הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

תקציר

לכידת תהליכי השכפול וההרכבה הדינמיים של וירוסים הופרעה על ידי היעדר טכנולוגיות הכלאה חזקות באתרן (ISH) המאפשרות תיוג רגיש ובו-זמני של חומצת גרעין וחלבון נגיפיים. שיטות קונבנציונליות של הכלאה פלואורסצנטית של דנ"א באתרן (FISH) לרוב אינן תואמות את האימונוסטינינג. לכן פיתחנו גישת הדמיה, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based d etection של DNA, RNA ו-protein), המאפשרת הדמיה סימולטנית של דנ"א, רנ"א וחלבון. בהשוואה לדגי דנ"א רגילים, MICDDRP משתמש בטכנולוגיית DNA מסועפת (bDNA) ISH, המשפרת באופן דרמטי את הרגישות והזיהוי של בדיקת אוליגונוקלאוטידים. שינויים קטנים של MICDDRP מאפשרים הדמיה של חלבונים נגיפיים במקביל לחומצות גרעין (RNA או DNA) של גדילים שונים. יישמנו את הפרוטוקולים האלה כדי לחקור את מחזורי החיים של פתוגנים נגיפיים מרובים, כולל נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1, נגיף T-לימפוטרופי אנושי (HTLV)-1, נגיף הפטיטיס B (HBV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף זיקה (ZKV) ונגיף שפעת A (IAV). הדגמנו שאנחנו יכולים לתייג ביעילות חומצות גרעין וחלבונים נגיפיים במגוון רחב של נגיפים. מחקרים אלה יכולים לספק לנו הבנה מכניסטית משופרת של מערכות נגיפיות מרובות, ובנוסף, לשמש כתבנית ליישום הדמיה פלואורסצנטית מרובת של דנ"א, רנ"א וחלבון על פני ספקטרום רחב של מערכות תאיות.

מבוא

בעוד שאלפי נוגדנים מסחריים זמינים לתיוג ספציפי של חלבונים באמצעות גישות אימונוסטיזציה קונבנציונליות, ובעוד שניתן להנדס חלבוני היתוך באמצעות תגים פלואורסצנטיים שעברו אופטימיזציה לפוטו-אופטימיזציה למעקב אחר חלבונים מרובים בדגימה¹, הדמיה מיקרוסקופית של חלבון לרוב אינה תואמת להכלאה פלואורסצנטית קונבנציונלית של DNA באתרה (FISH)² . מגבלות טכניות בהדמיה סימולטנית של דנ"א, רנ"א וחלבון באמצעות גישות מבוססות פלואורסצנציה הפריעו להבנה מעמיקה של שכפול הנגיף. מעקב אחר חומצת גרעין נגיפית וחלבון במהלך ההדבקה מאפשר לווירולוגים לדמיין תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס שכפול הנגיף^{והרכבתו} 3,4,5,6.

פיתחנו גישת הדמיה, multiplex immunofluorescent cell-based d etection של DNA, RNA ו- Protein (MICDDRP)³, המשתמשת בדנ"א מסועף (bDNA) בטכנולוגיית situ כדי לשפר את הרגישות של זיהוי חומצות גרעין ^7,8,9 . בנוסף, שיטה זו משתמשת בבדיקות מזווגות לספציפיות משופרת. בדיקות ספציפיות לרצף bDNA משתמשות ב-DNAs של קדם-מגבר ומגבר מסתעפים כדי לייצר אות אינטנסיבי ומקומי, ולשפר את שיטות ההכלאה הקודמות שהסתמכו על מיקוד באזורים חוזרים בדנ"א⁹. תאים נגועים בהקשר קליני לעתים קרובות אינם מכילים חומר גנטי ויראלי בשפע, ומספקים מצרך לשיטה רגישה לזיהוי חומצות גרעין פלואורסצנטיות במסגרות אבחון. המסחור של טכנולוגיית bDNA באמצעות גישות כגון RNAscope⁷ ו- ViewRNA¹⁰ מילאו נישה זו. לרגישות של דימות פלואורסצנטי bDNA יש גם תועלת חשובה בביולוגיה של התא, והיא מאפשרת זיהוי של מיני חומצות גרעין נדירים במודלים של תרביות תאים. השיפור העצום ברגישות הופך את שיטות ההדמיה מבוססות ה-bDNA למתאימות לחקר וירוסים. חסרון פוטנציאלי, עם זאת, הוא ששיטות אלה מתמקדות בהדמיה של רנ"א או רנ"א וחלבון. לכל התאים המשוכפלים ולנגיפים רבים יש גנומים של דנ"א או שהם יוצרים דנ"א במהלך מחזור השכפול שלהם, מה שהופך את השיטות המסוגלות לדמות גם רנ"א וגם דנ"א, כמו גם חלבון, לרצויות מאוד.

