלה.
    1. חותכים ריבוע אחד של parafilm עבור כל גליל האכלת דם, ולשפשף parafilm על רגליים יחפות. זה מספק ריחות אטרקטיביים ליתושים.
    2. למתוח את parafilm דק ככל האפשר, ולעטוף את הקצוות בחוזקה סביב מאגר הארוחה. אם תרצה, יש לאבטח במקום עם טבעת גומי O.
    3. הוסיפו כ-200 מיקרו-אל של תמיסת ATP של 0.1 M ל-15 מ"ל של דם עוף טרי או מופשר שלם, שטופלו בצייטר. ה- ATP מסייע להמריץ האכלה בדם, ונתרן ציטוט מונע מהדם להקפיץ.
    4. החזק את המאגר כך שצד הפרפילם פונה כלפי מטה, והשתמש בזהירות בפיפטה חד פעמית כדי למלא את המאגר. כל מאגר מכיל ~ 3 מ"ל של דם. אוטמים את יציאות המילוי בתקעים מפלסטיק.
    5. בורג מאגרי הארוחות לתוך יחידות החימום ומניחים על גבי כלוב היתושים כך שצד parafilm פונה כלפי מטה ואת היתושים יכולים להאכיל דרך הרשת.
  4. לכסות את הכלובים עם שקיות אשפה שחורות כדי לדמות בין הערביים ולנשוף במרץ לתוך כל כלוב כמו ריכוז CO2 מוגבר מגרה האכלה בדם.
  5. שמור את המאכיל על הכלוב במשך 2-8 שעות כדי למקסם את האכלת הדם. בדוק מעת לעת ושים לב לשיעור הנקבות שנטלו ארוחת דם (ניכר על ידי הבטן האדומה והמנופפת שלהן).

4. גרימת הטלת ביצים יתושים בוגרים

  1. ארבעה עד חמישה ימים לאחר האכלת הדם, להכין צינור חרוט 50 מ"ל עבור oviposition יתושים.
    1. צור חור ~ 20 מ"מ ליד החלק התחתון של הצינור החרוט.
    2. לכסות את החור עם שני ריבועים (35 מ"מ2) של גומי סכר דנטלי, אחד עם חריץ אופקי והשני עם חריץ אנכי. השתמש בקלטת כדי לחבר את הריבועים של סכר שיניים לצינור החרוט.
    3. מניחים פיסת נייר סינון 4.25 ס"מ על צלחת פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ והרטיבו את נייר המסנן עם 750 μL של מים מזוקקים.
    4. הפוך את הצינור החרוט על נייר המסנן ולסובב קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח שהוא מאובטח.
  2. השתמש בשאיפה לפה כדי להסיר בזהירות ~ 10 נקבות של Cx. pipiens מהכלוב שלהם ולהעביר אותם לצינור חרוט מוכן.
  3. מניחים גליל אטום מעל הצינור החרוט כדי לספק חושך ליתושים כמו זה מגרה הטלת ביצים, ולחכות 20-25 דקות.

5. מיקרו-מניפולציה ביצי קולקס טריות שהונחו

  1. הכן את השקופית להצמדת עוברים היתושים למיקרו-ינון.
    1. חבר חתיכת סרט דו-צדדי לרוחב של כיסוי.
    2. חבר רצועה דקה של רוטב רפואי שקוף (למשל, Tegaderm, 2-3 ממ רוחב) לקלטת הדו צדדית כך שהוא פועל במקביל לקצה הקצר של זכוכית הכיסוי ומוצב כ -5 ממ מקצה הכיסוי.
    3. הסר עודף סרט דו צדדי עם סכין גילוח חד, ולהסיר 2-3 ממ של ההלבשה הרפואית וסרט דו צדדי מכל קצה של הכיסוי. זה מאפשר שכבה של שמן להישאר על השקופית לאחר הביצים כבר רכוב על הכיסוי.
