מאמר שיטה

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

DOI:

10.3791/62061

⸱

5 בינואר 2021

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטבולומיקה היא מתודולוגיה המשמשת לזיהוי וכימות של מתווכים ותוצרים רבים במשקל מולקולרי נמוך ומוצרים של חילוף חומרים בתוך תא, רקמה, איבר, נוזל ביולוגי או אורגניזם. מטבולומיה מתמקדת באופן מסורתי במטבוליטים מסיסים במים. המטבולום המסיס במים הוא התוצר הסופי של רשת סלולרית מורכבת המשלבת גורמים גנומיים, אפיגנומיים, שעתוקיים, פרוטאומיים וסביבתיים שונים. לפיכך, הניתוח המטבולומי מעריך ישירות את התוצאה של הפעולה עבור כל הגורמים האלה בשפע של תהליכים ביולוגיים בתוך אורגניזמים שונים. אחד האורגניזמים האלה הוא שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae, אאוקריוטה חד-תאית עם הגנום הרצף המלא. מכיוון ש- S. cerevisiae מקובל על ניתוחים מולקולריים מקיפים, הוא משמש כמודל לניתוח מנגנונים שבבית תהליכים ביולוגיים רבים בתוך התא האוקריוטי. שיטה אנליטית רב-תכליתית להערכה כמותית חזקה, רגישה ומדויקת של מטבולום מסיס במים תספק את המתודולוגיה החיונית לניתוח מנגנונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור התנאים הממוטבים של פעילות מטבולית מרווה פנימה ומיצוי מטבוליט מסיס במים מתאי S. cerevisiae. הפרוטוקול מתאר גם את השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית (LC-MS/MS) לניתוח כמותי של מטבוליטים מסיסים במים שחולצו. שיטת LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת המתוארת כאן היא רב-תכליתית וחזקה. היא מאפשרת זיהוי וכימות של יותר מ-370 מטבוליטים מסיסים במים בעלי תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות, כולל איסומרים מבניים שונים וצורות סטריאואימוזוריות של מטבוליטים אלה. מטבוליטים אלה כוללים מולקולות נושאות אנרגיה שונות, נוקלאוטידים, חומצות אמינו, מונוסכרידים, מתווכים של גליקוליזה, ומתווכים מחזור tricarboxylic. שיטת LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת רגישה ומאפשרת זיהוי וכמות של כמה מטבוליטים מסיסים במים בריכוזים נמוכים ככל 0.05 pmol / μL. השיטה שימשה בהצלחה להערכת מטבולומים מסיסים במים של תאי שמרים מסוג בר ומוטנטים בתרבית בתנאים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטבוליטים מסיסים במים הם מתווכים במשקל מולקולרי נמוך ומוצרים של חילוף החומרים התורמים לתהליכים תאיים חיוניים. תהליכים אלה השמורים אבולוציונית כוללים המרה של חומרים מזינים לאנרגיה שמישה, סינתזה של macromolecules, צמיחה תאית איתות, בקרת מחזור התא, רגולציה של ביטוי גנים, תגובת מתח, ויסות לאחר תרגום של חילוף החומרים, שמירה על פונקציונליות מיטוכונדריאלית, סחר תאי אופניים, autophagy, הזדקנות תאית, ומוות תאים מוסדר1,2,3.

רבים מהתפקידים החיוניים האלה של מטבוליטים מסיסים במים התגלו על ידי מחקרים בשמרים ניצנים S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. אאוקריוטה חד-תאית זו היא אורגניזם מודל שימושי לניתוח מנגנונים שבאמצעותם מטבוליטים מסיסים במים תורמים לתהליכים תאיים בשל נוחותו לנתחים ביולוגיים ביוכימיים, גנטיים ומולקולריים מתקדמים23,24,25,26. למרות שיטות LC-MS/ MS של מטבולומיקה לא ממוקדת שימשו לחקר התפקידים של מטבוליטים מסיסים במים בשמרים ניצנים3,18,22,27, סוג זה של ניתוח דורש שיפור הרבגוניות שלה, חוסן, רגישות, ואת היכולת להבחין בין איזומרים מבניים שונים וצורות סטריאויזומריות של מטבוליטים אלה.

