שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים

סיכום

פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.

תקציר

מתילטרנספראז חלבונים (PRMTs) מזרזים את העברת קבוצת מתיל לשאריות ארגינין של חלבוני מצע. משפחת PRMT מורכבת מתשעה חברים שיכולים לעשות מונומטילט או שאריות ארגינין סימטריות/א-סימטריות. מספר נוגדנים המזהים סוגים שונים של מתילציה ארגינין של חלבונים שונים זמינים; לפיכך, מתן כלים לפיתוח מבחני סמנים ביולוגיים של פעילות PRMT. מבחנים מבוססי נוגדנים PRMT מאתגרים בשל מצעים חופפים וספציפי נוגדנים מבוססי מוטיב. נושאים אלה ואת ההתקנה הניסיונית לחקור את מתילציה ארגינין שנתרם על ידי PRMTs בודדים נדונים. באמצעות הבחירה הקפדנית של המצעים הייצוגיים שהם סמנים ביולוגיים לשמונה מתוך תשעה PRMTs, תוכנן פאנל של מבחני פעילות PRMT. כאן, הפרוטוקולים עבור מבחנים תאיים כמותי מדידת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים של משפחת PRMT בתאים מדווחים. היתרון של השיטות המתוארות הוא הביצועים הפשוטים שלהם בכל מעבדה עם תרבות תאים ויכולות כתם מערביות פלואורסצנטיות. הספציפיות של המצע ואמינות הנוגדנים שנבחרו אומתו במלואן עם גישות של הפלה ודיכוי יתר. בנוסף להנחיות מפורטות של סמנים ביולוגיים ונוגדנים לבדיקה, מסופק גם מידע על השימוש באוסף תרכובות של כלי מעכבים עבור PRMTs.

מבוא

מתילציה ארגינין הוא שינוי פוסט-תרגום חשוב המסדיר אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-RNA, ובכך ממלא תפקיד חשוב בתהליכים תאיים שונים כגון שחבור טרום-mRNA, נזק ל- DNA, תגובת שעתוק ותת-תזוזה בתיווך גורמי^{גדילה 1,2}. ארגינין הוא מתילציה על ידי חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) וכתוצאה מכך מונומתיל ארגינין (Rme1), דימתילרגינין אסימטרי (Rme2a), או דימתילרגינין סימטרי (Rme2s)³. בהתבסס על סוג המתילציה, PRMTs מסווגים לשלוש קבוצות: סוג I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ו- 8), אשר מזרז דימתילציה מונו ואסימטרית; סוג II (PRMT5 ו- PRMT9), אשר מזרז דימתילציה מונו וסימטרית; וסוג III (PRMT7), אשר יכול רק מונומתילאט ארגינין³.

בשל מספר גדל והולך של נוגדנים ספציפיים מתילציה ארגינין זמין מסחרית, פעילות PRMT ניתן למדוד באמצעות סופג המערבי. כתם מערבי מבוסס פלואורסצנטי הוא הטכניקה המועדפת על פני זיהוי chemiluminescent בשל טווח דינמי גדול יותר ליניאריות, רגישות גבוהה יותר, ומאפשר^{מולטיפלקסים 4}. כדי לכמת את רמות המתילציה של החלבון, נדרשת נורמליזציה של אות המתילציה לרמות החלבון הכוללות. על ידי בחירת הנוגדנים לחלבון כולל ומתילציה שגדל במינים מארחים שונים (למשל, עכבר וארנב), ניתן להשתמש בנוגדנים משניים המסומנים בפלואורופורים שונים ואת האות לשני הנוגדנים ניתן לקבוע באותה רצועת מדגם. נוגדנים מתיל ארגינין פותחו כדי לזהות ולאפיין monomethylated, א-סימטרי, או חלבונים דימתילציה סימטרית שבו מתיל ארגינין נמצא בהקשר מסוים. מאז רוב PRMTs מתילאט גליצין- ומוטיבים עשירים ארגינין בתוך המצעים שלהם⁵, מספר נוגדנים הועלו עבור פפטידים המכילים monomethyl או אסימטרי, סימטרי דימתיל ארגינין-גליצין חוזר כגון D5A12, ASYM24, או ASYM25, ו SYM11, בהתאמה. נוגדנים אחרים מתיל ארגינין נוצרו נגד ספריית פפטיד המכילה דימתיל אסימטרי, סימטרי ומונומתיל ארגינין בהקשר חוזר המאפשר זיהוי של מתיל ארגינין בהקשרים מסוימים אלה⁶. יש גם מספר גדל והולך של נוגדנים המזהים סימן ארגינין ספציפי על חלבון יחיד המאפשר זיהוי סלקטיבי של מתילציה כגון histone H4R3me2a או BAF155-R1064me2a.

ישנם מספר מעכבי PRMT זמינים מסחרית, אשר יכול לשמש ככלים עבור מבחנים סלולריים PRMT. עם זאת, לא כולם מאופיינים ביסודיות סלקטיביות ואפקטים מחוץ ליעד וחלקם יש להשתמש בזהירות. הקונסורציום הגנומי המבני, בשיתוף עם מעבדות אקדמיות ושותפי פארמה, פיתח מעכבי PRMT חזקים, סלקטיביים וחוטמים לתאים (בדיקות כימיות) הניתנים לשימוש ללא הגבלות על ידי הקהילה המדעית. מידע על מעכבים אלה ניתן למצוא על https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics https://www.chemicalprobes.org/. בדיקות כימיות הן מעכבי מולקולה קטנה עם במבחנה IC₅₀ או K_d < 100 nM, סלקטיביות פי 30 על חלבונים באותה משפחה, ופעילות תאית משמעותית ב 1 מיקרומטר. בנוסף, לכל בדיקה כימית יש אנלוגי כימי קרוב שאינו פעיל נגד היעד המיועד^{7,8,9,10,11,12}.

מטרת פרוטוקול זה היא למדוד את הפעילות הסלולרית של בני משפחת PRMT בודדים בשיטת הכתם המערבי הפלואורסצנטי. כאן מסופקים מידע מפורט על סמנים ביולוגיים מאומתים, נוגדנים ומעכבים חזקים הפעילים בתאים, כמו גם אסטרטגיות יקרות ערך ליישום מוצלח של מבחני אחריות.

