מאמר שיטה

ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים

DOI:

10.3791/62023

⸱

16 במאי 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה מעודנת של ניקוי רקמות פותחה והוחלה על לב העכבר הבוגר. שיטה זו נועדה לנקות רקמת לב צפופה ו autofluorescent, תוך שמירה על פלואורסצנטיות פיברובלסט שכותרתו המיוחסת לאסטרטגיה כתב גנטי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות לב וכלי דם הן הגורם השכיח ביותר לתמותה ברחבי העולם, והוא מסומן לעתים קרובות על ידי פיברוזיס לב מוגבר שיכול להוביל נוקשות חדרית מוגברת עם תפקוד לב שונה. עלייה זו פיברוזיס חדרית לב נובעת הפעלה של פיברובלסטים תושב, אם כי איך תאים אלה פועלים בתוך הלב 3 מימדי (3-D), בבסיס או לאחר ההפעלה, אינו מובן היטב. כדי לבחון כיצד פיברובלסטים תורמים למחלות לב ולדינמיקה שלהם בלב תלת-ממדי, פותחה שיטת ניקוי והדמיה מעודנת המבוססת על CLARITY המציגה פיברובלסטים לבביים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך לב העכבר כולו. פיברובלסטים תושבי רקמות תויגו גנטית באמצעות רוזה26-loxP-eGFP עכברים כתב פלורסנט חצה עם פיברובלסט הלב המבטא Tcf21-MerCreMer לדפוק בקו. טכניקה זו שימשה כדי לבחון דינמיקה לוקליזציה fibroblast לאורך כל החדר השמאלי הבוגר בעכברים בריאים במודלים עכבר סיבי של מחלות לב. מעניין, במודל פציעה אחד, דפוסים ייחודיים של פיברובלסטים לב נצפו בלב העכבר הפצוע שעקב אחר רצועות של סיבים עטופים בכיוון הכווץ. במודלים של פגיעה איסכמית, התרחש מוות פיברובלסטי, ואחריו אכלוס מחדש מאזור הגבול האוטם. באופן קולקטיבי, טכניקת הבהרה זו של רקמת לב מעודנת ומערכת הדמיה דיגיטלית מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של פיברובלסטים לבביים בלב ללא מגבלות של כשל חדירת נוגדנים או בעיות קודמות סביב פלואורסצנטיות אבודה עקב עיבוד רקמות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות cardiomyocytes מהווים את שבר הנפח הגדול ביותר בלב, fibroblasts לב הם בשפע יותר והם מעורבים באופן קריטי בוויסות התכונות המבניות הבסיסיות של איבר זה. פיברובלסטים לבביים הם ניידים מאוד, מגיבים מכנית, ופנוטיפיים הנעים בהתאם למידת ההפעלה שלהם. פיברובלסטים לב נחוצים כדי לשמור על רמות נורמליות של מטריצה חוץ תאית (ECM), וייצור ECM מעט מדי או יותר מדי על ידי תאים אלה יכול להוביל למחלה1,2,3. בהתחשב בחשיבותם במחלות, פיברובלסטים לב הפכו לנושא חשוב יותר ויותר של חקירה לקראת זיהוי אסטרטגיות טיפול חדשניות, במיוחד בניסיון להגביל פיברוזיס מוגזם4,5,6,7. לאחר פציעה, fibroblasts להפעיל ולהבדיל לתוך סוג תא סינתטי יותר המכונה myofibroblast, אשר יכול להיות שגשוג להפריש ECM בשפע, כמו גם יש פעילות התכווצות המסייעת לשפץ את החדרים.

בעוד פיברובלסטים לב הוערכו בהרחבה עבור המאפיינים שלהם בתרבויות 2-D6,8,9,10, הרבה פחות מובן של המאפיינים שלהם ואת הדינמיקה בלב חי 3-D, או בבסיס או עם גירוי המחלה. כאן, שיטה מעודנת תוארה רקמה לנקות את לב העכבר הבוגר תוך שמירה על פלואורסצנטיות של fibroblasts שכותרתו עם Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer מערכת כתב גנטי. בתוך הלב, Tcf21 הוא סמן ספציפי יחסית של פיברובלסטים שקטים4. לאחר טמוקסיפן ניתנת כדי להפעיל את החלבון MerCreMer בלתי ניתן להסבר, למעשה כל fibroblasts רגיעה לצמיתות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) מן הלוקוס Rosa26, אשר מאפשר המעקב שלהם vivo.