    4. באמצעות עיפרון שעווה, לצייר צורה "D" סביב סרט דו צדדי רצועה של ההלבשה הרפואית. זה ישמש כמחסום להחזיק את המים סביב הביצים לאחר ההזרקה.
  2. לאחר השקופית כבר מוכן 20-25 דקות חלפו, להסיר את הצינור האטוע ולקבוע אם היתושים הטילו ביצים.
    1. אם לא, לכסות אותם עוד 5-10 דקות.
    2. אם היתושים הטילו ביצים, הרימו בזהירות אך במהירות את הצינור החרוט וכסו בכובע. מניחים את היתושים בכלוב נפרד, ומתעדים את הזמן שבו נאספו ביצים בגיליון אלקטרוני. לאחר מכן להוסיף 50-100 μL של מים DI לנייר המסנן המכיל את רפסודות הביצים.
  3. תחת מיקרוסקופ ניתוח בשורה הביצים.
    1. מקם פיסת נייר סינון (מלבני 10 מ"מ x 30 מ"מ שנחתכו מנייר סינון גס עם קצב זרימה מהיר) תחת זכוכית כיסוי 24 מ"מ x 40 מ"מ כך שזכוכית הכיסוי מכסה 50-60% מהצד השמאלי של נייר הסינון.
    2. הרטיב את נייר המסנן עם 50 μL של מים DI. המים יתפשטו תחת זכוכית הכיסוי לאט, וייצרו מאגר כדי לשמור על נייר המסנן והביצים רטובות במהלך מיקרו-מניב. מניסקוס ייווצר בין זכוכית הכיסוי לנייר המסנן כאשר כמות המים הנכונה מוחלת.
    3. הפרד את הביצים מרפסודות הביצים שלהם באמצעות מברשת צבע עדינה, ומניחים כך שהקצה הצר והאחורי של העובר נוגע בכוס הכיסוי (משמאל) והקצה הרחב יותר, הקדמי, הוא מימין.
    4. ליישר ביצים במשך 20 דקות, בזהירות התבוננות בשינוי צבעם מלבן חלבי לאפור בהיר מאוד. בדוק באופן שגרתי את סרט המים מתחת לכוס הכיסוי כדי להבטיח שיש כמות מספקת של מים. אם נראה שהביצים מתייבשות, הוסיפו כמות קטנה של מי DI (20-30 μL) לנייר המסנן.
    5. לאחר 20 דקות, להשליך את כל הביצים הנותרות.
  4. מעבירים את הביצים למגלשת המיקרו-ינון.
    1. השתמש בפיסת נייר סינון גסה (10 מ"מ x 30 מ"מ) כדי לפתיל מים מצד נייר הסינון הרווי, ולהסיר את נייר המסנן המנדף במלקחיים. חזור על הפעולה 2-3 פעמים כדי להבטיח כי נייר המסנן עם הביצים יבש ככל האפשר.
    2. מניחים מלבן רענן ויבש של נייר סינון ומחזיקים אותו במקומו עם זוג מלקחיים. בזהירות למשוך את הכיסוי שמאלה, הרחק הביצים מיושר.
    3. ייבשו את עודפי המים על הבמה מבלי להפריע לנייר הסינון הקטן המכיל את הביצים המיושרות. המשך לייבש את נייר המסנן הרטוב עם הביצים עוד כמה פעמים, לחיצה על מלבנים קטנים של נייר מסנן עם אגודלים ו / או מלקחיים, כדי להבטיח כי הביצים יבשות ככל האפשר לפני העברתם לשקופית ההזרקה.
    4. באמצעות מלקחיים, להסיר את הנייר גיבוי של רצועה של ההלבשה הרפואית מן שקופית הרכבה.
    5. החזק את שקופית ההרכבה עם אגודל ואצבע אמצעית ואת ההלבשה הרפואית החשופה הפונה כלפי מטה, והנמיך בזווית של 45 מעלות על קו הביצים המיושרות. מקם את השקופית כך שהקצה הרחב והקדירה של הביצים (משמאל) תלוי מעט מקצה הרוטב הרפואי, שכן זה משפר את היכולת של זחלי קולקס לבקוע בהצלחה מהביצים הרכובות.