בפרוטוקול MICDDRP אנו מבצעים bDNA FISH לזיהוי חומצת גרעין נגיפית בשיטת RNAscope, עם שינויים⁷. אחד השינויים העיקריים בפרוטוקול זה הוא אופטימיזציה של טיפול בפרוטאז בעקבות קיבוע כימי. טיפול בפרוטאז מקל על הסרת חלבונים הקשורים לחומצת גרעין כדי לשפר את יעילות הכלאת הבדיקה. הטיפול בפרוטאז מלווה בדגירה עם גשושיות אוליגונוקלאוטידים מסועפות. לאחר יישום של בדיקות bDNA, דגימות נשטפות ולאחר מכן מודגרות עם DNAs קדם-מגבר אות ומגבר. הכלאה מרובבת באתרה (ISH), תיוג של מטרות גנים מרובות, דורשת בדיקות מטרה עם ערוצי צבע שונים להתמיינות ספקטרלית⁷. דגירה עם מגברי DNA מלווה באימונופלואורסצנציה (IF).

bDNA ISH מקנה שיפורים באותות לרעש על ידי הגברה של אותות ספציפיים למטרה, עם הפחתה לרעשי רקע מאירועי הכלאה לא ספציפיים ^7,11. גשושיות מטרה מתוכננות באמצעות תוכנות הזמינות לציבור המנבאות את ההסתברות לאירועי הכלאה לא ספציפיים, כמו גם חישוב טמפרטורת התכה (T_m) של הגשושית-מטרה ההיברידית ^7,11. גשושיות המטרה מכילות אזור של 18 עד 25 בסיסים המשלים את רצף הדנ"א/רנ"א של המטרה, רצף ספייסר ורצף זנב של 14 בסיסים. זוג גשושיות מטרה, שלכל אחת מהן רצף זנב מובחן, משתלבות לאזור מטרה (המשתרע על פני ~50 בסיסים). שני רצפי הזנב יוצרים אתר הכלאה עבור הגשושיות שלפני המגבר, המכילות 20 אתרי קישור עבור הגשושיות של המגבר, אשר בנוסף מכילות 20 אתרי קישור עבור גשושית התווית. לדוגמה, אזור של קילו-בסיס אחד (kb) על מולקולת חומצת הגרעין ממוקד על ידי 20 זוגות גשושיות, ויוצר פיגום מולקולרי להכלאה רציפה עם הקדם-מגבר, המגבר והגשושית התווית. זה יכול אפוא להוביל לתפוקה תיאורטית של 8000 תוויות פלואורסצנטיות לכל מולקולת חומצת גרעין, מה שמאפשר זיהוי של מולקולות בודדות ושיפורים עצומים לעומת גישות FISH^{קונבנציונליות 7} (ראו איור 1A לסכימות של הגברת אותות bDNA). כדי להגדיר בדיקות עבור ISH מרובב, כל בדיקת יעד חייבת להיות בערוץ צבע אחר (C1, C2 או C3). גשושיות מטרה אלה עם ערוצי צבע שונים הן בעלות רצפי זנב שונים של 14 בסיסים. רצפי זנב אלה יקשרו מגברי אותות שונים עם גשושיות פלואורסצנטיות שונות, ובכך יאפשרו התמיינות ספקטרלית על פני מטרות מרובות. בפרוטוקול המוצג, טבלה 4 בשלב 9, מספקת מידע נוסף על תיוג פלואורסצנטי של בדיקות מטרה. בנוסף, איור 2 ואיור 3 מספקים דוגמאות לאופן שבו בחרנו את המגבר המתאים 4-FL (A, B או C) (בדיקה פלואורסצנטית ושלב ההכלאה הסופי) כדי להשיג תיוג פלואורסצנטי ספציפי של מטרות מרובות של חומצות גרעין נגיפיות בעקבות זיהומים ב-HIV-1 וב-HTLV-1.