קיימים פרוטוקולים רבים לניקוי רקמות מבוססים, שחלקם הוחלו על הלב11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, רבים של ריאגנטים המשמשים פרוטוקולים ניקוי רקמות שונים נמצאו להרוות אותות פלואורסצנטיים אנדוגני18. בנוסף, הלב הבוגר קשה לנקות בשל שפע של חלבונים המכילים קבוצת heme המייצרים שפעת אוטומטית19. לכן, מטרת פרוטוקול זה הייתה לשמר פלואורסצנטיות סמן פיברובלסט עם עיכוב בו זמנית של שפעת אוטומטית heme בלב הבוגר הפצוע להדמיה אופטימלית 3-D ב vivo12,13,14,16,17,20.

מחקרים קודמים שניסו לבחון את פיברובלסט הלב ב vivo השתמשו נוגדנים perfused לתייג תאים אלה, אם כי מחקרים כאלה היו מוגבלים על ידי חדירת נוגדנים ומבנה כלי דם לב14,16,17,20. למרות סלמון ואח 'הראו ניקוי רקמות עם שמירה על פלואורסצנטיות עצבית אקטואלי בלב יילודים, ו Nehrhoff et al. הראו תחזוקה של פלואורסצנטיות סימון תאים מיאלואידיים, שמירה על פלואורסצנטיות אנדוגני דרך כל הקיר החדרי עדיין לא הוכח, כולל הדמיה של fibroblasts לב למבוגרים בבסיס או בעקבות פציעה13,20. פרוטוקול ניקוי רקמות זה מזקק תערובת של פרוטוקולים קודמים המבוססים על שיטת CLARITY (מערכת ממסים נוקשה אקרילאמיד-היברידית-היברידית/חיסונית/בהידרוגל רקמה תואמת איטו-הכלאה) ו- PEGASOS (מערכת ממס הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG). פרוטוקול מעודן זה התיר בדיקה חזקה יותר של פיברובלסטים לב בלב העכבר בבסיס וכיצד הם מגיבים לסוגים שונים של פציעה. הפרוטוקול הוא פשוט לשחזור יעזור לאפיין את ההתנהגות של פיברובלסטים לב vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי. המוסד הוא גם AAALAC (האגודה האמריקאית להסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה) מוסמך. עכברים עברו המתת חסד באמצעות נקע בצוואר הרחם, ועכברים שעברו ניתוחי הישרדות קיבלו הקלה בכאב (ראו להלן). כל השיטות המשמשות לטיפול בכאב והמתת חסד מבוססות על המלצות הפאנל על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית. כל העכברים שוכנו ביחידות מצעים עם קלח תירס עם מים ומזון זמין בכל עת. עכברים שוכנו 4 לכלוב עם אותו המין. לצורך ניתוח או ניקוי רקמות לא נפגעו, נעשה שימוש במספרים שווים של עכברים זכריים ונקביים בני 6-8 שבועות.

הערה: תנאים כירורגיים סטריליים נשמרו בכל הניתוחים. המנתח החליף לשפשוף נקי ושמלה סטרילית ואז לבש כיסויי נעליים ורשת שיער. לאחר מכן, המנתח שפשף את ידיהם בכלורהקסידין וחבש כפפות כירורגיות סטריליות. המנתח נעזר בטכנאי שהרדים, גילח וקרצף את אתר החתך 3 פעמים כל אחד, לסירוגין בין 2% כלורוקסידין גלוקונאט ו 70% isopropanol. לאחר מכן הובאו העכברים למנתח ובוצעו ניתוחים. בין בעלי חיים, המכשירים היו מעוקרים בסטריילר חרוזים.