פרוטוקול

1. פולחן וציפוי תאים

הערה: תאי תרבות עם מדיה מומלצת ולבדוק באופן שגרתי לזיהום mycoplasma. תאי HEK293T , MCF7 ו- C2C12 נבחרו כדוגמאות מאחר שקווי תא אלה שימשו בהצלחה בהמחאות PRMT.

1. תרבות HEK293T, MCF7, ו C2C12 ב DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS), פניצילין (100 U mL^-1),ו סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם mL^-1) ב 10 ס"מ רקמה תרבות מטופלים (TC) מנות.
2. עבור הבדיקה PRMT8, לגדול PRMT1 בלתי ניתן להריסה HEK293T תאים במדיה המכילה דוקסיציקלין (2 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 3 ימים לפני תחילת הבדיקה.
3. כדי צלחת התאים, להסיר ולהשליך מדיה מהצלחת.
4. הוסף 10 מ"ל של PBS (ללא Ca⁺² ו מ"ג⁺² יונים) כדי לשטוף תאים ולהשליך את הפתרון.
5. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%), דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן להשליך את הפתרון. דגירה עד שהתאים הופכים עגולים ומתנתקים מהצלחת. הקש על הצלחת כדי לסייע בניתוק תאים, במידת הצורך. לתאים שקשה לנסות, כגון C2C12, דגירה את הצלחת במשך 1-2 דקות ב 37 °C (69 °F).
   הערה: הימנע מחשיפה לתאים לפתרון טריפסין לפרקי זמן ארוכים יותר (>10 דקות) מכיוון שהוא יפחית את הכדאיות של התאים.
6. הוסף 1 מ"ל של מדיה מראש לצלחת, ותאי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי פירוק גושים התא. מעבירים תאים לצינור של 15 מ"ל ומוסיפים 3-5 מ"ל של מדיה.
7. כדי למדוד את מספר התא, לערבב 10 μL של תאים עם 10 μL של כחול Trypan ולהעביר 10 μL כדי hemocytometer או להשתמש בכל שיטת ספירת תאים אחרת.
8. לדלל תאים לצפיפות התא המומלצת ולשים 500 μL / גם לתוך צלחות TC 24-גם(טבלה 1). עבור מבחנים אנדוגניים (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ו- PRMT9), עבור לשלב 3.1.

2. העברת תאים

1. עבור מבחנים אקסוגניים (PRMT3, PRMT6, PRMT8) transfect HEK293T תאים עם הכמות המומלצת של DNA (טבלה 2). קל לבצע חילוף של תאי HEK293T כך שניתן יהיה להשתמש בכל מגיב של transfection, בהתאם להוראת היצרן.

3. טיפול מורכב

הערה: אין לחרוג מריכוז דימתיל סולפוקסיד (DMSO) סופי של 0.1% במדיית התרבות. שמרו על אותו ריכוז DMSO בכל באר. מעכבי PRMT סלקטיביים (בדיקות כימיות) ואנלוגיות לא פעילות הקשורות קשר הדוק שלהם ניתן למצוא בטבלה 3.

1. עבור מבחנים אנדוגניים (PRMT1, PRMT4, PRMT5, PRMT7 ו- PRMT9), הסר מדיה מתאים והחלף ב- 500 μL של מדיה ב- DMSO או ב- DMSO בלבד (בקרה).
   הערה: זה בדרך כלל לוקח 2 ימים כדי לבחון מעל 80% ירידה ברמות מתילציה R.
2. עבור מבחנים אקסוגניים (PRMT3, PRMT6, PRMT8), הסר מדיה 4 שעות לאחר transfection, להוסיף 500 μL של מדיה עם מורכב או DMSO לבד (שליטה), ואת הדגירה עבור 20-24 שעות.

4. הכנת lysate התא

1. הסר את כל המדיה מבארות, לשטוף עם 100 μL של PBS כדי להסיר מדיה שיורית, ולהוסיף 60 μL של מאגר תמוגה (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 10 mM MgCl₂, 0.5% טריטון X-100, 12.5 U mL-1 בנזונז, להשלים קוקטייל מעכבי פרוטאז ללא EDTA) לכל באר.
   1. דגירה במשך פחות מ 1 דקות ב RT, נדנדה את הצלחת כדי להפיץ את מאגר תמוגה על התאים. לאחר מכן להוסיף 3 μL של 20% w / v נתרן דודכיל סולפט (SDS), כדי סופי 1 % ריכוז, ומערבבים על ידי רועד בעדינות. מעבירים את lysate לצינורות מיקרוצנטריפוגה ושומרים אותו על הקרח.
      הערה: יש להוסיף קוקטייל מעכבי בנזונז וחלבון טרי לפני השימוש. התוספת של בנזונאס במהירות הידרוליזה חומצות גרעין אשר מפחית צמיגות ליזלת התא.
2. לקבוע את ריכוז החלבון של הדגימות באמצעות ערכת Assay חלבון BCA או להשתמש בכל שיטה אחרת אשר סובל 1% SDS בתמיסה.
   1. הוסף 2 μL של ליזלת ותקני חלבון (0, 1, 2, 4, ו 8 מיקרוגרם / מ"ל של BSA במאגר תמוגה) לתוך בארות של צלחת 96-היטב ברור.
   2. מערבבים ריאגנט A עם ריאגנט B ביחס של 50:1 ומוסיפים 200 μL לבאר. דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולקרוא את הספיגה.
3. להתאים את ריכוז החלבון עם מאגר תמוגה כדי להיות שווה על פני הדגימות.
4. הוסף 20 μL של מאגר טעינה 4x ל 60 μL של ליזלת תאים וחום ב 95 °C (65 °F) במשך 5 דקות. לאחר פירוק חום, lysates ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