השנים האחרונות מאופיינות בהתקדמות משמעותית ביישום שיטות LC-MS/MS של מטבולומיה לא ממוקדת ליצירת פרופיל של מטבוליטים מסיסים במים ב- vivo. עם זאת, אתגרים רבים בשימוש במתודולוגיה זו נשארים2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. אתגרים אלה כוללים את הדברים הבאים. ראשית, הריכוזים התאיים של מטבוליטים מסיסים במים רבים נמצאים מתחת לסף הרגישות לשיטות הנמצאות בשימוש כיום. שנית, היעילות של מרווה פעילות מטבולית נמוכה מדי, והיקף דליפת התאים הקשורים להרוותה של מטבוליטים תאיים גבוה מדי עבור השיטות הנוכחיות; לפיכך, השיטות הנמצאות בשימוש כיום בהערכת הריכוזים התאיים של מטבוליטים מסיסים במים. שלישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להבדיל בין האיסומרים המבניים (כלומר, מולקולות עם אותה נוסחה כימית אך קישוריות אטומית שונה) או סטריאוטיומרים (כלומר, מולקולות עם אותה נוסחה כימית וקישוריות אטומית, אך עם הסידור האטומי השונה בחלל) של מטבוליטים ספציפיים; פעולה זו מונעת ביאור נכון של מטבוליטים מסוימים על ידי השיטות הנמצאות בשימוש כיום. רביעית, מסדי הנתונים המקוונים הספקטרליים ההמוניים הקיימים של יונים הורים (MS1) ויונים משניים (MS2) אינם שלמים; זה משפיע על הזיהוי הנכון וכמות של מטבוליטים ספציפיים באמצעות נתוני LC-MS/ MS גולמיים המיוצרים בעזרת השיטות הנוכחיות. חמישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להשתמש בסוג יחיד של מיצוי מטבוליט כדי לשחזר את כל או רוב המעמדות של מטבוליטים מסיסים במים. שישית, השיטות הקיימות אינן יכולות להשתמש בסוג יחיד של עמודת LC כדי להיפרד זו מזו כולה או רוב הקטגוריות של מטבוליטים מסיסים במים.

כאן, אנו ממוטבים תנאים להרוות פעילות מטבולית בתוך תאי S. cerevisiae, שמירה על רוב מטבוליטים מסיסים במים בתוך תאים אלה לפני החילוץ, וחילוצת רוב המעמדות של מטבוליטים מסיסים במים מתאי שמרים. פיתחנו שיטה רב-תכליתית, חזקה ורגישה לזיהוי וכימות מבוססי LC-MS/MS של יותר מ-370 מטבוליטים מסיסים במים שחולצו מתאי S. cerevisiae. שיטה זו של מטבולומיה לא ממוקדת מאפשרת להעריך את הריכוזים התאיים של מולקולות נושאות אנרגיה שונות, נוקלאוטידים, חומצות אמינו, מונוסכרידים, מתווכים של גליקוליזה, ומתווכים מחזור tricarboxylic. שיטת LC-MS/MS המפותחת מאפשרת זיהוי וכימות של איסומרים מבניים שונים וצורות סטריאואימוזוריות של מטבוליטים מסיסים במים בעלי תכונות מבניות, פיזיות וכימיות מגוונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ביצוע וחיטוי מדיום לגידול שמרים

  1. הפוך 180 מ"ל של תמצית שמרים מלאה עם bactopeptone (YP) בינוני. מדיום YP המלא מכיל 1% (w/v) תמצית שמרים ו 2% (w/v) bactopeptone.
  2. יש לפזר 180 מ"ל של מדיום YP באופן שווה לארבעה בקבוקוני ארלנמאייר 250 מ"ל. כל אחד מהבקבוקונים האלה מכיל 45 מ"ל של מדיום YP.
  3. לחטא את הבקבוקונים עם YP בינוני על ידי autoclaving ב 15 psi / 121 °C (45 דקות).