    6. לחץ על האצבע המורה לחלק התחתון של הכיסוי, תוך המשך החזקת זכוכית הכיסוי בין האגודל לאצבע האמצעית, כדי להבטיח שכל הביצים המיושרות מחוברות היטב לרוטב הרפואי.
    7. מיד הפוך את הכיסוי, כך הביצים פונים כלפי מעלה, ולהחיל שכבה דקה של שמן שמן Halocarbon שמן (2-3 טיפות; ~ 20 μL) על הביצים. זה מונע את הביצים ייבש במהלך microinjection. הסר כל ביצים שאינן מחוברות לרוטב הרפואי או אינן מכוסות בשמן.
    8. מניחים את כיסוי הזכוכית עם הביצים הרכובות הפונות למעלה בתוך צלחת פטרי מרובעת עם ריבוע גדול של נייר סינון רטוב להובלה למיקרו-שיתוף.

6. הזרקת עוברים קולקס

  1. מילוי אחורי של מחטי ההזרקה בתערובת ההזרקה
    1. בחר מילוי מחט או קצה טעינת ג'ל שיתאים בקלות לחלק האחורי של מחט ההזרקה שנבחרה, ויהיה קצת מקום בין קצה מילוי המחט למחט ההזרקה.
    2. בזהירות למקם טיפה אחת וקטנה של תערובת הזרקה (~ 0.5-1 μL) לתוך מחט ההזרקה, באמצעות מילוי המחט כדי למלא את המחט. מניחים את טיפת תערובת ההזרקה ליד המקום שבו מחט ההזרקה מתחילה להתחדד.
  2. חבר את מחט ההזרקה למיקרו-מזרק.
  3. הנח את השקופית המכילה את העוברים על שלב המיקרוסקופ.
  4. פתיחת המחט
    הערה: אם משתמשים במחטים משופעות, אין צורך בכך.
    1. השתמש בלחץ הזרקה התחלתי של ~ 30 PSI ולהתאים לפי הצורך כדי לספק נפח מתאים של תערובת הזרקה.
    2. תחת מיקרוסקופ ניתוח, למקם את המחט מעל העובר, ולהשתמש בזהירות micromanipulator כדי להוריד את המחט על העובר. ברגע שהמחט בקושי נוגעת בעובר, העבר במהירות את העובר בניצב לציר הארוך של המחט.
    3. כדי לקבוע אם המחט נפתחה בהצלחה, לחץ על הדק ההזרקה ולראות אם כל בועות / הזרקה לערבב לברוח מן המחט. אם לא, חזור על הזזת העובר כנגד המחט עד שהמחט פתוחה ותערובת הזרקה בורחת כאשר ההדק נלחץ.
  5. הזרקת העוברים
    1. מקם את העובר הראשון בשורה במרכז הראייה במיקרוסקופ וודא שהוא נמצא בפוקוס.
    2. מניחים את המחט מעל הביצה הראשונה, גם במרכז שדה הראייה בתוך המיקרוסקופ.
    3. בהדרגה להגדיל את ההגדלה על המיקרוסקופ, בזהירות להוריד את המחט כדי לשמור אותו רק מעל העובר הראשון, מרוכז בפוקוס. המשך עד שהמיקרוסקופ יגיע להגדלה הגבוהה ביותר שלו וגם העובר וגם המחט נמצאים בפוקוס.
    4. בזהירות להזיז את העובר על הבמה מעט שמאלה ולהוריד את המחט מעט, כך המחט ואת העובר נמצאים כעת באותו מישור הראייה.
    5. באמצעות שלב המיקרוסקופ כדי להזיז את העובר, בזהירות ובעדינות לגעת העובר לקצה המחט. הקצה הצר והאחורי של העובר אמור להסיט מעט. התאם את גובה המחט אם הוא גבוה מדי או נמוך מדי.
