פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור את כל השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד. שיטה זו מבוססת על הבדיקה הסטנדרטית של 96 באר צלחת מיקרו דילול וחישוב של ריכוזים מעכבי שבר (FICs) כדי להעריך את התוצאות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לוח בדיקה מרובע: שינוי לוח השחמט התלת מימדי לחקר שילובי סמים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הרעיון של טיפול בשילוב תרופות הופך להיות חשוב מאוד בעיקר עם עלייה דרסטית בהתנגדות לתרופות. לוח השחמט Quadruple, המכונה גם Q-checkerboard, שואפת למקסם את מספר השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד כדי למזער את הזמן והעבודה הדרושים כדי להשיג את אותן תוצאות עם פרוטוקולים אחרים. פרוטוקול זה מבוסס על טכניקת דילול מיקרו פשוט שבו התרופות מדוללות ומשולבים יחד בכמה צלחות 96-באר.
בסט הראשון של צלחות 96-באר, מרק מולר-הינטון מתווסף ואחריו התרופה הנדרשת הראשונה (למשל, Cefotaxime כאן) כדי לדלל אותו באופן סדרתי. לאחר הצעד הראשון נעשה, קבוצה נוספת של צלחות 96-באר משמש כדי לדלל את התרופה השנייה (למשל, Amikaci), אשר יועברו על ידי הסרת נפח מסוים של תרופה 2 ולשים את בארות המקבילה בסט הראשון של צלחות 96-באר המכיל תרופה אחת. השלב השלישי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה השלישית (למשל, Levofloxacin), ללוחות המתאימים בסט הראשוני המכיל שילוב של תרופה 1 ו -2. השלב הרביעי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה הרביעית (למשל, Trimethoprim-sulfamethoxazol) לתוך הצלחות המתאימות במערכה הראשונה. לאחר מכן, אי קולי ESBL אינוקולום חיידקי יהיה מוכן והוסיף.
שיטה זו חשובה כדי להעריך את כל השילובים האפשריים ויש לו מגוון רחב יותר של אפשרויות להיבדק יתר על כן עבור בדיקות vivo. למרות היותו טכניקה מעייפת הדורשת הרבה מיקוד, התוצאות הן מדהימות וחיסכון בזמן שבו הרבה שילובים ניתן לבחון בניסוי אחד.
מבוא
עם העלייה בהתנגדות עקב שימוש יתר ושימוש לרעה שלאנטיביוטיקה 1,2, הצורך לפתח תרופות חדשות וסוכנים לטיפול בזיהומים חיידקיים הפך חיוני. גישות חדשות כגון פיתוח תרופות חדשות חשובות מאוד כדי להתגבר על משבר ההתנגדות. עם זאת, תעשיית התרופות אינה מעוניינת לפתח סוכנים מיקרוביאלית חדשים. יתר על כן, אם תרופות חדשות מפותחות, חיידקים ימשיכו להתפתח ולפתח עמידות נגד תרופות חדשות אלה3,4. לכן, בעיית ההתנגדות לא תיפתר, מה שהופך את הצורך בגישה אחרת חובה שיש לשקול וללמוד כדי להתגבר על עמידות חיידקים.
שילוב תרופות הוא מושג חשוב מאוד לטיפול בזיהומי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. שלבי הכנה
- הכן מרק מולר-הינטון (MHB) על ידי הוספת 25 גרם מרק MH ל 1 L של מים מזוקקים ומערבבים. אוטוקלאב ב 121 °C (69 °F) עבור 2.5 שעות. לאחר מכן, לאחסן את המדיה autoclaved בטמפרטורת החדר או במקרר.
- תת-תרבות החיידקים המדוברים(E. coli ESBL) על מדיה אגר באמצעות שיטת פסים ארבעה רבעים דגירה לילה ב 37 °C (69 °F).
- באמצעות לולאה סטרילית, לקחת מושבה אחת ולהפיץ אותו במחצית הראשונה של צלחת אגר MacConkey על ידי ביצוע פסים מקבילים קרובים.
- באמצעות הלולאה, להפיץ את החיידקים ברביע השני על ידי פסים אותו מהרביע הראשון.
- מהרביע השני, הארך את הפסים ברבע השלישי באמצעות פסים מקבילים קרובים.
- להפיץ את החיידקים במרכז הרבע ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2A מייצג את התוצאות המתקבלות על ידי שילוב Cefotaxime ואמיקצין עם ריכוזים ספציפיים של Levofloxacin ו Trimethoprim-sulfamethoxazole. בחלק השמאלי של הדמות ניתן לראות את ארבע הצלחות המוצגות באופן סכמטי עם ריכוזי הסמים בחלק הימני של הדמות. החצים מייצגים את הבארות בממשק צמיחה/ללא צמיחה. בארות צבעוניות הן בארות המכילות צמיחה. אנו מבחינים כי הלוח הרביעי אינו מכיל צמיחה ברביע המכיל את השילוב. הסיבה לכך היא כי בצלחת זו יש לנו את MIC של Levofloxacin כי יעכב את הצמיחה. באיור זה, אנו יכולים לראות כי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת לוח השחמט המרובע דומה ללוח השחמט ולוח השחמט התלת-ממדי בפרוטוקול שלו. עם זאת, יש לקחת בחשבון צעדים חיוניים מסוימים כדי למנוע שגיאות במהלך הניסוי.
הקפד לבדוק את ה- MIC של כל תרופה נגד איזולט נבדק לפני תחילת הפרוטוקול כדי לדעת מה הם הריכוזים הדרושים כדי להתחיל את הדילול עם תרופה 1 ותרופה 2 כי צריך להיות מדולל באופן סדרתי בצלחות. לגבי תרופה 3 ותרופה 4, MIC צריך להיות ידוע גם כדי לחשב את הריכוזים הדרושים כדי להיבדק (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC, ו MIC). ישנן שיטות רבות כדי לקבוע את MIC, עדיין הטו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1000 ומיקרו; טיפים L | Citotest | 4330000402 | |
| 200 ומיקרו; טיפים | L Citotest | 4330-0013-17 | |
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה | 430828 | להכנת תרופות 3 ו-4 5 | |
| מ"ל פוליסטרן צינור פלקון תחתון עגול | 352058 | להכנת 0.5 MacFarland חיידקי חיסון 90 | |
| מ"מ צלחות פטרי | JRZ Plastilab | כמיטה לפתרונות שיש להוסיף באמצעות צלחות פיפטה רב-ערוציות | |
| 96 בארות | corning | 3596 | לדילול סדרתי ושילוב תרופות |
| Bactrim 200, 40 מ"ג (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | תרופה 4 |
| Ceforane, 1 גרם (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | תרופה 1 |
| Densitometer | |||
| E. Coli זן ESBL | שהוחזר כזן רפואי מסנט ג'ורג' בית חולים לבנון | זן חיידקי | |
| Mac Conkey + אגר סגול קריסטל | BIO-RAD | 64169508 | להכנת צלחות אגר המשמשות לתת-תרבות |
| מיאצין 500 מ"ג/2 מ"ל (אמיקאצין) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | תרופה 2 |
| מרק מולר-הינטון | BIO-RAD | 69444 | להכנת מדיה חיידקית |
| רב ערוצית פיפטה | תרמו מדעית | GJ54761 | לדילול סדרתי והוספת מדיה, חיידקים ותרופות |
| סרט נייר פיפטות | |||
| חד ערוציות | תרמו סיינטיפיק | OH19855 HH40868 | לתוספת מדיה, חיידקים ותרופות |
| Tavanic, 500 מ"ג (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | תרופה 3 |
מקורות
- Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