5. ניתוח כתמים מערבי

1. טען 5-20 מיקרוגרם של ליסט התאים הכולל לניתוח חלבוני היסטון ו-20-100 מיקרוגרם לחלבונים אחרים לתוך ג'ל חלבון ביס-טריס 4-12%.
2. הפעל את הג'ל במאגר ריצה MOPS SDS (50 MM MOPS, בסיס טריס 50 מ"מ, 0.1% SDS w/v, 1 mM EDTA, pH 7.7) במשך כ 2 שעות ב 100 V או עד חזית הצבע מגיע לתחתית הג'ל.
3. אם אתם מבצעים העברה רטובה, הרכיבו את כריך ההעברה במאגר העברת טריס-גליצין קר כקרח (25 mM Tris, 192 מ"מ גליצין, 20% v/v מתנול ו-0.05% w/v SDS).
   1. מניחים ספוגים, נייר סינון, קרום PVDF וג'ל בהתאם להוראות היצרן. הפעל קרום PVDF על ידי השרייה במתנול וג'ל שיווי משקל במאגר העברה במשך 30 שניות לפני ההרכבה.
      הערה: השתמש בקרום סופג PVDF המערבי המומלץ שכן יש לו שפעת אוטומטית נמוכה והתאמה לחלבונים במשקל מולקולרי נמוך, כגון היסטונים (שולחן החומרים).
4. מעבירים חלבונים מהג'ל לקרום PVDF במאגר העברת טריס-גליצין ב-70 וולט למשך 1.5 שעות על הקרח.
5. חסום קרום למשך 30 דקות בחסימת חיץ (5% חלב עם אגירה פוספטית, PBS). יש לשטוף עם חיץ כביסה (PBST: 0.1% v/v Tween-20 ב-PBS), ולהדגיר עם נוגדנים ראשוניים בתמיסת אלבומין סרום שור (BSA) (5% BSA ב-PBST) לילה ב-4°C(טבלה 3).
   הערה: לאחסון ארוך יותר, יש לחטא את פתרון BSA במסנן, להוסיף 0.02% עם נתרן אזיד ולשמור על 4 °C (60 °F).
6. לשטוף קרום 3 x 5 דקות עם PBST. ואז דגירה עם עז נגד ארנב (IR800) וחמור נגד עכבר (IR680) נוגדנים במאגר חסימה מומלץ(שולחן החומרים, טבלה 3)במשך 30 דקות ב RT ולשטוף 3 x 5 דקות עם PBST.
7. קרא את האות על תמונה כתם מערבי פלואורסצנטי ב 800 ו 700 ננומטר. רצוי להשתמש בכלי המאפשר הדמיה רצועות חזקות ועמימות בבירור בתמונה אחת עם רגישות גבוהה וטווח דינמי, יחס אות לרעש גבוה, אזהרה כאשר מגיעים לרוויה בתמונה, כמו גם ריבוי של שני צבעים פלואורסצנטיים באותה רצועה לדוגמה.
8. קבע את עוצמות הרצועה עבור ניתוח כתמים מערביים באמצעות תוכנה מתאימה להדמיה מערבית פלואורסצנטית.

תוצאות

להלן דוגמאות לתוצאות כתם מערביות עבור מבחנים סלולריים של PRMTs בודדים. פרטי מבחנים מסוכמים גם בטבלה 4.

מבחני PRMT1
PRMT1 הוא התורם העיקרי היסטון 4 ארגינין 3 דימתילציה אסימטרית (H4R3me2a) בתאים¹³. עם אובדן פעילות PRMT1, רמות Rme1 ו- Rme2s גלובליות להגדיל באופן משמעותי¹³. כפי שמוצג באיור 1A ו-1B, ניתן להשתמש במספר נוגדנים כדי לעקוב אחר שינויים גלובליים ב- Rme1, Rme2a, Rme2s, כמו גם ב- H4R3me2a. ניתן לראות ירידה משמעותית ברמות Rme2a ו-H4R3me2a העולמיות ועליות ברמות Rme1 ו-Rme2s לאחר 3 ימים של הפלת PRMT1 (איור 1A, B). קווי תאים שונים באות הבסיסי H4R3me2a, ולכן, כדי להקל על ניטור אובדן פעילות PRMT1, ניתן להשתמש בקווי תאים כגון MCF7 עם רמות מתילציה בסיסיות גבוהות (איור 1C). הזמן האופטימלי להתבונן בהשפעה של עיכוב PRMT1, למשל על טיפול עם סוג I PRMT מעכב MS023⁸, הוא 2 ימים (איור 1D, 1E). טיפול ארוך יותר גורם לכדאיות וצמיחה מופחתת של התאים.

מבחני PRMT3
עבור הבדיקה התאית PRMT3, אין חלבונים סמן ביולוגי סלקטיבי אשר שינויי מתילציה יכול להיות מזוהה כתם המערבי על הפלת PRMT3 או overexpression. PRMT3 הוכח באופן א-סימטרי דימתילאט H4R3 במבחנה¹⁴, עם זאת, הסימן מופקד בעיקר על ידי PRMT1, ולכן בדיקה אקסוגנית עם PRMT3 מוגזם תוכנן. בהתאם לממצאי הפריה חוץ גופית, הפשטת יתר של PRMT3 מסוג פראי אך לא המוטנט הקטליטי שלו (E338Q) הובילה לעלייה ברמות H4R3me2a (איור 2A). נעשה שימוש בתאי HEK293T מכיוון שיש להם מתילציה בסיסית נמוכה של סימן זה (איור 1C). ההסמכה אומתה עוד יותר עם מעכב סלקטיבי PRMT3 SGC707⁷, אשר עיכב מתילציה אסימטרית PRMT3 תלויה PRMT3 (איור 2B).

מבחני PRMT4
PRMT4 דימתילטים א-סימטריים BAF155 בארגינין 1064¹⁵. מאז הנוגדן גילוי BAF165-R1064me2a זמין מסחרית, פעילות PRMT4 בתאים ניתן לפקח על ידי כתם מערבי על ידי גילוי השינויים ברמות סימן R1064me2a. אובדן חלבון PRMT4 או עיכוב של פעילות קטליטית עם מעכב סלקטיבי PRMT4, TP-064¹⁰, תוצאות ירידה ברמות BAF165-R1064me2a (איור 3). טיפול של יומיים הוא בדרך כלל מספיק כדי להסיר את רוב אות מתילציה.

