מאמר שיטה

יצירת פרופיל של שינוי H3K4me3 בצמחים באמצעות מחשוף תחת מטרות ותגיות

DOI:

10.3791/62534

⸱

22 באפריל 2022

 ,  ,  , 
1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2Central Laboratory, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cotton Hybrid R & D Engineering Center (the Ministry of Education), College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, 4Hainan Institute of Zhejiang University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחשוף תחת מטרות ותגיות (CUT&Tag) היא אסטרטגיית פרופיל אפיגנומית כרומטין יעילה. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיית CUT&Tag מעודנת ליצירת פרופיל של שינויים בהיסטון בצמחים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רגולציה אפיגנומית ברמה הכרומטית, כולל שינויי DNA והיסטון, התנהגויות של גורמי שעתוק, ו- RNAs שאינם מקודדים עם החלבונים המגויסים שלהם, מובילים לשליטה זמנית ומרחבית בביטוי הגנים. מחשוף תחת מטרות ותגית (CUT&Tag) היא שיטה לקשירת אנזימים שבה חלבון הכרומטין הספציפי מזוהה תחילה על ידי הנוגדן הספציפי שלו, ולאחר מכן הנוגדנים קושרים חלבון A-transposase (pA-Tn5) חלבון היתוך חלבון, אשר מבקע את הכרומטין הממוקד במקום על ידי הפעלת יוני מגנזיום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול CUT&Tag שפורסם בעבר שלנו באמצעות גרעינים שלמים מבודדים מעלי כותנה allortetraploid עם שינוי. פרוטוקול שלב אחר שלב זה יכול לשמש למחקר אפיגנומי בצמחים. בנוסף, שינויים משמעותיים בבידוד גרעיני הצמח מסופקים עם הערות קריטיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גורם שעתוק מחייב אתרי DNA וכרום פתוח הקשורים לסימני שינוי היסטון משרתים תפקידים פונקציונליים קריטיים בוויסות ביטוי הגנים והם המוקדים העיקריים של מחקר אפיגנטי1. באופן קונבנציונלי, בדיקת אימונופרציפציה כרומטין (ChIP) יחד עם ריצוף עמוק (ChIP-seq) שימשו לזיהוי רחב הגנום של שינוי היסטון כרומטין ספציפי או מטרות DNA עם חלבונים ספציפיים, והוא מאומץ באופן נרחב בתחום האפיגנטיקה2. מחשוף תחת מטרות וטכנולוגיית תיוג (CUT&Tag) פותחה במקור על ידי מעבדת Henikoff כדי ללכוד את שברי ה- DNA הקשורים לחלבון ברחבי הגנום5. בהשוואה ל- ChIP, CUT&Tagcan מייצרים ספריות DNA ברזולוציה גבוהה וברקע נמוך במיוחד באמצעות מספר קטן של תאים עם הליך פשוט3. עד כה, שיטות לניתוח של אזורי כרומטין עם שינויים histone ספציפיים באמצעות CUT&Tag הוקמו בתאי בעלי חיים4,5. באופן ספציפי, CUT&Tag חד-תאי (scCUT&Tag) פותח בהצלחה גם עבור רקמות ותאים אנושיים6. עם זאת, בשל המורכבות של דופן התא ומטבוליטים משניים, CUT&Tag עדיין מאתגר מבחינה טכנית עבור רקמות צמחים.

בעבר, דיווחנו על פרוטוקול CUT&Tag באמצעות גרעינים שלמים מבודדים מעלי כותנה allotetraploid4. כדי להדגים את היעילות של בידוד גרעינים ולכידת DNA באמצעות רקמת צמח, הליך הפרופיל מוצג כאן. הצעדים העיקריים כוללים בידוד גרעינים שלם, בדגרה במקום עם הנוגדן לשינוי כרומטין, דגירה של טרנספוזאז, שילוב מתאם והכנת ספריית DNA. פתרון הבעיות מתמקד בהכנת ספריית CUT&Tag לבידוד גרעיני הצמח ובקרת האיכות.