    6. באמצעות שלב המיקרוסקופ, הזז את הקצה האחורי של העובר אל המחט והתבונן במחט החודרת למקהלה של ביצת היתוש. המחט צריכה פשוט לחדור את הממברנה במיקום המשוער של תאי הקוטב בתוך עוברי קולקס. ברגע שזה קורה, לחץ על הדק הזריקה 1-3 פעמים כדי לירות הזרקה לערבב לתוך העובר. לספק כמות קטנה של תערובת הזרקה, רק מספיק כי ניקוי קטן בעובר ניתן לזהות.
    7. באמצעות הבמה, להזיז את העובר ימינה, משם ומחוץ לקצה המחט. אם הזריקה הלכה טוב, מעט מאוד נוזל צריך לדלוף מהעובר.
    8. הזז את הבמה למטה כך העובר הבא בשורה ממוקם מול המחט. מצד שני, להזיז את הבמה שמאלה, מיקום העובר על מחט ההזרקה ולחץ על הדק ההזרקה.
    9. אם לא נראה כי תערובת ההזרקה יוצאת ו/או אם כמות גדולה של נוזל בורחת מהעובר לאחר הסרת המחט, החליפו את מחט ההזרקה והתחלו שוב.
    10. להשמיד כל ביצים לא מוזרקות או פגומות.
  6. טיפול בעוברים לאחר הזרקה
    1. לאחר כל העוברים במגלשה הוזרקו, לשטוף את שמן Halocarbon על ידי החלת מי אוסמוזה הפוכה עם בקבוק התזה, כך זרם המים מכוון על החלק העליון של מכסה הזכוכית מעל העוברים המוזרקים ומאפשר למים לזרום במורד כיסוי ומעל העוברים לשטוף את השמן משם. הקפד לא לכוון את זרם המים ישירות על העוברים כמו זה עלול לפגוע או לנתק אותם מן ההלבשה הרפואית. תהליך זה מסיר את רוב, אך לא את כולם, של שמן Halocarbon.
    2. לכסות את המגלשה עם 150 μL של מים DI.
    3. מניחים את השקופית עם העוברים המוזרקים על נייר סינון רטוב בתוך צלחת פטרי מרובעת.
    4. מניחים את צלחת הפטרי המכילה את העוברים המוזרקים בתא סביבתי להגדיר 25-27 °C (70-80% RH עם פוטופריוד יום ארוך (>13 שעות אור ליום).

7. גידול עוברים מוזרקים (F0)לבגרות והקמת צלבים

  1. לבחון את השקופיות של עוברים מוזרקים מדי יום, מצפה כי 1st instar זחלים צריך לצאת 1.5 ימים לאחר הזריקה.
  2. ספרו את מספר זחלי ה-1st instar, והכניסו 100-200 זחלים לתוך מיכל טאפרוור בגודל קופסת נעליים עם 450 מ"ל של מי DI, ו-50 מ"ג של מזון לדגים טחונים. בשלב זה, ליצור 1-5 פעמים יותר מכולות המכילות סוג בר או זחלים לא מוזרקים שישמשו לחצות עם יתושים מוזרקים.
  3. להאכיל את הזחלים מדי יום, להגדיל מעט את כמות המזון שהם מקבלים כל יום עד להגיע 300-500 מ"ג ביום6 של חיי הזחל.
  4. ברגע שהגלמים מופיעים, השתמש בצינור העברה כדי למקם גולם אחד לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל מלא 50-75% מלא של מים DI. חזור על כל הגולם, הן את הגולם שהוזרק כעוברים, כמו גם גלמים לא מושרים, סוג בר. לחץ בזהירות על המכסים כך שהם מעט ajar, מניעת היתושים לברוח אבל עדיין מאפשר כמות קטנה של חילופי גז.