מבחני PRMT5
PRMT5 אחראי על רוב החלבון ארגינין דימתילציה סימטרית. בעבר דווח כי החלבונים המורכבים השונים של SMN, כולל SmBB', הם מצעי PRMT5¹⁶. ניתן לעקוב אחר פעילות PRMT5 על ידי התבוננות בשינויים ברמות הגלובליות של דימתילציה סימטרית של ארגינין או דימתילציה סימטרית של חלבוני SmBB. הפלת PRMT5, אך לא PRMT1, 3, 4, 6 ו- 7 גורמת לירידה ברמות Rme2s העולמיות (איור 4A). ברוב קווי התאים, הטיפול בתאים עם מעכבי PRMT5 סלקטיביים LLY-283¹¹ ו- GSK591 במשך 2-3 ימים דיכא את רוב האות SmBB'Rme2s (איור 4B). רוב התאים רגישים לעיכוב PRMT5, וכתוצאה מכך לירידה בהתפשטות התאים ומוות התאים עם חשיפה ממושכת למעכבים.

מבחני PRMT6
דווח כי PRMT6 הוא התורם העיקרי היסטון H3 ארגינין 2 דימתילציה אסימטרית (H3R2me2a) בתאים¹⁷. בתאי HEK293T, הפלת PRMT6 במשך 3 ימים לא הספיקה כדי לצפות בירידה משמעותית ברמות H3R2me2a. עם זאת, דיכוי יתר של סוג פראי PRMT6 אך לא המוטנט הקטליטי שלו (V86K/D88A) מגביר את רמות H3R2me2a, כמו גם H3R8me2a ו- H4R3me2a (איור 5A). ישנם מספר מעכבים המעכבים פעילות PRMT6 עם עוצמה וסלקטיביות שונות: סלקטיבי, מעכב PRMT6 אלוסטרי SGC6870¹⁸, PRMT סוג אני מעכב MS023⁸, ו PRMT4/6 מעכב MS049⁹. כל אלה מעכבים PRMT6 תלוי H3R2 (איור 5B), כמו גם H4R3 ו H3R8 דימתילציה אסימטרית (נתונים לא מוצגים).

מבחני PRMT7
PRMT7 מונומטילates ארגינין 469 הן בצורות מכוננות והן בצורות בלתי ניתנות להשבכה של HSP70 (HSPA8 ו- HSPA1/6, בהתאמה)¹². אמנם אין נוגדנים זמינים מסחרית, אשר לזהות רמות HSP70-R469me1, הסימן ניתן לזהות עם נוגדני pan monomethyl. אובדן חלבון PRMT7 או עיכוב של פעילות קטליטית עם מעכב סלקטיבי PRMT7, SGC3027¹², תוצאות בירידה ברמות של HSP70-R469me1 (איור 6A, B). SGC3027 הוא prodrug חדיר לתאים, אשר בתאים מומר על ידי רדוקטאזים למעכב סלקטיבי PRMT7 SGC8158, ולכן העוצמה הסלולרית עשויה להיות שונה בין קווי התא. מספר קווי תאים סרטניים מבטאים צורות HSP70 בלתי ניתנות להכנעה ברמות גבוהות, וקשה לזהות מתילציה עקב רצועה לא ספציפית חופפת ממוצא גרעיני(איור 6C). לכן, עבור ה- PRMT7 cellular assay, קווי תאים המבטאים בעיקר HSPA8 כגון C2C12 מומלצים, או מאז HSP70 לוקליזציות בעיקר ציטופלסמה, לקבוע HSP70-R469me1 רמות בחלק הציטופלסמי של קווי תאים מועדפים.

מבחני PRMT8
PRMT8 הוא PRMT רק עם דפוס ביטוי מוגבל רקמה - לידי ביטוי בעיקר במוח¹⁹. הוא חולק דמיון רצף של 80% ויש לו העדפת מצע דומה לזו של PRMT1¹⁹. זה שונה PRMT1 בעיקר ב N-terminus, שם תוצאות myristoylation בשיתוף של PRMT8 עם קרום הפלזמה²⁰. דווח כי PRMT8 יחד עם PRMT1 מתילאטים RNA מחייב חלבון EWS²¹. מאז פעילות PRMT8 הוא נמוך בקווי תאים שאינם עצביים EWS יכול גם להיות מתילציה על ידי PRMT1, מבחני שבו PMRT8 הוא coexpressed יחד עם EWS בתאי הפלה PRMT1 פותחה. מכיוון ש-PRMT1 הוא גן חיוני וההפסד ארוך הטווח שלו גורם למוות של תאים, מערכת בלתי ניתנת להכנעה שבה PRMT1 נופל במשך 3 ימים לפני השימוש ב-PRMT8 assay נוצל (איור 7A). ביטוי משותף של PRMT8 מסוג פראי, אך לא מוטנט לא פעיל קטליזה (E185Q), יחד עם EWS הביא לרמות גבוהות יותר של דימתילציה אסימטרית EWS (איור 7B). מספר נוגדנים דימתילרגינין אסימטרי נבדקו ואת מתילציה זוהה רק עם נוגדן Asym25. הבדיקה אומתה עוד יותר עם בדיקה כימית סלקטיבית מסוג PRMT I, MS023⁸, אשר הפחיתה דימתילציה אסימטרית תלוית PRMT8 של EWS אקסוגני(איור 7B). למרות MS023 הוא חזק מאוד עיכוב PRMT8 במבחנות במבחנה, בתאים ריכוזים גבוהים של MS023 נדרשים לראות עיכוב מתילציה²¹.

מבחני PRMT9
PRMT9 הוצג לדימתילאט SAP145 באופן סימטרי בארגינין 508²². למרבה הצער, אין נוגדנים זמינים מסחרית יכולים לזהות את הסימן. לבדיקת PRMT9, נעשה שימוש בנוגדנים שהוענקו בחביבות על ידי ד"ר יאנדז'ונג יאנג (מכון המחקר בקמן של עיר התקווה). כאשר מוגזם, סוג פראי אך לא מוטנט R508K SAP145 הוא מתילציה על ידי PRMT9 (איור 8A). ההסמכה נועדה לפקח על רמות SAP145-R508me2s אנדוגני ואומתה עם תרכובת X, מעכב PRMT9 אב טיפוס (עבודה בתהליך, עדיין לא פורסם), אשר מעכב בעוצמה PRMT9 במבחנה עם עוצמה ננומולרית. תרכובת X הורידה את רמות SAP145-R508me2s באופן תלוי מינון (איור 8B).