הדגמנו מספר יישומים של הדמיה פלואורסצנטית סימולטנית של RNA, DNA וחלבונים, תוך התבוננות בשלבים קריטיים של שכפול הנגיף ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה ^3,4,5. לדוגמה, הדמיה סימולטנית של רנ"א נגיפי, דנ"א ציטופלסמי וגרעיני וחלבון אפשרה לנו לדמיין אירועי מפתח במהלך הידבקות ב-HIV-1, כולל מעקב אחר רנ"א המכיל ליבות בציטופלסמה לפני הכניסה הגרעינית ושילוב של דנ"א פרו-ויראלי³. בנוסף, יישמנו MICDDRP כדי לאפיין את ההשפעות של גורמים מארחים וטיפול תרופתי על זיהום ויראלי ושכפול ^4,5. ב- Ukah et al., עקבנו אחר הפעלה מחדש של שעתוק HIV-1 במודלים של תאי חביון שטופלו בסוכני היפוך חביון שונים כדי לדמיין שעתוק HIV והיפוך חביון⁴. בנוסף, MICDDRP יכול לאפשר לנו לדמיין שינויים פנוטיפיים הקשורים עיכוב אנטי ויראלי המיוחס לטיפול במולקולות קטנות או הגבלת גורם מארח. כהוכחת היתכנות לעמידות ולתחולה הרחבה של הגישה שלנו, הוכחנו שאנו יכולים להשתמש בשינויים של הפרוטוקול שלנו כדי לתייג ביעילות חומצת גרעין נגיפית כדי לעקוב אחר זיהום לא רק בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1, אלא גם בנגיף T-לימפוטרופי אנושי (HTLV)-1, נגיף הפטיטיס B (HBV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף זיקה (ZIKV), ונגיף שפעת A (IAV). מכיוון שמחזור החיים של HIV-1 מורכב הן ממיני דנ"א נגיפיים והן ממיני RNA, ביצענו את רוב האופטימיזציה של MICDDRP בעקבות קינטיקה של שכפול HIV-1. עם זאת, בנוסף, הוכחנו כי אנו יכולים לעקוב אחר סינתזה של תעתיקי RNA נגיפיים שונים של גדילי החוש (+) והאנטיסנס (-) או שניהם בנגיפים כגון ZIKV, IAV, HBV ו- HCV כדי לעקוב אחר שעתוק ושכפול נגיפי ^3,4,5,6. מטרת המחקרים היא לשפר את ההבנה המכניסטית של מספר תהליכים נגיפיים ולשמש קו מנחה ליישום טכנולוגיית הדמיה פלואורסצנטית זו במגוון רחב של מודלים תאיים.

פרוטוקול

1. תאי זרעים (תרחיף לעומת תאים דבקים) על כיסויים או שקופיות תא (פרוטוקול המוצג משתמש בכיסויים).

1. זריעה של תאי תרחיף
   1. יש להכין כיסויים מצופים פולי-D-ליזין (PDL) (מקל על הדבקות של תאי תרחיף לכיסוי) על ידי הדגירה הראשונה של כיסויים באתנול (EtOH) למשך 5 דקות (מעקר את הכיסויים ומסיר שאריות). לאחר מכן יש לשטוף פי 2 במלח חצוב פוספט (PBS) לפני הדגירה של כיסויים ב-PDL (20 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 30 דקות (דקות) בטמפרטורת החדר (RT).
   2. יש להסיר PDL ולשטוף 2x ב-PBS. תאי גלולה (שנדבקו/טופלו בעבר בהתאם לתנאי ההדמיה הרצויים) והשעתה של 10^{6 תאים}ב-50 μL של PBS. יש לזהות 50 μL של תאים על זכוכית (מצופה PDL) ולדגור ב-RT למשך 30 דקות.
2. זריעה של תאים דבקים
   1. תאי תרבית על כיסוי סטרילי מונחים בצלחת 6 בארות ומדביקים תאים בחלקיקים נגיפיים או מטפלים בתרכובת של עניין. אפשר לתאים להגיע למפגש של 50-70% לפני הכנת הדגימה לניסויי הדמיה.

2. קיבוע תאי: לשימור המורפולוגיה התאית למחקרי הדמיה פלואורסצנטית

הערה: יש לשמור על 4% PFA ו-PBS ב-RT למשך 30 דקות לפחות לפני קיבוע הסלולר.

