מאמר שיטה

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

DOI:

10.3791/61843

⸱

29 באוקטובר 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכידת תהליכי השכפול וההרכבה הדינמיים של וירוסים הופרעה על ידי היעדר טכנולוגיות הכלאה חזקות באתרן (ISH) המאפשרות תיוג רגיש ובו-זמני של חומצת גרעין וחלבון נגיפיים. שיטות קונבנציונליות של הכלאה פלואורסצנטית של דנ"א באתרן (FISH) לרוב אינן תואמות את האימונוסטינינג. לכן פיתחנו גישת הדמיה, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based d etection של DNA, RNA ו-protein), המאפשרת הדמיה סימולטנית של דנ"א, רנ"א וחלבון. בהשוואה לדגי דנ"א רגילים, MICDDRP משתמש בטכנולוגיית DNA מסועפת (bDNA) ISH, המשפרת באופן דרמטי את הרגישות והזיהוי של בדיקת אוליגונוקלאוטידים. שינויים קטנים של MICDDRP מאפשרים הדמיה של חלבונים נגיפיים במקביל לחומצות גרעין (RNA או DNA) של גדילים שונים. יישמנו את הפרוטוקולים האלה כדי לחקור את מחזורי החיים של פתוגנים נגיפיים מרובים, כולל נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1, נגיף T-לימפוטרופי אנושי (HTLV)-1, נגיף הפטיטיס B (HBV), נגיף הפטיטיס C (HCV), נגיף זיקה (ZKV) ונגיף שפעת A (IAV). הדגמנו שאנחנו יכולים לתייג ביעילות חומצות גרעין וחלבונים נגיפיים במגוון רחב של נגיפים. מחקרים אלה יכולים לספק לנו הבנה מכניסטית משופרת של מערכות נגיפיות מרובות, ובנוסף, לשמש כתבנית ליישום הדמיה פלואורסצנטית מרובת של דנ"א, רנ"א וחלבון על פני ספקטרום רחב של מערכות תאיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שאלפי נוגדנים מסחריים זמינים לתיוג ספציפי של חלבונים באמצעות גישות אימונוסטיזציה קונבנציונליות, ובעוד שניתן להנדס חלבוני היתוך באמצעות תגים פלואורסצנטיים שעברו אופטימיזציה לפוטו-אופטימיזציה למעקב אחר חלבונים מרובים בדגימה1, הדמיה מיקרוסקופית של חלבון לרוב אינה תואמת להכלאה פלואורסצנטית קונבנציונלית של DNA באתרה (FISH)2 . מגבלות טכניות בהדמיה סימולטנית של דנ"א, רנ"א וחלבון באמצעות גישות מבוססות פלואורסצנציה הפריעו להבנה מעמיקה של שכפול הנגיף. מעקב אחר חומצת גרעין נגיפית וחלבון במהלך ההדבקה מאפשר לווירולוגים לדמיין תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס שכפול הנגיףוהרכבתו 3,4,5,6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תאי זרעים (תרחיף לעומת תאים דבקים) על כיסויים או שקופיות תא (פרוטוקול המוצג משתמש בכיסויים).

  1. זריעה של תאי תרחיף
    1. יש להכין כיסויים מצופים פולי-D-ליזין (PDL) (מקל על הדבקות של תאי תרחיף לכיסוי) על ידי הדגירה הראשונה של כיסויים באתנול (EtOH) למשך 5 דקות (מעקר את הכיסויים ומסיר שאריות). לאחר מכן יש לשטוף פי 2 במלח חצוב פוספט (PBS) לפני הדגירה של כיסויים ב-PDL (20 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 30 דקות (דקות) בטמפרטורת החדר (RT).
    2. יש להסיר PDL ולשטוף 2x ב-PBS. תאי גלולה (שנדבקו/טופלו בעבר בהתאם לתנאי ההדמיה הרצויים) והשעתה של 106 תאיםב-50 μL של PBS. יש לזהות 50 μL של תאים על זכוכית (מצופה PDL) ולדגור ב-RT למשך 30 דקות.
    2. ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שרטוט של MICDDRP מתואר באיור 1. תיוג של דנ"א ורנ"א מלווה באימונוסטיין. השימוש במגברי הסתעפות מגביר את האות, ומאפשר זיהוי של מולקולות של חומצות גרעין בודדות.