2. זן שמרים מסוג בר

  1. השתמש בזן BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. גידול שמרים במדיום YP המכיל 2% גלוקוז

  1. לחטא 20% (w/v) פתרון מלאי של גלוקוז על ידי autoclaving ב 15 psi /121 °C (45 דקות).
  2. הוסף 5 מ"ל של תמיסת מלאי autoclaved 20% (w / v) של גלוקוז לכל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer עם 45 מ"ל של מדיום YP מעוקר. הריכוז הסופי גלוקוז במדיום YP הוא 2% (w/v).
  3. השתמש בלולאה מיקרוביולוגית כדי לחסן תאי שמרים לתוך כל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer עם מדיום YP המכיל 2% גלוקוז.
  4. לגדל את תאי שמרים לילה ב 30 °C (50 °F) בשייקר סיבוב להגדיר ב 200 סל"ד.
  5. קח aliquot של תרבות שמרים. לקבוע את המספר הכולל של תאי שמרים לכל mL של תרבית. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.

4. העברת תאים לתאים ולגידול במדיום YP עם 2% גלוקוז

  1. הוסף 5 מ"ל של פתרון מלאי מעוקר 20% (w / v) של גלוקוז לכל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer הנותרות עם מדיום YP autoclaved. הריכוז הסופי של גלוקוז הוא 2% (w/v).
  2. העבר נפח של תרבית שמרים לילה במדיום YP עם 2% גלוקוז המכיל את המספר הכולל של 5.0 x 107 תאים לתוך כל אחד משני צלוחיות Erlenmeyer עם מדיום YP המכיל 2% גלוקוז. השתמש פיפטה סטרילית להעברת התא.
  3. לגדל את תאי שמרים לפחות 24 שעות (או יותר, אם הניסוי דורש) ב 30 °C בשייקר סיבוב להגדיר ב 200 סל"ד.

5. הכנת ריאגנטים, הכנת כלי מעבדה והגדרת ציוד להרוות תאים

  1. הכן את הדברים הבאים: 1) פתרון מרווה (60% ברמה גבוהה (>99.9%) מתנול ב 155 מ"מ אמוניום ביקרבונט (ABC) חוצץ, pH = 8.0); 2) פתרון ABC קר כקרח (pH = 8.0); 3) מדחום דיגיטלי המסוגל למדוד עד -20 °C (70 °F); 4) 500 מ"ל בקבוקי צנטריפוגה גדולים; 5) צנטריפוגה מקוררת מראש במהירות גבוהה עם רוטור מקורר מראש ובקבוקי צנטריפוגות מקוררים מראש של 500 מ"ל עבור רוטור זה, כולם ב -5 מעלות צלזיוס; 6) צינורות מיצוי מטבוליט (15 מ"ל צינורות צנטריפוגות זכוכית במהירות גבוהה עם כובעים מרופדים בפוליטרפלואורואתילן); ו -7) קרח יבש.

6. מרווה תאים

  1. השתמש hemocytometer כדי לקבוע את מספר תאי שמרים לכל mL של YP עם 2% תרבית גלוקוז.
  2. העבר נפח של התרבות במדיום YP עם 2% גלוקוז המכיל את המספר הכולל של 5.0 x 108 תאים לתוך בקבוקי צנטריפוגות 500 מ"ל מקוררים מראש.
  3. מלא במהירות את בקבוק הצנטריפוגה המכיל את התאים עד לנפח של 200 מ"ל עם פתרון מרווה המאוחסן ב -20 °C (50 °F).
  4. צנטריפוגות הבקבוקים בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב 11,325 x גרם במשך 3 דקות ב -5 °C (5 °F).
  5. במהירות ובקינות לשחזר את הבקבוק מן הצנטריפוגה; פתחו בעדינות את המכסה והסירו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור.
  6. במהירות resuspend את גלולה התא ב 10 מ"ל של חוצץ ABC קר כקרח ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור צנטריפוגה זכוכית במהירות גבוהה 15 מ"ל עם כובע מצופה polytetrafluoroethylene להפקת מטבוליט.
  7. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה קלינית ב 3,000 x גרם במשך 3 דקות ב 0 °C (50 °F).
  8. במהירות להסיר את supernatant ומניחים את הצינור על קרח יבש כדי להתחיל חילוץ מטבוליט או לאחסן את הצינור ב -80 °C (70 °F) עד החילוץ.