1. שאפו את המדיה התאית, שטפו תאים על כיסויים 3x ב-PBS, וקבעו תאים ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 30 דקות. שאפו PFA ושטפו תאים ב-PBS 2x.
   הערה: כעת ניתן לייבש ולאחסן תאים, אם הנסיין מעוניין לחדש את הניסוי בתאריך אחר. ניתן לייבש תאים קבועים ב-EtOH לפני האחסון.
   1. יש להסיר PBS לאחר השטיפה לאחר קיבוע התאים ולהחליף ב-500 μL של 50% EtOH (v/v במים). דגירה ב- RT במשך 5 דקות.
   2. הסר 50% EtOH והחלף ב- 500 μL של 70% EtOH. דגירה ב- RT במשך 5 דקות.
   3. הסר 70% EtOH והחלף ב- 500 μL של 100% EtOH. דגירה ב- RT במשך 5 דקות.
   4. יש להסיר 100% EtOH ולהחליף ב-100% EtOH טרי.
      הערה: ניתן לאחסן תאים מיובשים בטמפרטורה של -20°C למשך 6 חודשים. אטמו לוחות עם סרט הדבקה או פרפילם לפני האחסון כדי למנוע אידוי של EtOH.
   5. ייבשו מחדש את התאים כדי לעבור לתיוג פלואורסצנטי מרובב של תאים/נגיף.
   6. הסר 100% EtOH והחלף עם 500 μL של 70% EtOH. דגירה ב- RT במשך 2 דקות.
      הערה: אין לתת לתאים להתייבש בכל עת. השתמש תמיד בפתרון מספיק כדי להטביע את כל התאים.
   7. הסר 70% EtOH והחלף ב- 500 μL של 50% EtOH. דגירה ב- RT במשך 2 דקות.
   8. הסר 50% EtOH והחלף ב- PBS אחד.
      הערה: הכן דילול פרוטאזות, בדיקות הכלאה ומאגר שטיפה לפני הטיפול בפרוטאז (שלב 4) ויישום בדיקת יעד (שלב 5). הוראות ספציפיות להכנת מגיב מוצגות בתחילת כל שלב בהתאמה.

ריאגנטים	הערות אחרות
פתרון פרוטאז	הכנה ב-PBS אחד
גשושיות אוליגונוקלטודיה ממוקדות	דילול במאגר הכלאה
מאגר שטיפה	שטיפות בעקבות שלבי הכלאה ממוקדים
מאגר הכלאה	המתכון מוצג בטבלה 3

טבלה 1: ריאגנטים מרכזיים בפרוטוקול MICDDRP.

3. חדירת תאים: הגברת הגישה לתא ולאברונים התאיים לכניסה של מולקולות גדולות (נוגדנים, בדיקות הכלאה של חומצות גרעין)

1. הסר PBS אחד לאחר קיבוע או התייבשות תאית והחלף ב- 500 μL של 0.1% (v/v) Tween-20 ב- PBS אחד. דגירה ב- RT במשך 10 דקות. החלף אחד אחד. יש לכבס פעם אחת עם 500 מיקרו-ליטר של PBS אחד ולהוסיף PBS טרי אחד.

4. אימוביליזציה של כיסוי על שקופית זכוכית וטיפול בפרוטאז להסרת חלבונים קושרי חומצות גרעין מחומצת גרעין נגיפית/תאית קבועה כדי לשפר את יעילות ההכלאה

הערה: הכן את תמיסת פרוטאז III המדולל (ראה פרטים על מגיב בטבלת החומרים) במהלך חדירת התאים. תנו לפרוטאז להגיע ל-RT במשך 10 דקות לפני החדירה.