  5. ברגע שהיתושים הבוגרים מגיחים בתוך צינורות המיקרוצנטריפוגה שלהם, משחררים יתושים נקבות מוזרקים לכלוב המכיל יתושים זכרים בתולים מסוג בר, ומשיגים יחס של זכר אחד לפחות מסוג בר לכל נקבה מוזרקת. באופן דומה, שחררו יתושים זכרים מוזרקים לכלוב המכיל נקבות בתולות מסוג בר, והגיעו ליחס של כ-5-10 נקבות בר בתוליות לכל זכר מוזרק. יחס גבוה יותר של נקבות מסוג בר לזכרים מוזרקים מומלץ מכיוון שכל יתוש זכר יכול להזדווג מספר פעמים. לכן, לאחר מספר גבוה יותר של נקבות סוג בר להזדווג עם זכרים מוזרקים מגדיל את מספר צאצאי F1 שניתן לייצר.

8. השגת וגידול יתושי F1 וסינוןם למוטציות

  1. שבעה עד עשרה ימים לאחר הופעת המבוגרים, מציעים ארוחת דם לנקבות בכל כלוב כמתואר לעיל (שלב 3).
  2. ארבעה ימים לאחר האכלת הדם, מניחים מים בכל כלוב. כל רפסודה ביצה מייצגת צאצא של יתוש נקבה אחת, ולכן יש להציב לתוך פלסטיק משלה, מיכל גידול בגודל קופסת נעליים זמן קצר לאחר oviposition. סמן כל מיכל עם מזהה ייחודי, וגם מציין כי הזחלים שייכים לדור F1 עבור גן העניין, בין אם ההורה הזכר או הנקבה הוזרק, תאריך הקמת המחבת, תנאי גידול וראשי התיבות של הנסיין.
  3. יש לעקוב אחר המחבתות של הזחלים מדי יום. ברגע שהזחלים בוקעים במחבתות, ספקו 50 מ"ג של מזון דגים טחונים. הגדל את המזון מדי יום במשך 6 ימים כמתואר לעיל (שלב 7.3).
  4. העבר גולם בודד לצינורות מיקרוצנטריפוגה בגודל 2 מ"ל המכילים בין 1-1.5 מ"ל של מי DI, סמן כל צינור וסדק את המכסים.
  5. ברגע היתושים הבוגרים מגיחים, פתחו בזהירות את צינור המיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל, מכסים באצבע המורה, ומשתמשים ביד השנייה, מניחים בקבוקון זכוכית של 3 דראם מעל החלק העליון של צינור המיקרוצנטריפוגה. האינסטינקט הטבעי של היתוש צריך להיות לעוף למעלה ולתוך בקבוקון הזכוכית. ברגע שזה קורה, להחליק אצבע על הפתיחה של בקבוקון הזכוכית, ולהפוך אותו במהירות, הצבת כדור קטן של כותנה כי כבר רטוב מעט עם 10% תמיסת סוכרוז לחלק העליון של בקבוקון. זה מונע מהיתוש לברוח ומספק מקור מזון ומים הכרחי.
  6. סמן הן את הצינור המכיל את האקסוביה הגומה והן את בקבוקון הזכוכית המכיל את היתוש הבוגר כדי לציין את מחבת הזחל שממנו הוא מקורו, את מין היתוש ואת המזהה הייחודי לאותו אדם. למשל: II.C.M32, שבו "II" מייצג כי ההורה הזכר הוזרק, "C" מייצג את המחבת / רפסודת הביצים שממנו האדם מקורו, ו "M32" מייעד כי היה הזכר32 לצאת מאותו מיכל גידול זחל.
  7. מניחים יתושים בוגרים בתוך בקבוקוני הזכוכית האישיים שלהם בחזרה לתא הסביבתי, ומוסיפים כמות קטנה (~ 20 μL) של 10% תמיסת סוכרוז לכותנה שלהם מדי יום. הקפד לא להזנה יתר על המידה או להרוות את הכותנה כמו היתושים ייתקעו בתמיסת סוכרוז ולמות.