1. שילוב מחדש של הקרן

  1. עכברי קרוס רוזה26-לוקס-eGFP (רוזה26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) עם עכברי Tcf21-MerCreMer(איור 1A)6,21.
  2. כאשר צאצאיו של צלב זה מגיעים לגיל 6 שבועות, לנהל זריקה תוך-פריטונית של 75 מ"ג/ק"ג של טמוקסיפן מומס בשמן תירס. 22 נהל טמוקסיפן זה פעמיים, בהפרש של 48 שעות זה מזה (איור 1B).
  3. לאחר זריקות טמוקסיפן, לשים את העכברים על דיאטה של מזון טמוקסיפן (~ 0.4 גרם / ק"ג טמוקסיפן ציטראט) במשך שבוע אחד. לאחר שבוע של צ'או טמוקסיפן, החזירו את העכברים לתזונת צ'או אוטו-חלבית רגילה למשך שבוע לפני ביצוע הניתוח (איור 1B). לייעד מספר מתאים של עכברים (3 לכל מצב כירורגי) להיות פקדים לא נפגעים. להקריב את העכברים האלה, ולהמשיך את תהליך הסליקה להלן לאחר שבוע אחד של דיאטה צ'או נורמלי.
  4. בעקבות משטר טמוקסיפן ושילוב מחדש, לבצע ניתוח.