1. מניחים טיפה קטנה של לק על מגלשת זכוכית מעוקרת. יש לייבש את הגב (צד ללא שכבת תאים) ולהניח את קצה הכיסוי על טיפת הלק, כאשר הצד עם התאים המודבקים פונה כלפי מעלה. יש להוסיף מעט טיפות של PBS על הכיסוי המשותק כדי למנוע התייבשות.
   1. ציירו עיגול (במרחק של כ-3 מ"מ מהכיסוי) סביב היקף הכיסוי שנדבק כעת למגלשה באמצעות עט מחסום הידרופובי (עט דוחה מים ששומר על ריאגנטים מקומיים על תאים).
2. יש לדלל פרוטאז III ב-PBS אחד (100 μL/כיסוי).
   הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז הפרוטאז בהתאם להבדלים בסוגי תאים, בדיקות או חומצות גרעין מטרה באמצעות אופטימיזציה אמפירית ( ראה דיון). עבור תיוג RNA/DNA היעיל ביותר במערכות נגיפיות שונות, הצלחנו עם הדילולים הבאים המוצגים בטבלה 2 להלן עם דילולים הנעים בין (1 ל-2)-(1 עד 15) (פרוטאז ל-1x PBS).

מטרות בדיקה	דילול פרוטאז ב-PBS אחד (פרוטאז III עד 1X PBS)
דנ"א/רנ"א של HIV-1	1 עד 5
HTLV-1 דנ"א/רנ"א	1 עד 5
HBV pgRNA וסך HBV RNA	1 עד 15
IAV RNA	1 עד 15
ZIKV RNA	1 עד 2

טבלה 2: דילולים של פרוטאז III ב-PBS להכלאה של חומצות גרעין נגיפיות.

3. יש לרוקן את ה-PBS 1x על הכיסוי לאחר אימוביליזציה ולמרוח את הפרוטאז III המדולל.
4. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
5. תמיסת פרוטאז דקאנט ושקופיות שקועות ב- PBS אחד. התסיסו עם צלחת נדנדה במשך 2 דקות ב- RT. חזרו על הכביסה עם PBS 1x חדש.
   1. לזיהוי דנ"א בלבד , יש לשטוף דגימות שלוש פעמים במים נטולי נוקלאז למשך 2 דקות כל אחת, ולאחר מכן דגירה עם 5 מ"ג/מ"ל RNase A מדולל ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   2. Decant RNase פתרון, ולשטוף 3x במשך 2 דקות עם מים טהורים במיוחד. המשך עם ISH של גשושיות מטרה.
      הערה: מאגר ההכלאה משפר את זיהוי ה-vDNA מבלי להשפיע על יעילות צביעת ה-vRNA עבור התוצאות המוצגות (תוצאות מייצגות). דילול DNA ערוץ 1 (C1) בודק 1:1 עם בדיקת הכלאה. דילול בדיקות RNA C2 ו-C3 במאגר הכלאה. הגשושיות C2 ו-C3 המשמשות במחקרי ההדמיה שלנו נמצאות בפתרונות 50X (1:50; גשושית מטרה למאגר הכלאה).
6. הכן חיץ הכלאה במים נטולי נוקלאז בהתאם להליך שלב אחר שלב להלן:
   1. בצינור של 15 מ"ל, יש להוסיף 700 μL של מים נטולי נוקלאז, 300 μL של 50% (משקל/נפח (w/v)) דקסטרן סולפט, 300 μL של 5 M NaCl, 125 μL של 200 mM נתרן ציטראט (pH 6.2), ו-375 מ"ג (אבקה) של אתילן קרבונט.
   2. מערבבים היטב באמצעות מערבולת כדי להמיס אתילן קרבונט (ודא שכל האבקה מומסת ותמיסה ברורה).
   3. הוסף 25 μL של 10% (נפח/נפח (v/v)) Tween-20 ומספיק מים ללא נוקלאז כדי להשלים 2.5 מ"ל (תמיסה פי 2).
      הערה: את המתכון למאגר ההכלאה המוצג ניתן למצוא בטבלה 3 להלן. הפתרון יציב למשך שבוע. הקפידו על ערבוב מספיק של חומר הניקוי Tween-20, תוך הקפדה על מניעת מבעבע של תמיסה.

מגיב	ריכוז מלאי	הערות נוספות
מים נטולי נוקלאז	נה
דקסטרן סולפט	50% (ללא כ"א)	צמיג מאוד
נתרן כלורי	5 מ'
נתרן ציטראט (pH 6.2)	200 מ"מ	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C
אתילן קרבונט	נה	אבקה
טווין-20	10% (וולט/ואט)

טבלה 3: רשימת מאגרי הכלאה של ריאגנטים.

5. דגירה עם בדיקות הכלאה של מטרות DNA/RNA: גשושיות אוליגונוקלאוטיד מטרה נקשרות לאזורים מעניינים, ויוצרות פיגום מולקולרי עבור קדם-מגברים, מגברים ובדיקות פלואורסצנטיות להיקשר.