figure-results-1
איור 1: סכמת MICDDRP וזרימת עבודה שלב אחר שלב. (A) אות bDNA מוגבר באמצעות DNAs מסתעפים ומגברים כדי לשפר את הזיהוי של דנ"א נגיפי (1) ו-RNA (2). גשושיות אולי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה סימולטנית של RNA, DNA וחלבון דורשת לעתים קרובות אופטימיזציה נרחבת. שתי שיטות נפוצות הן תיוג 5-אתיניל-2-דאוקסיורידין (EdU) ודגי DNA. תיוג EdU יושם כדי לדמיין דנ"א ויראלי וחלבון בו זמנית, שכן EdU משולב בדנ"א מתהווה ולאחר מכן מתויג עם צבעים פלואורסצנטיים המכילים אזיד באמצעות כימיה של קליקים. לפיכך, ניתן להשתמש בתיוג EdU כדי לעקוב אחר קינטיקה מקורית של שכפול וירוסים של נגיפי דנ"א או וירוסים באמצעות תבניות דנ"א לשכפול12. חסרון בתיוג EdU, לעומת זאת, הוא שבחלוקת תאים, הגנום המשוכפל ישלב את.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה במלואה או בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 ו- U54 AI150472). אנו מודים לד"ר ריימונד פ. שינזי וסיידי עמיחי על אספקת תאים נגועים בנגיף שפעת A.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4% PFA
50% דקסטרן סולפטאמרסו198עבור מאגר היברידיזציה DNA
50X מאגר כביסהACD ביו320058
6 בארות
מגבר מגבר 1-FLACD ביו
מגבר 2-FLACD ביו
מגבר 3-FLACD
Amplifier 4-FLACD BioConsult Amp-4 טבלה בפרוטוקול
Anti-HCV NS5a נוגדןAbcamab13833עכבר חד שבטי; עובד עם גנוטיפים של HCV 1a, 1b, 3 ו-4
נוגדן חד שבטי נגד HIV-1 p24NIH AIDS Reagent Program3537
נוגדן Anti-Mov10Abcamab80613ארנב פוליקלונלי
נוגדן נגד PB1GeneTexGTX125923נוגדן נגד חלבון שפעת
אלבומיןמגיב חוסם לצביעה חיסונית
מדיה תאית עם תוספי מזוןמדיה מתאימה לדגם התא
Coverslips
DAPIACD Bioכתם גרעיני (ערכת RNAscope מבית ACD Bio)
תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (1X PBS)Gibco14190250ללא סידן ומגנזיום
אתילן קרבונטSigmaE26258
סרום בקר עוברי (FBS)השתמש ב-FBS ספציפי על סמך איזה נוגדן משני בסרום גדל (למשל FBS עזים)
Fisherbrand colorfrost בתוספת שקופיות מיקרוסקופFisher Scientific12-550-17/18/19נקי מראש
בדיקת HCV-GT2a-sense-C2ACD Bio441371HCV(+) בדיקת RNA חישה
HIV-gagpol-C1ACD Bio317701HIV-1 cDNA בדיקה
ACD Bio317711-CHIV-1 בדיקת RNA
תנור היברידיזציה HybEZACD Bio321710/321720
ImmEdge עט מחסוםהידרופובי מעבדותוקטור H-4000
לקלאימובוליזציה כיסוי להחלקה לפני טיפול פרוטאז
מים ללא נוקלאזאמביוןAM9937
פולי-די-ליזין (PDL)כיסויי מעיל ב-20 ומיקרו; גרם/מ"ל של PDL למשך 30 דקות
מדלל בדיקהACD Bio300041לדילול RNA C2 או C3 בדיקות
Prolong זהב אנטי-דהייהInvitrogenP36930
פרוטאז IIIACD Bio322337
RNAscope®   בדיקה- V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221
RNase AQiagen
נוגדנים
שקופיות
נתרן כלוריעבור מאגר הכלאה של DNA
נתרן ציטראט, pH 6.2עבור מאגר הכלאת DNA
Tween-20עבור מאגר היברידיזציה של DNA ובדיקת PBS-T
V-HBV-GTDACD ביו441351סה"כ HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2ACD Bio465531-C2בדיקת HBV pgRNA
בדיקה V-HCV-GT2a בדיקהACD Bio441361בדיקת RNA חיישן HCV(-)
V-HTLV-HBZ-sense-C3ACD Bio495071-C3HTLV-1 (-) בדיקת RNA חישה המכוונת ל-HBZ
V-HTLV1-GAG-C2ACD Bio495051-C2בדיקת DNA HTLV-1
V-HTLV1-GAG-POL-senseACD Bio495061בדיקת RNA חיישת HTLV-1 (+)
V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221בדיקת RNA IAV
V-ZIKA-pp-O2ACD Bio464531בדיקת RNA חיישת זיקה(+)
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2ACD Bio478731-C2Zika(-) sense RNA בדיקה
Bio בסרום בקר HIV-nongagpol-C3משניים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
  2. Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Multiplex Fluorescence ImagingViral Nucleic Acid DetectionViral Protein VisualizationSingle Cell AnalysisBranched DNA ISH TechnologyImmunofluorescent Cell Based DetectionConfocal MicroscopyHIV 1 Infection StudyHBV RNA QuantificationHCV Infection Imaging

מאמרים קשורים