2. מודלים כירורגיים

  1. איסכמיה/רפרופוזיה (I/R)23,24
    1. להרדים עכברים עם 1.5% גז isoflurane באוויר החדר בקופסה מאווררת; לגלח את החזה והצוואר שלהם עם קוצץ חשמלי, ולאחר מכן לשפשף את האזורים המגולחים עם 2% כלורהקסידין גלוקונאט ספוג ספוג.
    2. השתמש משחת דמעה מלאכותית כדי למנוע יובש במהלך הניתוח על ידי הנחת משחה על העיניים של עכברים מסוממים.
    3. בצע חתך באמצע הצוואר באמצעות מספריים כירורגיים כדי לאפשר הדמיה של קנה הנשימה. לצנרר עם קטטר 20 G על ידי הצבת צינור הצנרור לתוך קנה הנשימה לדמיין את קטטר קנה הנשימה דרך החתך באמצע הצוואר. מניחים את העכברים על מאוורר בזמן מסומם עם גז isoflurane (1.5%) באוויר החדר.
    4. לעשות חתך מתחת לאיבר הקדמי השמאלי עם מספריים כירורגיים, לחתוך את השרירים הבין צלעיים בין צלעות 3 ו 4. מורחים את הצלעות פתוחות באמצעות מפשק.
    5. מניחים ספוג קטן ספוג מלוחים בין הריאה ללב כדי למנוע נזק לריאה.
    6. באמצעות מחט צחצוח דגים (6.5 מ"מ, 3/8 ג), לקשור את העורק הכלילי השמאלי עם קשר להחליק לשחרור באמצעות 8-0 פרולין, פרולין.
    7. הסר את הספוג באמצעות מלקחיים.
    8. לתפור את השרירים הבין צלעיים סגורים באמצעות משי קלוע 4-0 ותפר מתמשך תוך החיצוניות של סוף 8-0 קשר החלקת פרולין.
    9. סגור את החתכים בעור באמצעות דבק רקמה אקטואלי עם סוף הקשר להחליק חסימה בולטת.
    10. לאחר שעה אחת של חסימה, משוך את הקצה החיצוני של קשר ההחלקה כדי לשחרר באופן פנימי את חסימת העורקים הכליליים, להקל על האיסכמיה ולגרום להפרכה.
    11. לנהל 0.02 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל מהדורה מורחבת buprenorphine באמצעות הזרקה תת עורית (שחרור 72 שעות) כמו משכך כאבים, ומניחים את העכברים בתא דגירה מחומצן ב 37 מעלות צלזיוס, בנפרד מבעלי חיים אחרים. לפקח על העכברים לפחות כל 15 דקות עד שהם התאוששו מהרדמה והם מסוגלים לשמור על תנוחת עצם החזה או יושב. להחזיר את העכברים לדיור הרגיל שלהם.
    12. להעריך את בעלי החיים עבור כאב ומצוקה במשך 48 שעות לאחר הניתוח, ולפקח על אתר החתך מדי יום עד החלמה מלאה.
    13. שימו לב לעכברים על הידרציה, הזנה ורווחה כללית לאחר הניתוח עד להקרבה.
  2. אוטם שריר הלב (MI)25,26,27
    1. בצע שלבים 2.1.1–2.1.7.
    2. השתמש תפר מתמשך כדי לסגור את השרירים הבין צלעיים באמצעות 4-0 משי קלוע.
    3. סגור את החתך בעור באמצעות דבק רקמה אקטואלי.
    4. בצע שלבים 2.1.11–2.1.13.
  3. אנגיוטנסין II/פנילפרין מיקרו-אוסמוטי משאבה עירוי
    1. הכן פתרון עבודה 10 מיקרוגרם / μL של אנגיוטנסין II ו 500 מיקרוגרם / μL פתרון עבודה של פנילפרין בתנאים סטריליים (כלומר, במכסה המנוע זרימה למינארית) על ידי הוספת 1 מ"ג של אנגיוטנסין II כדי 100 μL של מלוחים אגירה סטרילי פוספט (PBS) ו 250 מ"ג של פנילפרין הידרוכלוריד לתוך 500 μL של PBS.