הערה: יש לחמם בדיקות DNA/RNA בטמפרטורה של 40°C למשך 10 דקות (במהלך פרמביליזציה של התא) ולהתקרר ל-RT למשך 10 דקות לפחות, אם לא כולל טיפול ב-RNase. אם יש צורך בטיפול ב-RNase או בטיפול נוסף בדגימה לפני הכלאת גשושית מטרה, יש לבצע בדיקות חמות בהתאם. סובבו את גשושיות C2 ו-C3 לאחר ההתחממות ודיללו במאגר ההכלאה. לאחר דילול, ניתן לחמם לזמן קצר את בדיקות C2 ו- C3. יש לחמם את מאגר הכביסה 50x (ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים) בטמפרטורה של 40°C למשך 10-20 דקות ולדלל עד פי 1 במים ברמת ביולוגיה מולקולרית.

1. דגירה של 200 μL של מאגר ההכלאה ב-67 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הוספת גשושיות הכלאה. בדיקה מדוללת במאגר הכלאה (מתכון המפורט בטבלה 2). יש להוסיף 50 מיקרוליטר/כיסוי.
2. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות (h). בדיקות Decant ושקע שקופיות במאגר שטיפה 1x. התסיסו על ידי נדנדה של צלחת במשך 2 דקות ב- RT. חזור על הכביסה עם מאגר כביסה חדש 1x.

6. הכלאה של מגבר (Amp) 1-FL: תוספת של קדם-מגבר המשלים את רצף הזנב של בדיקות ה-DNA/RNA של המטרה (שלב 5)

הערה: המגברים צריכים להיות ב-RT לפני השימוש. הוציאו כל מגבר בנפרד מהמקרר 30 דקות לפני השימוש והשאירו על הספסל ב-RT.

1. יש להסיר את השקופיות ממאגר שטיפה 1x ולהקיש/לספוג כדי להסיר עודפי נוזלים.
2. הוסיפו טיפה אחת של Amp 1-FL על הכיסוי. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
3. מגבר דקנט 1-FL ושקע במאגר כביסה 1x. התסיסו על ידי נדנדה צלחת 2 דקות ב RT. חזור על הכביסה עם חיץ כביסה חדש 1x.

7. הכלאה של Amp 2-FL: אינקובציה עם מגבר אותות עם רצף זיהוי קוגנטי לקדם-מגברים (Amp 1-FL)

1. יש להסיר את השקופיות ממאגר שטיפה 1x ולהקיש/לספוג כדי להסיר עודפי נוזלים.
2. יש להוסיף טיפה אחת של Amp 2-FL על הכיסוי. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
3. יש לטבול באמפר 2-FL ולטבול במאגר כביסה 1x. התסיסו על ידי נדנדה צלחת 2 דקות ב RT. חזור על הכביסה עם חיץ כביסה חדש 1x.

8. הכלאה של מגבר 3-FL: אינקובציה עם מגבר אות שני

1. יש להסיר את השקופיות ממאגר שטיפה 1x ולהקיש/לספוג כדי להסיר עודפי נוזלים.
2. יש להוסיף טיפה אחת של Amp 3-FL על הכיסוי. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
3. יש לטבול באמפר 3-FL ולטבול במאגר שטיפה אחד. התסיסו על ידי נדנדה צלחת 2 דקות ב RT. חזור על הכביסה עם חיץ כביסה חדש 1x.

9. הכלאה של Amp 4-FL: תווית פלואורסצנטית ושלב הכלאה סופי

הערה: ראשית, ראה טבלה 4 כדי לבחור את Amp 4 המתאים (A,B או C)- FL בהתבסס על הערוצים של גשושיות היעד. הערך מה Amp 4-FL נדרש כדי לסמן DNA / RNA של עניין. דוגמה לכך מופיעה בטבלה שלהלן:

	A	B	C
דנ"א ערוץ 1 (C1)	488	550	550
ערוץ DNA/RNA 2 (C2)	550	488	647
RNA ערוץ 3 (C3)	647	647	488

טבלה 4: בחירה של בדיקה פלואורסצנטית של Amp 4 (A, B או C)-FL עבור ISH מרובה.