במחקר זה, אנו מציגים אסטרטגיית CUT&Tag מעודנת לצמחים. לא רק שאנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב עבור פרופיל H3K4me3 בעלי כותנה, אלא שאנו מספקים גם מתודולוגיה ממוטבת לבידוד גרעינים צמחיים, כולל האסטרטגיה לבחירת ריכוז חומר הניקוי לליזה נכונה של התאים והאסטרטגיה לסנן את הגרעינים. שלבים מפורטים עם הערות קריטיות כלולים גם בפרוטוקול מעודכן זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. להכין פתרונות חילוף ומלאי (יום 1)

הערה: בחלק זה, מתאמי oligonucleotide מורכבים עם טרנספוזאז Tn5 כדי לבצע חילוף פעיל.

  1. לדלל פריימרים (פריימר A, פריימר B, פריימר C, פריימר C) ל 100 μM ריכוז באמצעות מאגר חישול (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 מ"מ EDTA) (עיין בטבלה 1 לקבלת מידע רצף של פריימרים וטבלה 2 למתכונים לפתרונות עבודה). יש לאחסן בטמפרטורה של עד 20°C עד לשימוש.
  2. הגדר את שתי התגובות הבאות בצינורות PCR: תגובה 1 (מתאם AB), 10 μL של 100 μM פריימר A, 10 μL של 100 μM פריימר B; תגובה 2 (מתאם AC), 10 μL של 100 μM פריימר A, 10 של μL 100 μM פריימר C.
  3. חישת המתאמים במכונת PCR באמצעות התוכנית הבאה: מכסה חום (102 °C (102 °C ),75 °C (75 °F) במשך 15 דקות, 60 °C (60 °F) במשך 10 דקות, 50 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
    הערה: המתאמים הם חלקית מולקולות DNA כפולות גדילים (ריכוז = 50 pmol / μL).
  4. הגדר את התגובה הבאה בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל: 10 μL של pA-Tn5 transposase (500 ng/ μL או 7.5 pmol / μL), 0.75 μL של מתאם AB (50 pmol / μL), 0.75 μL של מתאם AC (50 pmol / μL), 7 μL של חיץ צימוד. פיפטה 20x בעדינות לערבב היטב ולדגור ב 30 °C (50 °F) באמבט מים במשך 1 שעות. הריכוז הסופי של transposase = 4 pmol / μL. לאחסן ב -20 °C (60 °F) עד השימוש.
    הערה: יחס טוחנת של מתאם AB: מתאם AC: transposase = 0.5:0.5:5:1.
  5. הכינו את פתרונות המלאי בהתאם למתכונים המסופקים בטבלה 2 ו- autoclave או לסנן את פתרונות המלאי לעיקור.
  6. Autoclave ולחטא מספריים, נייר סינון, מסננת נירוסטה, מרגמה, עלים, וכו '.

2. בידוד גרעינים (יום 2)