    2. לחשב את הדילול של כל פתרון עבודה ואת הנפח הסופי כדי לוותר על משאבה מיקרו אוסמוטית המבוססת על משקל העכבר.
      הערה: לדוגמה, עכבר 20 גרם דורש 20 גרם x 14 ימים x 1.5 מיקרוגרם ליום = 420 מיקרוגרם אנגיוטנסין, או 42 μL של פתרון עבודה, כמו גם 20 גרם x 14 ימים x 50 מיקרוגרם ליום = 14000 מיקרוגרם פנילפרין הידרוכלוריד, או 28 מיקרוגרם של פתרון עבודה.
    3. עבור המשקל של כל עכבר, לדלל את מלאי העבודה של התרופה PBS סטרילי ולמלא את משאבות מיקרו אוסמוטי (0.25 μL / h, 14 ימים, כ 100 μL) באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מ"ל.
      הערה: זה ייצור קצב זרימה של 1.5 מיקרוגרם ∙ g-1∙ יום-1 של אנגיוטנסין II ו 50 מיקרוגרם ∙ g-1∙ יום-1 של פנילפרין הידרוכלוריד פעם ממוקם בעכברים.
    4. יש להרדים את העכברים עם שאיפת 1.5% isoflurane (להשפעה) בתא מאוורר המכיל אוויר בחדר.
    5. מניחים את העכברים המרדים על שולחן כירורגי סטרילי בתנוחת האופין, ושומרים על הרדמה עם שאיפת גז isoflurane (1.5%) דרך קונוס אף.
    6. השתמש משחת דמעה מלאכותית על העיניים של החיה כדי למנוע יובש במהלך הניתוח.
    7. לגלח את הפרווה על אזור ההשתלה עם קוצץ שיער חשמלי, לעקר את האזור להיחתך באמצעות אתנול ספוגית סטרילית. בצע חתך קטן (כ 1 ס"מ) עם מספריים כירורגיים בשכבת האפידרמיס של עור העכבר בצד הצדדי הימני של הגב, מתחת להב הכתף. השתמש בצדדים המשעממים של זוג מספריים כירורגיים כדי למתוח בעדינות את העור באזור ההשתלה ובסביבתו כדי להכניס את המיני-קאמפ.
    8. מניחים את המשאבה המיקרו-אוסמוטית בתוך החתך, ומתמרנים אותה פיזית משמאל לקו האמצע הגבי של העכבר על ידי עיסוי ידני של המשאבה מתחת לעור.
    9. סגור את החתך באמצעות תפר מתמשך באמצעות משי 4-0 עם מחט נקודה להתחדד.
    10. לאחר השתלת משאבה, לנהל buprenorphine שחרור איטי במינון של 0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף באמצעות הזרקה תת עורית עבור משככי כאבים (שחרור איטי 72 שעות). מניחים את העכברים בתא דגירה מחומצן ב 37 מעלות צלזיוס, בנפרד מבעלי חיים אחרים. לפקח על העכברים לפחות כל 15 דקות עד שהם מתאוששים מהרדמה והוא יכול לשמור על תנוחת עצם החזה או ישיבה.
    11. לאחר התאוששות מהרדמה בתא ההתחממות של 37 מעלות צלזיוס, החזירו את העכברים ליחידות הדיור הסטנדרטיות שלהם.
    12. לפקח על העכברים עבור כאב ומצוקה במשך 48 שעות לאחר הניתוח, ולפקח על אתר החתך מדי יום עד החלמה מלאה.
    13. שימו לב לעכברים על הידרציה, הזנה ורווחה כללית לאחר הניתוח עד להקרבה.