איור 1. מבחני PRMT1 סלולריים. (A) נפילת PRMT1 גורמת לירידה של דימתילציה ארגינית אסימטרית גלובלית (Rme2a) ורמות גבוהות יותר של דימתילציה ארגינית סימטרית (Rme2s) ומונומתילציה (Rme1). יעילות ההפלה PRMT1 מוצגת בלוח B.(B)PRMT1 נוקאאוט מקטין דימתילציה אסימטרית של histone H4R3 (H4R3me2a). (C) רמות הבסיס H4R3me2a שונות על פני קווי תא שונים. (ד)סוג I PRMT מעכב MS023 מקטין את רמות H4R3me2a באופן תלוי מינון. תאי MCF7 טופלו ב-MS023 במשך יומיים. (E) הגרף מייצג את ההתאמה הלא ליניארית של עוצמות אותות H4R3me2a מנורמלות להיסטון H4 הכוללת. MS023 IC50 = 8.3 nM (n = 1). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2. מבחני PRMT3 סלולריים. (A)ההגזמה של סוג פראי (WT) אך לא מוטציה קטליטי E338Q של PRMT3 מגבירה את רמות H4R3me2a בתאי HEK293T. תאים היו transfected עם דגל מתויג PRMT3 עבור 24 h. (B) PRMT3 מעכב סלקטיבי, SGC707, מקטין ECTOPIC PRMT3 תלוי H4R3 demethylation אסימטרי אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. מבחני PRMT4 סלולריים. (A) PRMT4 תוצאות הפלה בירידה של BAF155-R1064 דימתילציה ארגינין אסימטרי (תאי HEK293T). מעכבסלקטיבי PRMT4, TP-064, מקטין את רמות BAF155-R1064Rme2a. תאי HEK293T טופלו עם תרכובת במשך 2 ימים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4. מבחנים סלולריים PRMT5. (A) נפילת PRMT5 גורמת לירידה ברמות דימתילציה ארגינין סימטריות גלובליות (תאי MCF7). (B)מעכבי PRMT5 סלקטיבי GSK591 ו LLY-283, להקטין SmBB' סימטרי ארגינין דימתילציה (ירוק), בעוד רמות הכולל של SmBB' להישאר ללא שינוי (אדום). תאי MCF7 טופלו בתרכובות במשך יומיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5. מבחני PRMT6 סלולריים. (A)ההגזמה של סוג פראי (WT) אך לא V86K/D88A מוטציה קטליטי PRMT6 מגביר H4R3me2a, H3R2me2a, ו H3R8me2a רמות בתאי HEK293T. תאים הודבקו עם PRMT6 מתויג בדגל עבור 24 h. ( (B) PRMT6 מעכב סלקטיבי (SGC6870), מעכב סוג PRMT I (MS023), ומעכב PRMT4/6 (MS049) להקטין את רמות H3R2me2a תלוי PRMT6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6. מבחני סלולר PRMT7. (A) PRMT7 תוצאות הסתרה בירידה של מונומתילציה HSP70-R469 (תאי HCT116). (B)מעכבי PRMT7 סלקטיביים, SGC3027, מקטין HSP70-R469 monomethylation בתאי C2C12. התאים טופלו עם תרכובת במשך 2 ימים. (C) זיהוי של HSP70-R469 מתילציה של HSP70 בלתי ניתן לתכלית (HSPA1/6) עם נוגדני arginine מונומתיל פאן (Rme1) יכול להיות קשה בשל רצועה לא ספציפית חופפת ממוצא גרעיני. מומלץ למדוד את רמות המתילציה HSP70 בשבר הציטופלסמי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7. מבחני סלולר PRMT8. (A)מתילציה PRMT8 של EWS ניתן לזהות כאשר פעילות PRMT1 מעוכבת על ידי הפלה. תאי HEK293T הועברו עם וקטור הפלה PRMT1 בלתי ניתן להעברה. לאחר 3 ימים של טיפול דוקסיציקלין, רמות PRMT1 הופחתו באופן דרסטי. (B) כאשר PRMT1 הוא הפיל, EWS אקסוגני הוא דימתילציה א-סימטרית על ידי סוג פראי מוגזם PRMT8 אבל לא מוטנט קטליטי (E185Q) של PRMT8. מתילציה הוא ירד על ידי ריכוז גבוה של מעכב סוג PRMT אני (MS023). HEK293T PRMT1תאי KD היו במשותף עם סוג פראי PRMT8 מתויג בדגל או מוטציה קטליטית ו- GFP מתויג EWS וטופלו MS023 עבור 20 שעות.

איור 8. מבחני PRMT9 סלולריים. (A) סוג פראי אך לא מוטציית R508K SAP145 הוא מתילציה על ידי PRMT9. תאי HEK293T הודבקו בתגית GFP SAP145 למשך יום אחד. (B)אב הטיפוס מעכב PRMT9 (תרכובת X) מקטין PRMT9 תלוי R508 דימתילציה סימטרית של SAP145 באופן תלוי מינון. תאי HEK293T טופלו עם המתחם במשך 2 ימים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

PRMT	תאים	צפיפות לכל מ"ל
PRMT1	MCF7	1 x 105
PRMT3	HEK293T	2 x 105
PRMT4	HEK293T	1 x 105
PRMT5	MCF7	1 x 105
PRMT6	HEK293T	2 x 105
PRMT7	C2C12	1 x 105
PRMT8	HEK293T (PRMT1 KD)*	2 x 105
PRMT9	HEK293T	2 x 105
* לטפל בתאים עם דוקסיציקלין (2 מיקרוגרם / מ"ל) 3 ימים לפני הציפוי עבור PRMT8 בדיקה

שולחן 1. סוגי תאים וצפיפויות המומלצים עבור מבחני PRMT.