הערה: עבור FISH מרובב (יעדים מרובים), בחירת Amp 4 (A, B או C) הנכון - FL היא קריטית לתיוג נכון של יעדי העניין שלך. לבדיקות מטרה (שלב 5) יש ערוצי צבע שונים (C1, C2 או C3), המכתיבים את התווית הפלואורסצנטית המתאימה להן (Alexa 488, Atto 550 או Alexa 647), בהתבסס על Amp 4-FL שנבחר. דוגמאות לבחירת שילובי פלואורופור להדמיה מרובבת מובאות באגדות של איור 2 ואיור 3. כדוגמה נוספת, בחירה של Amp 4B-FL תתייג באופן סלקטיבי בדיקות DNA C1 עם בדיקות Atto 550 ו- RNA C3 עם Alexa 647.

1. יש להסיר את השקופיות ממאגר שטיפה 1x ולהקיש/לספוג כדי להסיר עודפי נוזלים.
2. יש להוסיף טיפה אחת של Amp 4-FL על הכיסוי. לדגור בתנור לח ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
   הערה: לאחר שלב 9.2, שמור על דגימות מכוסות, מוגנות מפני האור.
3. דרגנט אמפר 4-FL ושקע במאגר כביסה 1x. התסיסו על ידי נדנדה של צלחת במשך 2 דקות ב- RT. חזור על הכביסה עם מאגר כביסה חדש 1x. יש לשטוף עם PBS אחד (2 דקות) ולאחסן ב-PBS.

10. חלבון חיסוני: כדי לתייג חלבונים מעניינים

1. דקנט PBS והוסף 200 μL של מאגר חוסם (1% עם BSA / v , 10% v/v FBS ב- PBS עם 0.1% v/v Tween-20 (PBST)) לכיסוי. דגירה של שעה אחת ב-RT.
2. חיץ חוסם דקנט ומחיל 200 μL של נוגדן ראשוני מדולל ב- PBST + 1% w/v BSA. דגירה של שעה אחת ב-RT.
3. שטפו את המגלשה פעמיים עם PBST למשך 10 דקות ב-RT עם רעידות.
4. החל נוגדן משני לבחירה למשך שעה אחת ב- RT ב- PBST + 1% עם BSA / v.
5. שטפו את המגלשה עם PBST למשך 10 דקות ב-RT עם רעידות.

11. הכתמה גרעינית: גרעינים נגד כתמים בעקבות אימונוסטינינג

1. לנטרל PBST ולהחיל DAPI או כתם גרעיני לבחירה במשך דקה אחת ב- RT.
2. שטפו את המגלשה פעמיים עם PBS למשך 10 דקות ב-RT עם רעידות.

12. הרכבה

1. הנח טיפה אחת של תמיסת אנטי-פאף (לדוגמה, זהב ארוך) על שקופית זכוכית סטרילית חדשה (ראשית, יש לנקות את ההחלקה עם EtOH ולתת לה להתייבש כדי לוודא שאין שאריות על זכוכית). עם אותו קצה, יש למרוח את טיפת תמיסת האנטי-פה כך שתכסה שטח בגודל של כסוף הכיסוי.
   הערה: תמיסת האנטי-פאדה צמיגה מאוד ועשויה להיות קשה לפיפטה. חיתוך קצה של 200 μL לפני צנרת עשוי להקל על בעיות אלה.
2. הסר את הכיסוי עם דגימת תאים מהשקופית ושקע ב- PBS כדי להסיר שאריות לק מאחור באמצעות מלקחיים ו- PBS. מלקחיים יבשים וגב הכיסוי באמצעות קימוויפ.
3. יש להחליק בעדינות את הכיסוי בטיפת תמיסת אנטיפייד, תוך הצבת צד הדגימה (צד עם שכבת התא) של הכיסוי על טיפה).
4. תנו לדגימות להתייבש למשך הלילה.

13. הדמיה

1. תמונה עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

תוצאות

שרטוט של MICDDRP מתואר באיור 1. תיוג של דנ"א ורנ"א מלווה באימונוסטיין. השימוש במגברי הסתעפות מגביר את האות, ומאפשר זיהוי של מולקולות של חומצות גרעין בודדות.

איור 1: סכמת MICDDRP וזרימת עבודה שלב אחר שלב. (A) אות bDNA מוגבר באמצעות DNAs מסתעפים ומגברים כדי לשפר את הזיהוי של דנ"א נגיפי (1) ו-RNA (2). גשושיות אולי...