  8. סינון יתושים למוטציה הרצויה
    1. לחלץ DNA גנומי מ 5-10 exuvia pupal מכל רפסודת ביצה / מחבת של זחלים באמצעות ערכת PCR ישיר Phire על פי הוראות היצרן, כמו גם 1-2 אנשים מסוג בר אשר ישמשו בקרה.
      הערה: מכיוון שצאצאי כל רפסודה הם ככל הנראה אחים מלאים, הקרנת זחלים 5-10 מכל מחבת תקבע אם המוטציה הועברה לצאצאים. אם לאף אחד מהזחלים המוקרנים ממחבת אחת אין את המוטציה הרצויה, אל תמסך מבוגרים נוספים. אם לחלק מהזחלים יש את המוטציה, אז כל אדם מהמחבת צריך להיות מוקרן.
    2. באמצעות פריימרים PCR שתוכננו בעבר (שלב 1.2), להגביר את הקטע סביב המיקום החזוי של המוטציה שלך באמצעות ערכת PR Phire הן בסוג הפרא והן בצאצאי F1 ולהפעיל שברי PCR על ג'ל agarose 3-4% כדי לקבוע אם יש הוספות או מחיקות גלויות (indels).
      הערה: כל אדם שיש לו את המוטציה הרצויה יהיה הטרוזיגוס צריך להציג 2 להקות, סוג פראי אחד ואחד קצר מעט או ארוך יותר בעמדה הרצויה. כדי להבחין בין אלה, להשוות את המיקום והעובי של הלהקות של אנשים סוג פראי עם אלה בלהקות בצאצאי F1. באופן אידיאלי 2 להקות נפרדות יהיו גלויות, אבל אם indel הוא קטן מאוד, הלהקה עשויה להיראות רחבה יותר ו / או מטושטשת יותר.
    3. טהר את מוצר ה- PCR על-ידי כריתת הרצועה המכילה את ההדלות החשודות (מומלץ) או על-ידי טיהור מוצר ה- PCR הנותר שלא נטען בג'ל. שלח את ה- PCR המטוהר לרצף כדי לקבוע אם המוטציה הרצויה קיימת.

9. השגת וגידול יתושי F2 ו- F3 וסינון אותם למוטציות

  1. שחררו את כל היתושים הבוגרים F1 שעבורם נמצאה המוטציה הרצויה על ידי הקרנת האקסוביה הגולית שלה מבקבוקוני הזכוכית האישיים שלהם לתוך כלוב המכיל יתושים פראיים ולא מוזרקים מהמין השני. Backcrossing עבור הדור השני הזה צריך להסיר את כל ההשפעות המזיקות של הזרקה והכלאה.
  2. דם מאכיל את הכלובים של יתושי F1 המוטנטיים ועמיתיהם הפראיים כפי שתואר בעבר. ארבעה עד חמישה ימים לאחר מכן, לאסוף את רפסודות הביצים F2 וכתוצאה מכך.
  3. סמן והפוך את זחלי F2 לתייג ולהגדיר אותו כמתואר לעיל, ומניחים כל רפסודה של ביצים במיכל נפרד ומסומן. עם הגור, שוב להפריד גולם בודד לתוך צינורות microcentrifuge בודדים 2 מ"ל, ולהעביר כל מבוגר לתוך בקבוקוני זכוכית נפרדים מכוסים כותנה ספוג סוכרוז עם הופעתה. לאחר מכן לסנן את exuvia pupal של כל אדם F2 המוטציה הרצויה כפי שתואר בעבר (שלבים 8.5-8.8).
    הערה: כאן כל האנשים שיש להם את המוטציה הרצויה יהיו הטרוזיגוס, ולכן המוצר PCR צריך באופן אידיאלי לייצר 2 רצועות נפרדות כאשר לרוץ על ג'ל אגרוז 3-4%.