7. הכנת ריאגנטים, כלי מעבדה וציוד להפקת מטבוליט

  1. הכן את הדברים הבאים: 1) כלורופורם כיתה LC-MS; 2) מתנול כיתה LC-MS; 3) מים ננו-טהורים בדרגת LC; 4) ציון LC-MS (ACN); 5) חרוזי זכוכית (שטף חומצה, 425-600 מיקרומטר); 6) מערבולת עם ערכת מחזיק צינור קצף עם שכר טרחה; 7) צינורות צנטריפוגות זכוכית במהירות גבוהה 15 מ"ל עם כובעים מצופים פוליטרפלואורואתילן; 8) בקבוקוני MS; 9) קרח יבש; ו 10) 1.5 mL צינורות שטף פעם אחת עם אתנול, פעם עם ACN ופעם אחת עם מים ננו טהורים.
    הערה: השתמש רק טיפים מיקרופיפט וצינורות עשוי פוליפרופילן כי הוא עמיד ממסים אורגניים.

8. מיצוי מטבוליט

  1. כדי מטבוליטים המשיך על קרח יבש או מאוחסן ב -80 °C צינור מ שלב 6.7, להוסיף את הדברים הבאים: 1) 2 מ"ל של כלורופורם מאוחסן ב -20 °C (7 °F); 2) 1 מ"ל של מתנול מאוחסן ב -20 °C (50 °F); 3) 1 מ"ל של מים ננו-טהורים קרים כקרח; ו-4) 200 μL של חרוזי זכוכית שטופי חומצה 425-600 מיקרומטר.
  2. לכסות ולסגור את הפה של צינור עם רדיד אלומיניום. מניחים צינורות בערכת מחזיק צינור קצף עם שכר טרחה ומערבולת אותם במשך 30 דקות במהירות בינונית (כלומר, במהירות שנקבעה על 6, עם 12 להיות המהירות המרבית של מערבולת) ב 4 °C כדי להקל על מיצוי מטבוליט.
  3. לדגור על הצינור במשך 15 דקות על קרח (לא קרח יבש!) כדי לקדם משקעים חלבון והפרדה של מימית העליונה מן השלב האורגני התחתון.
  4. צנטריפוגה הצינור בצנטריפוגה קלינית ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). שלב צנטריפוגה זה מאפשר הפרדת השלב המימי העליון (המכיל מטבוליטים מסיסים במים) מהשכבה האמצעית (המכילה פסולת תאים וחלבונים) ומהפאזה האורגנית התחתונה (המכילה בעיקר שומנים).
  5. השתמש micropipette כדי להעביר את השלב מימי העליון (400 μL) לשטוף ומסומן 1.5 מ"ל צינור המכיל 800 μL של ACN שאוחסן ב -20 °C (5 °F).
    הערה: יהיו משקעים בענן לבן לאחר הוספת השלב מימי העליון ACN נשמר ב -20 °C (50 °F).
  6. צנטריפוגות הצינור עם המדגם בצנטריפוגה שולחן ב 13,400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (50 °F).
    הערה: משקעי הענן הלבן ייעלמו לאחר צנטריפוגה.
  7. מעבירים 800 μL מהחלק העליון של נוזל בצינור למנתול MS שכותרתו. לאחסן את המדגם ב 0 °C (50 °F) עד שהוא מנותח על ידי LC-MS/MS.

9. הכנת ריאגנטים, כלי מעבדה וציוד ל-LC

  1. הכן את הדברים הבאים: 1) מערבולת; 2) סוניקטור קולי; 3) בקבוקוני זכוכית MS; 4) מערכת LC המצוידת במשאבה בינארית, בדגל ודגימה אוטומטית; 5) עמודת כרומטוגרפיה של שלב זויטרוני (פולימר 5 מיקרומטר, 150 x 2.1 מ"מ) הנקראת בטבלת החומרים; 6) תנור טורים; ו-7) שלבים ניידים, כולל שלב A (5:95 ACN:מים (v/v) עם אצטט אמוניום 20 מ"מ, pH = 8.0) ושלב B (100% ACN).