PRMT	מיקרוגרם DNA/24-באר	אדג'ין (תוסף) #	הערות נוספות
PRMT3	0.5 דגל-PRMT3	164695
	או 0.5 דגל-PRMT3 (E338Q)	164696
PRMT6	0.5 דגל-PRMT6	164697
	או 0.5 דגל-PRMT6(V86K/D88A)	164698
PRMT8	0.05 EWS-GFP	164701
	0.45 PRMT8-דגל	164699
	או 0.45 PRMT8 (E185Q)-דגל	164700
PRMT9	0.05 SAP145-GFP	נה	מתנה מד"ר יאנדז'ונג יאנג, מכון המחקר בקמן של עיר התקווה
	או 0.05 SAP145-R508K-GFP
	0.45 וקטור ריק

שולחן 2. ריכוז הדנ"א המומלץ לניסוי טרנס-פליטה.

PRMT	נוגדן	בדיקה כימית (פעילות התא IC50)	שליטה שלילית
PRMT1	H4R3me2a (1:2000)	MS023 - סוג PRMT I	MS094
	Rme1 (1:1000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, בהתאמה)
	Rme2s (1:2000)
	Rme2a (1:2000)
	Rme2a (ASYM24, 1:3000)
	Rme2a (ASYM25, 1:2000)
	H4 (1:2000)
	B-אקטין (1:500 )
PRMT3	H4 (1:2000)	SGC707 (IC50 = 91 nM)	XY-1
	H4R3me2a (1:2000)
	דגל (1:5000)
PRMT4	BAF155 (1:200)	TP-064 (IC50 = 43 nM)	TP064N
	BAF155-R1064me2a (1:3000)	סקי-73 (IC50 = 540 ננומטר)*	סקי-73N*
PRMT5	אנטי SmBB' (1:100)	LLY-283 (IC50 = 30 ננומטר)	LLY-284
	Rme2s (#13222, 1:2000)	GSK591 (IC50 = 56 nM)	SGC2096
PRMT6	H4R3me2a (1:2000)	SGC6870 (IC50 = 0.9 מיקרומטר)	SGC6870N
	H4 (1:2000)	MS023 - סוג PRMT I	MS094
	H3R2me2a ( 1:2000)	(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM, בהתאמה)
	H3R8me2a (1:2000)	MS049 (PRMT 4, 6 IC50 = 970, 1400 ננומטר, בהתאמה)	MS049N
	H3 ( 1:5000)
	דגל ( 1:5000)
PRMT7	Rme1 (1:1000)	SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *	SGC3027N*
	Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8	GFP (1:3000)	MS023 (50 מיקרומטר)	MS094
	Rme2a (ASYM25,1:2000)
	דגל (1:5000)
PRMT9	SAP145 (1:1000)
	SAP145-R508me2s - מתנה מסוג ד"ר ינדז'ונג יאנג, מכון המחקר בקמן של עיר התקווה (1:1000) (PIMID: 25737013)
נוגדנים משניים	עז נגד ארנב IgG-IR800 (1:5000)
	חמור נגד עכבר IgG-IR680 (1:5000)
*- נוגדן מזהה HSPA8, HSPA1 ו- HSPA6 (נבדק עם חלבונים מתויגים GFP overexpressed), * prodrug – IC50 עשוי להיות שונה בין קווי תאים שונים

שולחן 3. נוגדנים מומלצים ותרכובות בדיקה כימית PRMT / כלי בקרה שליליים.

PRMT

סמן ביולוגי

קריאת אסאיי

אימות בדיקה

קו תא מומלץ

שופט, שופט.

PRMT1

H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2a

רמות H4R3me2a מנורמלות לסך כל רמות Rme1, Rme2a או Rme2s הגלובליות של H4 מנורמלות ל- B-actin.

הפלה של PRMT1 ירד H4R3me2a הבסיס ורמות Rme2a גלובליות ורמות Rme1 ו Rme2s גלובליות מוגברות בתאים (איור.1A, B). PRMT סוג I בדיקה כימית MS023 ירד רמות H4R3me2a באופן תלוי מינון (איור 1D).

התאים שונים ברמות H4R3me2a הבסיסיות (איור 1C). לתאי MCF7 יש רמות גבוהות של H4R3me2a בסיסיות מה שהופך אותו לעדיף עבור מבחני ניטור הירידה בפעילות PRMT1.

8

PRMT3

H4R3me2a

H4R3me2a רמות מתילציה הנגרמת על ידי דגל אקסוגני מתויג PRMT3 WT או מוטציה קטליטי E338Q (רקע) מנורמל H4 histone הכולל

דיכוי יתר של PRMT3 מסוג פראי אך לא המוטנט הקטליטי שלו (E338Q) הגדיל את H4R3me2a (איור 2A). PRMT3 מעכב סלקטיבי SGC707 ירד PRMT3 תלוי עלייה ברמות H4R3me2a (איור. 2B)

לתאי HEK293T יש רמות H4R3me2a בסיסיות נמוכות (איור 1C), מה עדיף לניטור פעילות PRMT3 אקסוגנית

7

PRMT4

BAF155-R1064me2a

רמות BAF155-R1064me2a מנורמלות לסך הכל BAF155

הפלת PRMT4 ירדה דימתילציה אסימטרית של BAF155 (איור 3A). טיפול של יומיים עם בדיקה כימית סלקטיבית PRMT4 (TP-064) ירד דימתילציה אסימטרית של BAF155 (איור 3B).

כל קו תא

10

PRMT5

SmBB'-Rme2s

רמות SmBB'-Rme2s זוהו עם נוגדני Rme2s פאן (CST) מנורמל לסך SmBB'

הפלת PRMT5 הביאה לירידה ברמות הדימתילציה הסימטריות של SmBB (איור 4A). טיפול של יומיים עם בדיקות כימיות סלקטיביות PRMT5, GSK591 ו LLY285, ירד SmBB'-Rme2s רמות (איור. 4B).