  4. ברגע שזוהו זחלי מוטציה F2, הנח את כל הזכרים והנקבות שיש להם את המוטציה לאותו כלוב להזדווג. הזנת דם 7-10 ימים לאחר הופעת מבוגר, ו 4-5 ימים מאוחר יותר, לאסוף את רפסודות הביצים F3.
  5. מניחים כל רפסודה של ביצים F3 במיכל גידול זחל נפרד, ומתייגים ומאכילים כמתואר לעיל.
  6. להפריד את גולם F3 לתוך צינורות microcentrifuge בודדים 2 מ"ל. לאחר שמבוגרים מגיחים, מעבירים אותם לבקבוקוני זכוכית בודדים עם 10% כותנה ספוגה סוכרוז. מסך האקסוביה הגואלית כפי שתואר בעבר. הפעם, כ -25% מהצאצאים בכל מחבת צריכים להיות הומוזיגוס למוטציה האפסית. הניחו את האנשים האלה בכלוב אחד, והשתמשו בהם כדי ליצור ולתחזק את קו היתושים החדש שנוצר.
    הערה: אם מספר נמוך של יתושים הומוזיגוס נוכחים, הטרוזיגוס F3 זכרים ונקבות ניתן לחצות אחד עם השני כדי ליצור יתושים הומוזיגוס-null נוספים בדור F4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות הפרוטוקול המתואר, הצלחנו להזריק בהצלחה עוברים של Cx. pipiens, וצפינו בשיעור גבוה של הישרדות בקרב העוברים המוזרקים (~ 55%, איור 1). בניסויים קודמים היה אחוז נמוך יותר של הישרדות, ככל הנראה משום שהקדמת של זקיק הביצה הייתה מחוברת לרצועת ההלבשה הרפואית, מה שמנע מזחלי יתושים לברוח מהמקהלה ולשחות בהצלחה לתוך המים. הבטחת הסוף העורפי משתרע מעבר לרצועת ההלבשה הרפואית, גדלה מאוד בהישרדות הזחל, ומביאה לצאצאים איכותיים המסוגלים להתפתח לבגרות ולהתרבות (איור 2B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטות להכניס מוטציות ספציפיות לגנום של יתושי קולקס וניתן להשתמש בו לעריכת הגנום של יתושים אחרים גם כן. הפרוטוקול הוא משמעותי בכך שהוא מספק פרטים ספציפיים לא רק כיצד להכין את חומרי ההזרקה, אלא גם סקירת וידאו מפורטת של איך לגרום יתושים להטיל ביצים, כמו גם איך להכין ולהזריק ביצים אלה. אנו גם מסכמים כיצד לנצל את הביולוגיה של נקבות Cx. pipiens להטיל ביצים ברפסודות בודדות ובכך לסנן שיעור קטן יותר של צאצאים מכל נקבה עבור מוטציות הרצויות. השיטות המוצגות כאן עברו אופטימיזציה עבור Cx. pipiens...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RH עובד עבור מתקן שינוי חרקים, המספק שירותים בשינוי גנטי חרקים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר דוד או'ברוכטה ולכל חברי רשת המחקר לתיאום טכנולוגיות גנטיות של חרקים על העזרה וההכשרה שהם מספקים לנו ולאחרים על הטמעת טכנולוגיות גנטיות. אנו מודים במיוחד לחנה אלוביהאר על אופטימיזציה של פרוטוקול המיקרו-מניב כדי לאפשר להזריק ולבקע עוברי קולקס. אנו מודים גם לדבנטה סימונס ויוסף אורסו, סטודנטים לתואר ראשון העובדים במעבדת מיוטי, על הסיוע בטיפול ובהקרנת יתושים מהונדסים, וזורה אלמקמי מקרן ה-IT על סיוע בגידול והכנת יתושים להזרקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק זרעים בין תחומיים מהמכון למחלות זיהומיות ב- OSU שסופק ל- MEM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזין ממברנה מלאכותיתHemotekSP5W1-3מיקום החברה: בלקבורן, בריטניה
ATPInvitrogen18330019מיקום החברה: קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב
צינורות מיקרוקפילרי מזכוכית בורוסיליקט, קוטר חיצוני 1 מ"מWorld Precision Instruments1B100-6מיקום החברה: סרסוטה, פלורידה, ארה"ב
BV10 מחט BevelerSutter InstrumentsBV-10-Bמיקום החברה: נובאטו, קליפורניה, ארה"ב
נייר סינון מעגלי Whatman (12.5 ס"מ)Sigma AldrichWHA1001125מיקום החברה: סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב
צינור חרוטי (50 מ"ל)Thermo Fisher Scientific339652מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב
נייר סינון קורס פישרברנד עם קצב זרימה מהירThermo Fisher Scientific09-800מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב
זכוכית כיסוי (24 x 40 מ"מ)Thermo Fisher Scientific50-311-20מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב
סכר שינייםהנרי שיין בע"מ1010171מיקום החברה: מלוויל, ניו יורק ארה"ב