3. ניקוי לבבות עכבר בוגרים באמצעות פרוטוקול CLARITY פעיל שונה

  1. הכינו אזור כירורגי נקי על ידי עיקור משטח הניתוח וכל הכלים הכירורגיים עם 70% אתנול. הכינו פתרון של 1x PBS קר ו 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS (100 מ"ל כל אחד). ללבוש כפפות, חלוק מעבדה, מסכת פנים, והגנה על העיניים.
  2. הכן חיץ הפרין על ידי דילול 10 יחידות של הפרין ב 0.9% w / v פתרון נתרן כלורי. הזרק כל עכבר תוך-פיוריטוני עם 60 μL של הפרין-NaCl באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 27 G.
  3. חמש דקות לאחר הזרקת פתרון הפרין-NaCl, להרדים את העכברים באמצעות שאיפת 1.5% isoflurane (כדי להשפיע) בתא מאוורר המכיל אוויר החדר.
  4. המתת עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם, שבו החלק האחורי של הראש מוחזק עם הקצה השטוח, סגור של מלקחיים, בעוד עמוד השדרה נקע על ידי משיכת הזנב.
  5. נקה את משטח הגחון של העכבר עם 70% אתנול על צמר גפן. בצע חתך רוחבי 3 ס"מ כ 3 ס"מ מתחת לתהליך xiphoid באמצעות מספריים כירורגיים.
  6. להפריד את העור מרקמת דופן הבטן הבסיסית על ידי degloving את הבטן עד תהליך xiphoid (להחזיק את העור הקרוב ביותר לזנב ולמשוך את העור הקרוב ביותר לראש כלפי מעלה לכיוון בית החזה). הפוך חתך רוחבי 2 ס"מ ברקמת דופן הבטן התת עורית 3 ס"מ מתחת לתהליך xiphoid באמצעות מספריים כירורגיים. בצע חתך אנכי מחתך רוחבי זה, במעלה קו האמצע ודרך בית החזה. תצמיד את בית החזה בחזרה, חושף את הלב.
  7. השתמש במחט 27 G ומזרק 10 מ"ל כדי להזריק PBS קר לתוך וריד ורידים מעולה ואבי העורקים (כל מניפולציה מיקום של הלב צריך להיעשות בזהירות עם מלקחיים קהים כדי למנוע לנקב) כדי לנקות את הדם מהלב.
    הערה: ניתן לציין זלוף מספיק על ידי עווית זנב ושינוי צבע של הריאות.
  8. השתמש במחט 27 G ומזרק 10 מ"ל להזריק קר 4% PFA לתוך הווריד הווריד מעולה אבי העורקים כדי להתחיל את תהליך הקיבעון.
  9. לתמצת את הלבבות. יש להפריד את האטריה, החדר הימני והמחיצה, והחדרי השמאלי באמצעות אזמל להב ישר. מניחים את הרקמה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל מלא קר 4% PFA, ומניחים על מאגף ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
  10. לשטוף את הלב 3 פעמים עבור 1 h כל אחד עם קר 1x PBS כדי להסיר PFA עודף.
  11. הכן את הידרוג'ל (נקרא A4P0 עבור הרכב אקרילאמיד /פוליאקרילאמיד יחסי) על ידי ערבוב הכימיקלים הבאים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל: 10% של 40% אקרילאמיד, 10% 1x PBS, 80% מים מזוקקים.
  12. הוסף את הפתרון 0.25% של photoinitiator (2,2-אזוביס[2-(2-imidazolin-2yl)propane)dihydrochloride) לפתרון הידרוג'ל רק לפני שקוע הלב הידרוג'ל.
  13. מניחים את הלב בצינור חרוט המכיל את הידרוג'ל. עוטפים את הצינור החרוט בנייר כסף, ודגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס ללא הפרעה פיזית.
  14. לאחר כ 14 שעות ב 4 מעלות צלזיוס, להעביר את הצינור חרוט המכיל את הלב לאמבט חרוזים 37 מעלות צלזיוס.
  15. לאחר 2.5 שעות באמבט החרוזים, להסיר את הלב מן הידרוג'ל בזהירות עם מלקחיים.
  16. לשטוף את הלבבות 3 פעמים עבור 1 שעות כל אחד בצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 1x PBS ב 37 מעלות צלזיוס על מאגף.
  17. מניחים את הלבבות בסל של מכונת האלקטרופורזה הפעילה באמצעות מלקחיים, ומניחים את המכסה על הסל. ודא שהמכסה נמצא במקום.
  18. מלא את מאגר תא האלקטרופורזה הפעיל בתמיסת סליקה אלקטרופורטית על ידי שפיכת פתרון לתוך התא.
  19. ברגע שהתא מלא בתמיסת סליקה אלקטרופורטית, הסל המכיל את הלב יכול להיות שקוע. הנח את המכסה על מכונת האלקטרופורזה בצורה מאובטחת.
  20. הפעל את מכונת האלקטרופורזה ב 1.5 A, 37 °C (60 °F) עבור 1.5 שעות.
  21. לאחר 1.5 שעות של אלקטרופורזה, לבדוק את הלבבות חזותית כדי להבטיח כי אין רקמה אטומה נשאר. אם אזורים של הרקמה עדיין אטומים, להטביע מחדש את הלב בתמיסת אלקטרופורזה בתא האלקטרופורטי, ולהמשיך electrophoresis במשך 0.5 שעות בכל פעם.
    הערה: יש להפסיק את האלקטרופורזה בסימנים ראשונים של נזק לרקמות (כגון שבירת רקמות).
  22. לשטוף את הלבבות בצינור חרוט 15 מ"ל המכיל 1x PBS עבור 1 שעה, 3 פעמים כל אחד, ב 37 מעלות צלזיוס על מאגוז.
  23. לטבול את הלבבות בצינור חרוט 15 מ"ל המכיל N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)אתילנדיאמין – סוכן decolorizing המפחית שפעת אוטומטית heme.
    הערה: פתרון זה צריך להיות שונה כל 24 שעות עד הלבבות ברורים לחלוטין (כ 2 ימים).
  24. לשטוף את הלבבות בצינור חרוט 15 מ"ל עם 1x PBS 3 פעמים עבור 1 h כל אחד כדי להסיר עודף decolorizing סוכן.
  25. הכן פתרון התאמת אינדקס שבירה (RIMS) על ידי שילוב של 30 מ"ל של מאגר פוספט M 0.02, 40 גרם של 5-(N-2, 3-דיהידרוקסיpropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,N'-bis (2, 3 דיהידרוקסיפרופיל) isophthalamide עם ערבוב (חייב להיות מומס לחלוטין - זה יכול לקחת עד שעה), 5 מ"ג של נתרן אזיד, 50 μL של Tween20, ו 1 גרם של 1,4-diazabicyclo[2.2.2]אוקטן, ולהתאים את ה- pH ל 7.5.
  26. משווים את הלבבות ב- RIMS למשך 48 שעות לפני ההדמיה.