  1. מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. עבור כל 1 גרם של החומר ההתחלתי (עלי כותנה), להכין 25 מ"ל של מאגר בידוד גרעיני A (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 מ"מ EDTA), 20 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני B (10 mM טריס pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 מ"ל של חיץ כביסה גרעינית (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5 מ"מ זרע, קוקטייל מעכבי פרוטאז 0.1%), 1 מ"ל של חיץ נוגדנים (50 מ"מ טריס pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ זרע, 1 מ"ג / מ"ל BSA, קוקטייל מעכב פרוטאז 0.1%, 0.05% w / v digitonin). תן לצינורות לשבת על קרח עד השימוש.
  2. טוחנים עלים טריים (~ 1 גרם) בחנקן נוזלי לאבקה עדינה ומעבירים לצינור 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני צונן A.
  3. מערבבים את תמיסת החיץ בעדינות ודוללים את הצינור על הקרח במשך 5 דקות עם רעד עדין כדי לפזר את החומר באופן שווה.
  4. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 rcf ב 4 °C (4 °F) כדי ליצור את גלולה התא.
  5. Decant supernatant ו resuspened את הכדור עם 20 מ"ל של חיץ בידוד גרעיני צונן B בתוספת 0.5% טריטון X-100. הפוך את הצינור בעדינות כדי resuspend את הכדור לחלוטין.
    הערה: מאגר הבידוד הגרעיני B של 20 מ"ל ישים עבור חומר התחלתי של 1 גרם, וניתן לשנות את קנה המידה של אמצעי אחסון זה בהתאם.
    1. בצע בדיקת פיילוט כדי לבדוק את ההשפעה של ריכוז הסדרה של טריטון X-100 (למשל, 2 מ"ל חיץ בידוד גרעיני B, כל אחד עם 0.1%, 0.25%, 0.25%, 0.5%, ו 1% טריטון X-100 עבור 100 מ"ג של רקמות טחונות). הריכוז המתאים של טריטון X-100 מסומן על ידי הצטברות של גרעינים לבנים / אפורים בתחתית ו supernatant ירוק כהה לאחר תמוגה וצנטריפוגה במהירות נמוכה (< 500 rcf במשך 4 דקות).
  6. סנן את lysate התא המתקבל עם שילוב של שתי מסננות: מסננת 500-רשת בחלק העליון כדי להסיר את פסולת הרקמה הגדולה יותר מסננת 1000-mesh בתחתית כדי לאסוף את הגרעינים.
    הערה: בחר גודל רשת מתאים עבור המסננים בהתאם לגודל הגרעינים של הצמחים.
  7. השתמש בנייר סינון סטרילי בצד האחורי של המסננת כדי לספוג פסולת תאים קטנים בליסט.
  8. מעבירים את הגרעינים הנותרים המכילים ליסאט בצד העליון של מסננת 1000-mesh לארבעה צינורות צנטריפוגה טריים של 1.5 מ"ל.
  9. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F) כדי לאסוף את הגרעינים.
  10. הסר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה לשטוף את הכדור עם חיץ לשטוף גרעיני.
  11. מוסיפים 800 μL של מאגר לשטוף גרעיני ולהפוך את הצינורות בעדינות כדי resuspend את הכדור. לסובב את הצינור שוב במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (50 °F).
  12. בצע בסך הכל 3 שטיפות.
  13. (אופציונלי) דמיינו את הגרעינים מתחת למיקרוסקופ להכתמת DAPI.
    1. העבר 100 μL של השעיית גרעינים במאגר לשטוף גרעיני משלב 2.11. לצינור חדש של 1.5 מ"ל. הוסף 900 μL של מאגר לשטוף גרעיני ו 2 μL של פתרון מלאי DAPI (1 מ"ג / מ"ל) כדי להפוך את ריכוז העבודה הסופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל עבור DAPI. לדגור על הצינור בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. לאחר הכתמה, צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F) כדי לאסוף את הגרעינים.
    3. הסר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר באמצעות קצה פיפטה. לשטוף 3 פעמים עם 800 μL של מאגר לשטוף גרעיני.
    4. הסר כמה שיותר של supernatant ככל האפשר ו resuspend את הגרעינים עם 100 μL של חיץ לשטוף גרעיני.
    5. דמיין את הגרעינים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות ערוץ DAPI.
  14. שלב את הגרעינים משני צינורות (~ 50 μL של גרעינים בנפח בכל צינור 1.5 מ"ל). צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר כמה שיותר מהמאגר הנותר באמצעות קצה פיפטה.