סקוטש דו צדדי קלטת תרמופישר סיינטיפיקNC0879005מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב
מיקרו-מזרק FemtoJet 4iEppendorf5252000021מיקום החברההמבורג, גרמניה
בקבוקון זכוכית (2 dram)תרמו פישר סיינטיפיק033401Cמיקום החברה: וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב
שמן הלוקרבוןסיגמא אולדריץ'H8898-50MLמיקום: סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב
P-2000 חולץ מחט לייזרSutter InstrumentsP-2000/Gמיקום החברה: נובאטו, קליפורניה, ארה"ב
ParafilmThermo Fisher Scientific50-998-944מיקום החברה: וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב
PC-100 חולץ מחט משוקללNarishigePC-100זה תואם לדגם ה-PC-10 הקודם, שהופסק. מיקום החברה: אמיטיוויל, ניו יורק, ארה"ב
ערכת PCR ישירה PhireThermo Fisher ScientificF140WHמיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב
קודאק פוטו-פלו (1%)Thermo Fisher Scientific50-268-05מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב
צינורות מירוקפילריים מזכוכית קוורץ, קוטר חיצוני 1 מ"מאספקת צינורות נימיים מוגבלתQGCT 1.0מיקום החברה: קורנוול, בריטניה
מדריך-IT וסחר; ערכת סינון sgRNATakara, Bio USA632639ערכה זו מאפשרת לך לקבוע אם gRNAs חותכים רצפי DNA במבחנה. מיקום החברה: מאונטיין וויו, קליפורניה, ארה"ב
SigmacoteSigma AldrichSL2-100MLמיקום החברה: סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב
צלחות פטרי קטנות (35X10 מ"מ)Thermo Fisher Scientific50-190-0273מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב
נתרן ציטראט דם עוףLampire ביולוגי7201406מיקום החברה: אוורט, פנסילבניה, ארה"ב
צלחת פטרי בכיכר פישרברנד (10 ס"מ x x 10 ס"מ)Thermo Fisher ScientificFB0875711Aמיקום: וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב
TegadermHenry Schein Inc.7771180 מיקום החברה: מלוויל, ניו יורק ארה"ב
מזון דגים טרופייםטטרמיןN/A
נייר סינון WhatmanThermo Fisher Scientific09-927-826מיקום החברה: וולת'אם, MA, ארה"ב
נייר סינון Whatman, 4.25 ס"מSigma Aldrich1001-042מיקום החברה: סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב
חברת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
  2. Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
  3. Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
  4. Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
  5. Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
  6. Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
  7. Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
  8. Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
  9. Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
  10. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
  11. Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
  12. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  13. Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
  14. Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652(2016).
  15. Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
  16. Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
  17. Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
  18. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  19. Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
  20. Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
  21. Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
  22. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  23. Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
  24. Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  25. Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
  26. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  27. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cas9 gRNA

מאמרים קשורים