4. הדמיה ניקתה לבבות באמצעות מיקרוסקופ פוטון קונפוקאלי יחיד זקוף

הערה: מנגנון ההדמיה מורכב מהמחצית התחתונה של צלחת פטרי מזכוכית 10 ס"מ, מאגר תחתון מודפס בתלת-ממד, כיסוי זכוכית עגול ומאגר עליון מודפס בתלת-ממד(איור 1C-E). חומרים מודפסים בתלת מימד נעשו בתוך הבית על ידי מחלקת ההנדסה הקלינית של בית החולים לילדים בסינסינטי.

  1. השתמשו בשמן ואקום כדי לאטום את המאגר התחתון המודפס בתלת-ממד לצלחת פטרי מזכוכית על-ידי הנחת שכבה דקה של שומן ואקום בתחתית היצירה המודפסת בתלת-ממד(איור 1C).
    הערה: המאגר צריך להיות באותו גובה כמו המדגם להיות בתמונה (כלומר, המדגם לא צריך להיות דחוס על ידי כיסוי זכוכית להציב על גבי זה, ואת המדגם גם לא צריך להיות מסוגל לצוף ולנוע בתוך המאגר).
  2. מלא את המאגר ב- RIMS והסר את כל הבועות עם קצה צינור. הנח את הלב ב- RIMS בזהירות עם הקיר החדר השמאלי הפונה כלפי מעלה, להבטיח כי אין בועות שהוכנסו לתוך הפתרון.
  3. הדבקת כיסוי זכוכית על המשטח התחתון של פיסת המאגר העליונה המודפסתבתלת-ממד (איור 1A משלימה)באמצעות גריז ואקום (שוב על-ידי הנחת שכבה דקה של שומן ואקום על החלק המודפס בתלת-ממד והנחתו על החלקה העליונה)(איור 1D).
  4. מניחים את כיסוי הזכוכית ואת המאגר העליון, מכסה את הצד כלפי מטה, על המאגר התחתון (איור משלים 1B),ללא כניסתה של בועות. הדבקה בין ה-RIMS לתעודת הכיסוי תספק חותם בין חלקי המאגר העליונים והתחתונים(איור 1E).
  5. מלא את המאגר העליון עם גליצרול לשימוש עם המטרה טבילה גליצרול 10x.
  6. השתמש במיקרוסקופ פוטון יחיד המצויד בראש סריקה קונפוקלית רב-פוטון כדי לדמות את הלבבות המנוקים.
  7. מנמיכים את השלב של מיקרוסקופ הפוטוני הבודד ומניחים את צלחת הפטרי המכילה את הדגימה במרכז הבמה. הרם את הבמה והורד את מטרת הטבילה גליצרול 10x לתוך גליצרול במאגר העליון של מנגנון המדגם. ודא שהדגימה נמצאת במוקד על-ידי התבוננות בקצה המדגם באמצעות העיניים.
  8. עבור מתצוגת eyepiece לתצוגת מצלמה במחשב על-ידי לחיצה על הכפתור החי.
    1. הגדר את הפרמטרים X ו- Y על ידי איתור הראשון את החלק הרחב ביותר של דגימת הרקמה, אשר צריך להיות בתחתית צלחת פטרי.
    2. לחץ על רכישת ND ונקודות מרובות מותאמות אישית. צור נקודות מרובות על-ידי מציאת אמצעי דגימת הרקמה תחילה באמצעות מוט ההיגוי כדי לטאטא משמאל לימין ומלמעלה למטה.
    3. לאחר מכן, בהתבסס על גודל הרקמה, קבעו את גודל הריצוף הדרוש (בדרך כלל 6 x 5 ללב עכבר בן 6-8 שבועות). עשה זאת על-ידי הפעלת הדמיית בדיקה על-ידי לכידת פרמטרי X ו- Y בלבד (בטל את הסימון z תחת הכרטיסיה רכישת ND) כדי לבדוק אם כל האורך והרוחב של הרקמה נלכדו.
  9. כדי להגדיר פרמטרי z, פתח את הניווט ב- XYZולחץ על הסמלים למעלה ולמטה עד שתמצא את החלק העליון והתחתון של המדגם.
    1. פתח את לוח תיקון עוצמת Z והתאם את הפלואורסצנטיות בחלק העליון, האמצעי והתחתון של הרקמה כדי לתקן את צפיפות הרקמות על-ידי הגדלה או הקטנה של עוצמת הלייזר בכל נקודת z. הגדר אותם על-ידי לחיצה על החץ המוגדר מימין ללוח 'תיקון עוצמת Z'.
    2. הגדר את גודל שלב Z בחלונית רכישת ND ל- 5 מיקרומטר.
  10. לאחר הפרמטרים X, Y, ו- Z של הלב מוגדרים תיקון בעוצמת z מוגדר, להשתמש במיקרוסקופ זקוף אוטומטי עם המטרה 10x גליצרול טבילה עם סורק מהדהד וצינורות גליום ארסניד פוסמולטיי (GAAsP PMTs) כדי לדמות את הלבבות פינה. ודא שהכרטיסיות XY ו- Z מסומנות תחת רכישת NDוהקש על הפעל תיקון Z.
  11. Stitch, unmix, ו denoise את התמונות וכתוצאה מכך על ידי פתיחת התמונה multipoint בתוכנת העיבוד ולחיצה על כפתור התפר. תחת תמונה, לחץ על unmixing עיוור, 2 ערוץ, ולאחר מכן למצוא. ותחת תמונה, לחץ על denoise.ai, ולאחר מכן לחץ על הערוץ פלואורסצנטי של בחירה (כלומר, GFP).
    הערה: תהליך זה גורם לתמונה תלת-ממדית של פיברובלסטים חיוביים של GFP בכל החדר השמאלי.
  12. השתמש בתוכנת ניתוח משנית כדי לזהות עוד יותר דפוסים ומגמות בפיזור פיברובלסטים לבביים. השתמש בפונקציה כתמים על-ידי הפעלת תוכנית אשף הנקודות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברובלסטים לבביים חיוניים לתפקוד בסיסי של הלב, כמו גם לתגובה לפגיעה לבבית. ניסיונות קודמים להבין את הסידור והמורפולוגיה של תאים אלה נערכו בעיקר בהגדרות דו-ממדיות. עם זאת, פורסמה טכניקת הדמיה תלת-ממדית מעודנת של רקמת לב (איור 2)ותל-ממדית, המאפשרת הדמיה מתקדמת ומפורטת יותר של פיברובלסטים לבביים. בטכניקת הדמיה זו נמצאו פיברובלסטים צפופים בעלי מורפולוגיה מרוכלת בלבבות לא נפגעים(איור 3, סרטונים משלימים S1–4).