3. דגירת נוגדנים

  1. Resuspend כל 50 μL של גרעינים בצינור 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של חיץ נוגדנים.
  2. הגדר את התגובות הבאות בצינורות 1.5 מ"ל: שני העתקים ביולוגיים של קבוצות בקרה IgG עם 150 μL של גרעינים (~ 1 מיקרוגרם של כרומטין) ו 2 μL של IgG (1 מ"ג / מ"ל) בכל צינור, שני העתקים ביולוגיים של קבוצות בדיקה H3K4me3 עם 150 μL של גרעינים ו 2 μL של נוגדן אנטי H3K4me3 (1 מ"ג / מ"ל) בכל צינור.
  3. מערבבים את התמיסה בעדינות ומשאירים את הצינורות על שייקר אופקי להכלאה למשך הלילה ב-4 °C (60 °F) ו-12 סל"ד.
  4. מצננים מראש את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס. הכינו 50 מ"ל טריים של חיץ כביסה אימונו-הסתברותי (IP) (10 מ"מ טריס pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ זרע, קוקטייל מעכב פרוטאז 0.1%, 0.05% w /v digitonin) בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל. תן לצינור לשבת על קרח.
  5. צנטריפוגה הצינורות במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (50 °F). הסר את מאגר הנוגדנים מכל צינור.
  6. הוסיפו 800 μL של מאגר כביסה IP לכל צינור וערבבו בעדינות. השאירו את הצינורות על שייקר אופקי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ו 12 סל"ד.
  7. לאחר הכביסה, צנטריפוגות הצינורות במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה.
    הערה: כדי למנוע כל הפרעה של גלולה הגרעינים, להשאיר ~ 50-80 μL של המאגר עם הגרעינים.
  8. חזור על שלבים 3.6.6.-3.7. עוד פעמיים.
  9. לאחר השטיפה השלישית, צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר את המאגר הנותר ככל האפשר.

4. דגירה של טרנספוזאז

  1. הפוך טרי 1 מ"ל של מאגר דגירה transposase (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 מ"מ זרע, קוקטייל מעכב פרוטאז 0.1%, 0.05% w / v digitonin) על ידי ערבוב 1 מ"ל של מאגר לשטוף IP עם 30 μL של 5 M NaCl.
  2. כדי להכין את תערובת Tn5 transposase לדגירה, להוסיף 1 μL של transposase לכל 150 μL של מאגר הדגירה transposase.
    הערה: הכן את תערובת פתרון transposase תחילה בהתאם למספר התגובות, ולאחר מכן להוסיף aliquot של 150 μL לכל צינור.
  3. Resuspend הגרעין עם 150 μL של פתרון transposase.
  4. השאירו את הצינורות על שייקר אופקי ב 12 סל"ד במשך 2-3 שעות בטמפרטורת החדר ומערבבים כל 10-15 דקות.
  5. לאחר דגירה transposase, צנטריפוגה הצינורות במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (65 °F). הסר את מאגר הדגירה transposase בכל צינור.
  6. לשטוף את הצינורות עם מאגר לשטוף IP. כדי לעשות זאת, להוסיף 800 μL של חיץ לשטוף IP לכל צינור, לערבב בעדינות, ולהשאיר את הצינורות על שייקר אופקי ב 12 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה.
  8. חזור על שלבים 4.6.-4.7. עוד פעמיים.
  9. לאחר השטיפה השלישית, צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 300 rcf ב 4 °C (4 °F). הסר את המאגר הנותר ככל האפשר.

5. תיוג

  1. הפוך טרי 2 מ"ל של מאגר התיוג (10 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5 mM זרע, קוקטייל מעכב פרוטאז 0.1%, 10 מ"מ MgCl2, 0.05% w / v digitonin) על ידי ערבוב 2 מ"ל של חוצץ כביסה IP עם 60 μL של 5 M NaCl ו 20 μL של 1 M MgCl2.
  2. Resuspend הגרעין עם 300 μL של מאגר תיוג.
  3. מערבבים את התמיסה ודגרו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לתיוג.
  4. עצור את התיוג עם 10 μL של 0.5 M EDTA (ריכוז סופי ~ 15 מ"מ) ו 30 μL של 10% SDS (ריכוז סופי 1%).