כל קו תא

11

PRMT6

H4R3me2a H3R2me2a H3R8me2a

H4R3me2a, H3R2me2a או H3R8me2a רמות מתילציה מוגברות על ידי דגל אקסוגני מתויג PRMT6 WT אבל לא קטליטי V86K, מוטציה D88A (רקע) מנורמל כדי H4 היסטון הכולל או H3, בהתאמה

דיכוי יתר של סוג פראי PRMT6 אך לא מוטציה קטליטי שלה (V86K,D88A) גדל H3R2me2a, H3R8me2a ו H4R3me2a רמות (איור. 5A). מעכב PRMT6 אלוסטריק (SGC6870), מעכבי PRMT מסוג I MS023 , מעכב PRMT4/6 MS049 ירד PRMT6 תלוי עלייה ברמות H3R2me2a (איור. 5B).

לתאי HEK293T יש רמות נמוכות של H4R3me2a, H3R2me2a ו- H3R8me2a, אשר עדיף לניטור פעילות PRMT6 אקסוגני

8,9

PRMT7

HSP70-R469me1

רמות מתילציה HSP70-Rme1 מנורמלות לסך הכל HSP70

נוקאאוט או הפלה של PRMT7 הפחיתו את המונומטילציה של HSP70 (איור 6A). טיפול של יומיים עם בדיקה כימית סלקטיבית PRMT7 SGC3027 ירד PRMT7 תלוי HSP70 monomethylation באופן תלוי מינון (איור. 6B).

C2C12, HT180 מספר קווי תאים סרטניים מבטאים צורה בלתי ניתנת להמחה של HSP70 שאות מתילציה שלו חופף לחלבון לא ספציפי ממוצא גרעיני (איור 6C). במקרה זה, אנו ממליצים לנתח את רמות המתילציה HSP70 בשבר הציטופלסמי.

12

PRMT8

EWS-Rme2a

רמות מתילציה EWS מתויגות על ידי EXOGENOUS GFP הנגרמות על ידי מוטציה קטליטית PRMT8 WT או E185Q מתויגת בדגל אקסוגני (E185Q), מנורמלת לאות GFP כולל בתאי PRMT1 KO.

הפרזה יתר של סוג פראי PRMT8 אבל לא קטליטי E185Q מוטציה מתילציה חוץ רחמית EWS רק בתאי PRMT1 KD (איור. 7A). PRMT סוג I בדיקה כימית MS023 מעוכבת דימתילציה אסימטרית של EWS אקסוגני על ידי PRMT8 (איור. 8B).

HEK293T PRMT1 KD (בלתי ניתן להכנעה). נפילת PRMT1 גורמת למוות תאי ולכן אנו ממליצים להשתמש במערכת בלתי ניתנת להזנה.

8

PRMT9

SAP145-R508me2s

דימתילציה סימטרית תלויה ב-PRMT9 של SAP145 ב-R508 מנורמלת ל-SAP145

ההפסד PRMT9 אך לא PRMT5 מוביל לירידה בדימתילציה סימטרית של SAP145. SAP145 WT שתייגת GFP אך לא SAP145mut (R508K) היה מתילציה על ידי PRMT9 (איור 8A). טיפול של יומיים עם Copound X, אב הטיפוס מעכב PRMT9, ירד רמות SAP145-R508me2s באופן תלוי מינון תאנה 8B).

כל קו תא

21

שולחן 4. סיכום מבחני PRMT.

דיון

כאן מתוארים פרוטוקולי הבדיקה הסלולרית המפורטים לבני משפחת PRMT המשתמשים בשיטות סופגות מערביות פלואורסצנטיות. מצעים ייחודיים שעבורם ניתן לזהות בקלות את השינויים במתילציה של ארגינין על אובדן PRMT בודד או עיכוב קטליטי ולא ניתן לפצות אותם על ידי בני משפחה אחרים נבחרו. חלבונים מסוימים מתילציה על ידי PRMTs מרובים^21,23, מציע חפיפה ספציפית מצע שבו כמה PRMTs לתרום רק כמות קטנה של סימן הסלולר במצע חלבון נתון^24,25,26,27, למשל, הן PRMT8 ו PRMT1 לתרום מתילציה של EWS. לכן, כל בדיקה דרשה אימות יסודי של מצעים ונוגדנים עם ניסויי הפלה ו/או דיכוי יתר ואימות נוסף עם מעכבים סלקטיביים מאופיינים היטב. PRMT מצעים ספציפיים זוהו אשר שינויים סימן מתילציה ניתן לזהות בתוך 2-3 ימים לאחר PRMT הפסד / עיכוב, כדי למנוע השפעות הרכבה של הכדאיות התא מופחת התפשטות שעלולה להשפיע בעקיפין על רמות סימן מתיל ארגינין. למרות שניתן היה למצוא מצעים ייחודיים עבור PRMT1, 4, 5, 7 ו- 9; עבור PRMT3, 6, ו 8 הרווח של גישת פונקציה היה צריך להיות מועסק. מספר נוגדנים ספציפיים למתיל ארגינין נבדקו למטרות תאיות שונות, אך אף אחד מהם לא הצליח לזהות שינויים משמעותיים בתוך 3 ימים מהפלת PRMT3 ו- PRMT6; לכן, מבחני סמנים ביולוגיים פותחו באמצעות אנזימים מבוטאים חוץ רחמית יחד עם מוטנטים לא פעילים קטליטית, אשר שימשו כפקד על מתילציה מצע הבסיס. PRMT8 הוא הומולוג PRMT1 קרוב וחולק העדפות מצע דומות. כמו סמן ביולוגי סלקטיבי PRMT8 לא ניתן היה לזהות, הבדיקה בתאי ההפלה PRMT1 פותחה, שם PRMT8 הובע במשותף יחד עם EWS. PRMT1 הוא גם אנזים מרכזי האחראי על מתילציה אסימטרית H4R3, ולכן, להשתמש H4R3me2a כמו סמן ביולוגי עבור PRMT3 ו PRMT6 מבחנים הסלולר, תאים עם רמות נמוכות הבסיסית H4R3me2a נבחרו, כמו גם מוטציות לא פעילים קטליטי שימשו כבקרת רקע. למרות מבחנים אנדוגניים עדיפים, מבחנים אקסוגניים להוכיח לא יסולא בפז לבדיקת העוצמה התאית של מספר מעכבי PRMT סלקטיבי^7,8,9. עם הידע הגובר של ביולוגיה PRMT, אנו מצפים לשפר את מבחני על ידי מציאת חלבונים סמנים ביולוגיים ספציפיים יותר עבור PRMT3, PRMT6, ו PRMT8.