דיון

הדמיה סימולטנית של RNA, DNA וחלבון דורשת לעתים קרובות אופטימיזציה נרחבת. שתי שיטות נפוצות הן תיוג 5-אתיניל-2-דאוקסיורידין (EdU) ודגי DNA. תיוג EdU יושם כדי לדמיין דנ"א ויראלי וחלבון בו זמנית, שכן EdU משולב בדנ"א מתהווה ולאחר מכן מתויג עם צבעים פלואורסצנטיים המכילים אזיד באמצעות כימיה של קליקים. לפיכך, ניתן להשתמש בתיוג EdU כדי לעקוב אחר קינטיקה מקורית של שכפול וירוסים של נגיפי דנ"א או וירוסים באמצעות תבניות דנ"א לשכפול¹². חסרון בתיוג EdU, לעומת זאת, הוא שבחלוקת תאים, הגנום המשוכפל ישלב את...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4% PFA
50% דקסטרן סולפט	אמרסו	198	עבור מאגר היברידיזציה DNA
50X מאגר כביסה	ACD ביו	320058
6 בארות
מגבר מגבר 1-FL	ACD ביו
מגבר 2-FL	ACD ביו
מגבר 3-FL	ACD
Amplifier 4-FL	ACD Bio		Consult Amp-4 טבלה בפרוטוקול
Anti-HCV NS5a נוגדן	Abcam	ab13833	עכבר חד שבטי; עובד עם גנוטיפים של HCV 1a, 1b, 3 ו-4
נוגדן חד שבטי נגד HIV-1 p24	NIH AIDS Reagent Program	3537
נוגדן Anti-Mov10	Abcam	ab80613	ארנב פוליקלונלי
נוגדן נגד PB1	GeneTex	GTX125923	נוגדן נגד חלבון שפעת
אלבומין			מגיב חוסם לצביעה חיסונית
מדיה תאית עם תוספי מזון			מדיה מתאימה לדגם התא
Coverslips
DAPI	ACD Bio		כתם גרעיני (ערכת RNAscope מבית ACD Bio)
תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (1X PBS)	Gibco	14190250	ללא סידן ומגנזיום
אתילן קרבונט	Sigma	E26258
סרום בקר עוברי (FBS)			השתמש ב-FBS ספציפי על סמך איזה נוגדן משני בסרום גדל (למשל FBS עזים)
Fisherbrand colorfrost בתוספת שקופיות מיקרוסקופ	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	נקי מראש
בדיקת HCV-GT2a-sense-C2	ACD Bio	441371	HCV(+) בדיקת RNA חישה
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	HIV-1 cDNA בדיקה
	ACD Bio	317711-C	HIV-1 בדיקת RNA
תנור היברידיזציה HybEZ	ACD Bio	321710/321720
ImmEdge עט מחסום	הידרופובי מעבדות	וקטור H-4000
לק			לאימובוליזציה כיסוי להחלקה לפני טיפול פרוטאז
מים ללא נוקלאז	אמביון	AM9937
פולי-די-ליזין (PDL)			כיסויי מעיל ב-20 ומיקרו; גרם/מ"ל של PDL למשך 30 דקות
מדלל בדיקה	ACD Bio	300041	לדילול RNA C2 או C3 בדיקות
Prolong זהב אנטי-דהייה	Invitrogen	P36930
פרוטאז III	ACD Bio	322337
RNAscope®   בדיקה- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNase A	Qiagen
נוגדנים
שקופיות
נתרן כלורי			עבור מאגר הכלאה של DNA
נתרן ציטראט, pH 6.2			עבור מאגר הכלאת DNA
Tween-20			עבור מאגר היברידיזציה של DNA ובדיקת PBS-T
V-HBV-GTD	ACD ביו	441351	סה"כ HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	בדיקת HBV pgRNA
בדיקה V-HCV-GT2a בדיקה	ACD Bio	441361	בדיקת RNA חיישן HCV(-)
V-HTLV-HBZ-sense-C3	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) בדיקת RNA חישה המכוונת ל-HBZ
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	בדיקת DNA HTLV-1
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	בדיקת RNA חיישת HTLV-1 (+)
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	בדיקת RNA IAV
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	בדיקת RNA חיישת זיקה(+)
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	Zika(-) sense RNA בדיקה