6. הפקת דנ"א ובניית ספריית NGS

  1. הוסף 300 μL של מאגר חילוץ DNA CTAB כמתואר7. לדגור על הצינורות באמבט מים 65 °C (65 °F) במשך 30 דקות. הופכים לערבב כל ~ 10 דקות.
  2. הוסף 600 μL של פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25:24:1) לכל צינור. מערבבים היטב.
  3. מראש צנטריפוגה צינורות ג'ל נעילת פאזה במשך 2 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (66 °F). העבר את הפתרון לעיל לצינורות ג'ל נעילת פאזה.
  4. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (4 °F).
  5. העבר את supernatant (~ 600 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
  6. הוסף 600 μL של כלורופורם לכל צינור. מערבבים היטב.
  7. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (4 °F).
  8. העבר את supernatant (~ 600 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
  9. הוסף 12 μL של 100% אתנול ו 2 μL של GlycoBlue Coprecipitant. מערבבים היטב ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
  10. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (4 °F).
  11. דקאנט הסופר-ננטנט. לשטוף את גלולה DNA באמצעות 75% (v / v) אתנול וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 13,000 rcf ב 4 °C (4 °F).
  12. דקאנט הסופר-ננטנט. ייבשו את כדור הדנ"א ויצרו מחדש את הדנ"א ב-25 μL של ddH2O.
  13. הגדר את תגובת ה- PCR באופן הבא. עבור סך של 50 μL של תגובה, להוסיף 24 μL של DNA, 11 μL של ddH2O, 10 μL של 5x מאגר TAE, 2 μL של P5 פריימר (10 מיקרומטר), 2 μL של פריימר P7 (10 μM), ו 1 μL של TruePrep להגביר אנזים. תוכנית PCR: 72 °C (50 °F) במשך 3 דקות, 98 °C (50 °F) עבור 30 s; ואז 14 מחזורים של 98 °C (98 °F) עבור 30 s, 60 °C (60 °F) עבור 30 s, ואחריו 72 °C (5 °F) במשך 5 דקות.
    הערה: לא ניתן לדלג על 72 °C (72 °F) הראשונים למשך 3 דקות להרחבה. פשטנות יתר של הספרייה תוביל לרמה גבוהה של כפילויות PCR ב- NGS. התחל מ 12-14 מחזורי PCR בתגובת PCR עבור H3K4me3 בעת שימוש ~ 1 מיקרוגרם של כרומטין בכל תגובה.
  14. טען 2 μL של מוצרי PCR על 1.5% ג'ל agarose עבור אלקטרופורזה.
  15. לטהר את מוצרי PCR באמצעות חרוזים מגנטיים טיהור DNA מסחרי.
  16. לכמת את הספרייה עם פלואורומטר ואלקטרופורזה ג'ל אגרוז.
    הערה: ריכוז יעיל של הספרייה צריך להיות >2 nM על ידי qPCR כדי להבטיח איכות טובה.
  17. בצע רצף הדור הבא (NGS) וניתוח נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מתאר את זרימת העבודה של CUT&Tag. איור 2 מראה את הכתמת DAPI של הגרעינים השלמים. מטרת שלב "בידוד הגרעינים" הייתה להשיג את הגרעינים השלמים בכמות מספקת לתגובת CUT&Tag הבאה. איור 3 מציג את האלקטרופורזה של ג'ל האגרוז של מוצרי PCR. השליטה השלילית של IgG נדרשת במקביל בעת הגדרת הניסוי. בהשוואה לקבוצת הביקורת של IgG, עיקר שברי הדנ"א שנמשכו עם דגימת נוגדנים H3K4me3 נעו בין כ-280 ל-500 זוגות בסיסים. איור 4