10. הפרדת מטבוליטים שחולצו על ידי LC

  1. נושא את התוכן של ביון MS sonication קולי במשך 15 דקות.
  2. מערבולת את מקטורן MS 3x למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. מניחים את מקטורן ה- MS לתוך צלחת הבאר.
  4. במהלך הכרומטוגרפיה, לשמור על העמודה ב 45 °C (5 °F) וקצב זרימה של 0.250 מ"ל / דקה. שמור את המדגם בצלחת הבאר ב 0 °C (50 °F). עיין בטבלה 1 עבור מעברי הצבע LC שיש להשתמש בהם במהלך הכרומטוגרפיה.
    הערה: כרומטוגרמה כוללת מייצגת של מטבוליטים מסיסים במים שחולצו מתאי זן מסוג בר BY4742 מוצגת באיור 1. המטבוליטים המופרדים על-ידי LC זוהו וכימתו על-ידי ניתוח ספקטרומטרי מסה שבוצע במצב יינון חיובי [ESI (+)], כמתואר לשלב 11.

11. ניתוח ספקטרומטרי מסה של מטבוליטים המופרדים על ידי LC

  1. השתמש בספקטרומטר מסה המצויד ביינון אלקטרוספרי מחומם (HESI) לזיהוי וכמות של מטבוליטים מסיסים במים שהופרדו על ידי LC. השתמש מנתח ספקטרומטר המסה עבור יונים MS1 וגלאי ספקטרומטר המסה ליוני MS2. השתמש בהגדרות שסופקו בטבלה 2 ובטבלה 3 עבור הרכישה תלוית הנתונים של יונים תלויי נתונים של MS1 ו- MS2, בהתאמה.
  2. השתמש באמצעי אחסון לדוגמה של 10 μL עבור ההזרקה הן במצב ESI (+) והן במצב ESI (-).

12. זיהוי וכמות של מטבוליטים שונים על ידי עיבוד נתונים גולמיים מ- LC-MS / MS

  1. השתמש בתוכנה בשם בטבלת החומרים כדי לבצע זיהוי וכמות של מטבוליטים שונים מסיסים במים מקבצי LC-MS/MS גולמיים. תוכנה זו משתמשת MS1 עבור כמות מטבוליט ו- MS2 לזיהוי מטבוליט. התוכנה מנצלת את ספריית הפיצול הספקטרלית ההמונית הנרחבת ביותר כדי לבאר את המטבוליטים באמצעות הנתונים הגולמיים של LC-MS/MS על-ידי התאמת ספקטרום MS. תוכנה זו משתמשת גם במסה המדויקת של MS1 ולהתאים דפוס איזוטופ כדי ביאור מטבוליטים באמצעות מסדי נתונים מקוונים. ראו איור 2 לקבלת פרטים.
  2. השתמש בספרייה של מסדי נתונים וספקטרום, אשר זמין באופן חופשי באינטרנט (https://www.mzcloud.org), כדי לחפש ספקטרום MS2 של הנתונים הגולמיים.

13. בדיקת תקינות הממברנה על ידי פרופיליום יודיד (PI) כתמים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית

  1. לאחר מרווה תא המבוצע כמתואר לשלב 6, לשטוף את התאים מרווים ביסודיות עם 15 מ"ל של מאגר ABC כדי להסיר את הפתרון מרווה. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות ב 0 °C (5 °F).
  2. resuspend הכדור התא ב 1 מ"ל של חוצץ ABC ולהוסיף 0.5 מ"ל של פתרון PI (0.5 מ"ג / מ"ל).
  3. מערבולת צינור עם המדגם 3x עבור 10 s ודגרה אותו במשך 10 דקות בחושך על קרח.
  4. צנטריפוגות הצינור עם המדגם בצנטריפוגה שולחן ב 13,400 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (50 °F).
  5. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 1 מ"ל של חוצץ ABC.
  6. צנטריפוגות הצינור ב 13,400 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F) ולהסיר את supernatant. חזור על שלב זה 2 פעמים נוספות כדי להסיר את ה- PI המאוגד למשטח התא.
  7. resuspend הכדור ב 300 μL של חוצץ ABC. מקם 10 μL של ההשעיה על פני השטח של שקופית מיקרוסקופ.
  8. לכוד את ניגודיות ההפרעה הדיפרנציאלית (DIC) ותמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש במסנן שהוגדר לאורכי גל עירור ופליטה של 593 ננומטר ו- 636 ננומטר (בהתאמה).
  9. השתמש בתוכנה כדי לספור את מספר התא הכולל (במצב DIC) ואת מספר התאים המוכתמים בפלואורסצנטיות. כמו כן, השתמש בתוכנה זו כדי לקבוע את עוצמת הכתמים עבור תאים בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לשפר את ההערכה הכמותית של מטבוליטים מסיסים במים בתוך תא שמרים, מיטבנו את התנאים של מרווה תאים לגילוי מטבוליטים. מרווה תאים למטרה זו כרוך במעצר מהיר של כל התגובות אנזימטיות בתוך תא31,33,37,38. מעצר כזה של פעילות מטבולית תאית הוא צעד חיוני של כל שיטה לכמות של מטבוליטים מסיסים במים ב vivo כי זה מונע את ההערכה התת-הערכתית של הריכוזים התאיים שלהם