השימוש בנוגדנים מאומתים ובקרות מתאימות הם קריטיים לביצועי מבחני PRMT. כל הנוגדנים המומלצים כאן קיבלו תוקף יסודי על ידי ניסויי הפלה ודיכוי יתר, עם זאת, הבדלי אצווה לאצווה, במיוחד במקרה של נוגדנים פוליקלונליים, עדיין עשויים להשפיע על הביצועים שלהם. לכן, חיוני להשתמש בשיטות גנטיות ובדיקות כימיות יחד עם הבקרות השליליות הקשורות קשר הדוק שלהם כדי לאשר את אמינות הבדיקה. בנוסף, עבור מבחני PRMT הדורשים ביטוי יתר של חלבון, חיוני להשתמש במוטנטים לא פעילים קטליטית יחד עם חלבון מסוג בר כדי לקבוע את רמות המתילציה הבסיסית.

אוסף זה של מבחנים כמותיים ליצירת פרופיל הפעילות של PRMTs בתאים יכול להיות שימושי באופן נרחב עבור הקהילה המדעית שכן ניתן ליישם אותו במהירות ובקלות עם ציוד מינימלי ומומחיות טכנית מוגבלת, הכוללת רק טכניקות בסיסיות של culturing תאים ו fluorescent המערבי סופג. הנוגדנים המומלצים ובדיקות כימיות עבור PRMTs יכולים לשמש גם עבור בדיקות פרופיל חלבון מבוסס פעילות (ABPP) כדי לקבוע את ההתאמה של בדיקה ABPP נתון, לפקח על מעורבות היעד, ולהעריך את ההשפעות מחוץ ליעד באמצעות פורמט ABPP תחרותי. גישות פיתוח מבחני הדיון כאן יכולות גם להיות מעודנות עבור משפחות אנזימים אחרות כגון ליצין חלבון-מתילטרנספראזים ואצטילטרנספראזים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10 ס"מ צלחות TC	גריינר ביו-אחד	664160
צלחות TC 24 בארות	גריינר ביו-אחד	662160
4– 12% ג'ל חלבון Bis-Tris	ThermoFisher Scientiffic	NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF ממברנה	Millipore-Sigma	10600021
anti-Asym 24	Millipore-Sigma	07-414
anti-Asym 25	Millipore-Sigma	09-814
anti-B-actin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47778
anti-BAF155	סנטה קרוז ביוטכנולוגיות	sc-32763
anti-BAF155-R1064me2a	Millipore-Sigma	ABE1339
anti-FLAG (#, 1:5000)	Millipore-Sigma	F4799
anti-GFP	Clontech	632381
anti-H3	Abcam	ab10799
anti-H3R2me2a	Millipore-Sigma	04-848
anti-H3R8me2a	רוקלנד	600-401-I67
אנטי-H4	Abcam	ab174628
anti-H4R3me2a	מוטיב פעיל	39705
anti-Hsp/Hsc70	Enzo	ADI-SPA-820
anti-PRMT1	Millipore-Sigma	07-404
anti-PRMT3	Abcam	ab191562
אנטי-PRMT4	Bethyl	#A300-421A
אנטי-PRMT5	Abcam	ab109451
אנטי-PRMT6	Abcam	ab47244
anti-PRMT7	Abcam	ab179822
anti-Rme1	CST	8015
anti-Rme2a	CST	13522
anti-Rme2s	CST	13222
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000)		09-814
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000)	Abcam	ab56800
anti-SAP145-R508me2s			מתנה נדיבה מד"ר יאנז'ונג יאנג, מכון המחקר בקמן של עיר התקווה
נגד SMBB'	סנטה קרוז ביוטכנולוגיות	SC-130670
בנזונאז			מיוצר בבית
BSA	Millipore-Sigma	A7906
C2C12			מתנה מד"ר סטפן ריצ'רד, אוניברסיטת מקגיל
cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA	Millipore-Sigma	11873580001
DMEM	Wisent	319-005-CL
DMSO	ביושופ	DMS666.100
חמור נגד עכבר IgG-IR680	Licor	926-68072
דוקסיציקלין	Millipore-Sigma	D9891
EDTA	Bioshop	EDT111.500
FBS	Wisent	80150
גליצין	ביושופ	GLN002.5
עז-אנטי-ארנב IgG-IR800	Licor	926-32211
מתנת HEK293T			מד"ר סם בנצ'ימול,
תוכנת סטודיו התמונות של אוניברסיטת יורק גרסה 5.2	מאגר טעינת Licor
: מאגר מדגם NuPAGE LDS (4x)	ThermoFisher Scientiffic	NP0007
MCF7		ATCC® HTB-22 וסחר;
NaCl	Bioshop	SOD001.1
NuPAGE MOPS SDS מאגר ריצה	ThermoFisher Scientiffic	NP0001
מאגר חסימת אודיסיאה (לדלל 4 x עם PBST)	Licor	927-40000	(PBS) # 927-70001
Odyssey CLX Imaging System	מספר	דגם 9140
PBS (תרבית רקמות)	Wisent	311-010-CL
PBS (כתם מערבי)	Bioshop	PBS405.4
penstrep	Wisent	450-201-EL
Pierce™ ערכת בדיקת חלבון BCA	ThermoFisher Scientiffic	23225
SDS	Bioshop	SDS001.1
אבקת חלב רזה	Bioshop	SKI400.500
TC20 מונה תאים אוטומטי	Biorad	1450102
Tripsin-EDTA (0.25%)	Wisent	325-043-EL
Tris	Bioshop	TRS003.5
טריטון X-100	ביושופ	TRX506
טריפן כחול	GIBCO	15250-061
Tween-20	ביושופ	TWN510.500