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, תיארנו את CUT&Tag, טכנולוגיה ליצירת ספריות DNA ברזולוציה גבוהה ורקע נמוך במיוחד באמצעות מספר קטן של תאים עם הליך פשוט יותר בהשוואה לאימונופרציפציה כרומטין (ChIP). ההצלחה שלנו עם פרופיל H3K4me3 בעלי כותנה מצביעה על כך ש- CUT&Tag, שתוכננה לראשונה לתאי בעלי חיים, יכולה לשמש גם לתאי צמחים. הן מערכת החיץ Tris המשמשת בדרך כלל עבור ChIP assay8 והן מערכת חיץ HEPES המשמשת לעבודת CUT&Tag של בעלי חיים עבור CUT&Tag באמצעות גרעיני צמחים4,9. הבידוד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכל המחברים אין ניגודי עניינים עם כל חברה המסחר באחד המוצרים שהוזכרו לעיל.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה כלכלית בחלקה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), וקרנות מחקר בסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות, מעבדת הזרעים של מפרץ היינאן יאזו (JBGS, B21HJ0403), הקרן למדעי הטבע המחוזית של היינאן בסין (320LH002) ופרויקט JCIC-MCP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>נוגדן
אנטי-H3K4me3Millipore07-473
ארנב רגיל IgGMillipore12-370
<חזק>כימיקלים
סרום בקר חזק (BSA)הכינו 10 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי BSA. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
digitonin (~50% (TLC)Sigma-AldrichD141הכינו תמיסת מלאי של 5% דיגיטונין (200 מ"ג דיגיטונין [~50% טוהר] ל-2 מ"ל DMSO). הערה: יש לעקר באמצעות פילטר של 0.22 מיקרון. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)
כלורופורם
אתילנדיאמין-טטראצטי חומצה (EDTA)הכינו 0.5 M EDTA (pH = 8.5) תמיסת מלאי. הערה: הכנת 100 מ"ל של 0.5-M EDTA (pH = 8.5) דורשת כ-2 גרם של כדורי נתרן הידרוקסיד (NaOH) כדי להתאים את ה-pH
אתנול
GlycoBlue Coprecipitant (15 מ"ג/מ"ל)InvitrogenAM9516
מגנזיום כלוריד (MgCl2)הכינו 1 M MgCl2
קוקטייל מעכב פרוטאזCalbiochem539133-1SET
אשלגן כלורי (KCl)הכינו 1 M תמיסת מלאי KCl
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1, v: v: v)
נתרן כלורי (NaCl)הכינו 5 M תמיסת מלאי
NaCl ספרמידיןהכינו 2 M תמיסת מלאי ספרמידין, אחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
נתרן דודציל סולפט (SDS)הכינו תמיסת מלאי של 10% SDS. הערה: אין לבצע חיטוי; עיקור באמצעות מסנן 0.22 מיקרון
בסיסהכינו 1 M Tris (pH = 8.0) תמיסת מלאי
Triton X-100הכינו 20% Triton X-100 תמיסת מלאי
Enzyme
Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT& תגVazymeS602/S603בדוק את זיקת הנוגדנים של החלבון A או החלבון G שמתמזג עם Tn5. באופן כללי, לחלבונים A ו-G יש זיקה רחבה לנוגדנים. עם זאת, לחלבון A יש זיקה גבוהה יחסית לנוגדנים של ארנב ולחלבון G יש זיקה גבוהה יחסית לנוגדנים של עכברים. בחר את מוצרי הטרנספוזאז המתאימים התואמים את הנוגדן שלך.
TruePrep Amplify EnzymeVazymeTD601
<חזק>ציוד
צנטריפוגהEppendorf5424R
PCR מכונתApplied BiosystemsABI9700
שייקר אורביטליMIULABHS-25
NanoDrop One  ספקטרופוטומטרThermo ScientificND-אחד-W
Tris

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  3. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  4. Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120(2020).
  5. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  6. Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
  7. Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11(2007).
  9. Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).
  10. Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
  11. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

H3K4me3 ModificationCUT And TagChromatin ProfilingPlant EpigenomicsNuclei IsolationHistone ModificationTn5 TransposaseAntibody IncubationDNA FragmentationHigh Throughput Sequencing

מאמרים קשורים