לאחר ניקוי ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שיטה מעודנת לניקוי רקמות המאפשרת הדמיה של פיברובלסטים לבביים ב vivo, הן בבסיס הפציעה והן בעקבותיה, כדי לאפיין ולהבין טוב יותר פיברובלסטים בלב העכבר. פרוטוקול משופר זה מטפל במגבלות בפרוטוקולים קיימים לניקוי רקמות שניסו לזהות סוגי תאים ספציפיים בלב הבוגר או בילודים12,13,14,16,17,20. בניסיונות הראשונים לנקות את לב ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין גילויים הקשורים לתוכן כתב היד הזה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להכיר את CCHMC Confocal הדמיה ליבה על הסיוע וההדרכה שלהם בפיתוח של מודל זה, כמו גם מאט באטי מהנדסה קלינית עבור העיצוב של כל החלקים המודפסים 3D. דמטריה פישר נתמכה על ידי מענק הכשרה מהמכונים הלאומיים לבריאות (NHLBI, T32 HL125204) וג'פרי ד. מולקנטין נתמך על ידי המכון הרפואי הווארד יוז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-0 משי קלועEthiconK871H
8-0 פרולןEthicon 8730H
40% תמיסת אקרילאמידBio-Rad1610140
Angiotensin IISigmaA9525-50G
משחת דמעות מלאכותיתCovetrus048272
DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2. 2] אוקטן)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture דבק רקמות מקומיWorld Precision Instruments503763
HeparinSigmaH0777
Imaris Start Analysis SoftwareOxford InstrumentsN/A
משאבות מיקרו-אוסמוטיותAlzetדגם 1002
Nikon Elements Analysis SoftwareNikonN/A
ניקון A1R HD מיקרוסקופ זקוףNikonN/A
צ'או אוטוקלאב רגילLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide		CosmoBioAXS-1002424
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
פנילפרין הידרוכלורידסיגמאP6126-10G
פוטו-יוזםWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-GT (ROSA) 26Sortm1 (CAG-lacZ, -EGFP) Glh/J ]Jackson LaboratoriesJax מלאי מס 012429
נתרן אזידסיגמא אולדריץ'S2002-5G
תמיסת נתרן כלורידHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
טמוקסיפןסיגמא אולדריץ'T5648
טמוקסיפן מזוןEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, חומר להסרת צבעMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity תא פינוי אלקטרופורטיLogos BiosystemsC30001
X-Clarity פתרון ניקוי אלקטרופורטיLogos BiosystemsC13001
X-Clarity סל רקמות אלקטרופורזהLogos BiosystemsC12001
מחזיק סל רקמות אלקטרופורזה X-Clarity LogosBiosystemsC12002

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434(2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573(2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406(2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072(2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188(2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tissue ClearingCardiac FibroblastsCLARITY ProtocolThree Dimensional ImagingMouse HeartCardiac InjuryConfocal MicroscopyFibrosis ModelElectrophoretic ClearingFluorescent Labeling

מאמרים קשורים