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להשתמש בהצלחה בפרוטוקול המתואר כאן, בצע את אמצעי המניעה המתוארים להלן. כלורופורם ומתנול לחלץ חומרים שונים מכלי פלסטיק במעבדה. לכן, לטפל בהם בזהירות. הימנע משימוש בפלסטיק בשלבים הכרוכים במגע עם כל אחד משני הממיסים האורגניים האלה. השתמש פיפטות זכוכית borosilicate עבור שלבים אלה. העלו את הפיפטות האלה עם כלורופורם ומתנול לפני השימוש. השתמש רק טיפים מיקרופיפט וצינורות עשוי פוליפרופילן כי הוא עמיד ממסים אורגניים. במהלך הכנה מדגם עבור LC-MS / MS, לחסל את כל בועות האוויר בבקבוקונים זכוכית לפני החדרת אותם לתוך אטב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת טיטורנקו בהווה ובעבר על הדיונים. אנו מכירים את המרכז ליישומים ביולוגיים של ספקטרומטריית מסה, את המרכז לגנומיקה מבנית ותפקודית, ואת המרכז למיקרוסקופיה והדמיה תאית (כולם באוניברסיטת קונקורדיה) עבור שירותים מצטיינים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה (NSERC) של קנדה (RGPIN 2014-04482 ו- CRDPJ 515900 - 17). K.M. נתמך על ידי אוניברסיטת קונקורדיה ארמנד C. ארצ'מבולט מלגת אוניברסיטת קונקורדיה דיקן האמנויות והמדעים של מצוינות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כימיקלים
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA9554
אמוניום אצטטפישר סיינטיפיקA11450
אמוניום ביקרבונטסיגמא9830
בקטופפטוןפישר סיינטיפיקBP1420-2
כלורופורםפישר סיינטיפיקC297-4
גלוקוזפישר סיינטיפיקD16-10
ל-היסטידיןסיגמאH8125
ל-לאוציןסיגמאL8912
ל-ליזיןסיגמאL5501
מתנולפישר סיינטיפיקA4564
מתנולפישר סיינטיפיקA4564
Propidium iodideThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
תמצית שמריםFisher ScientificBP1422-2
<חזק>ציוד חומרה
500 מ"ל בקבוקי צנטריפוגהBeckman355664
Agilent 1100 seriesAgilent TechnologiesG1312A
בקמן קולטר צנטריפוגהבקמן6254249
בקמן קולטר צנטריפוגה רוטורבקמןJA-10
Centra CL2 צנטריפוגה קליניתThermo Scientific004260F
מדחום דיגיטליאומגהHH509
ערכת מחזיק צינור קצף עם מחזיקתרמו מדעי02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC עמודת פאזה zwitterionic (5µ m פולימר 150 x 2.1 מ"מ)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
סוניקטור אולטראסוניFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 מ"מ, 5 & מיקרו; mAgilent Technologies883725-901
<חזק>חומרי מעבדה
2-מ"ל בקבוקוני דגימת זכוכית עם מכסים מרופדים בטפלוןFisher Scientific60180A-SV9-1P
חרוזי זכוכית (שטופים בחומצה, 425-600 μ m)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
צינורות צנטריפוגה מזכוכית במהירות גבוהה 15 מ"ל עם כובעים מרופדים בטפלוןPYREX05-550
<חזק>תוכנה
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
<חזק>זן שמרים
זן שמרים חזק BY4742YSC1049דהרמקון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786(2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973(2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020(2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046(2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588(2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148(2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308(2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301(2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122(2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3(2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251(2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cell Quenching

מאמרים קשורים