הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62756

⸱

21 ביוני 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח המושרים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והשימוש בהם בדוגמנות מחלות מיטוכונדריאליות.

תקציר

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים, וכיום הן חשוכות מרפא. מחלות אלה גורמות למומים נוירו-פיתוחיים שהמנגנונים הבסיסיים שלהם נותרים להתגלות. מחסום מרכזי הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את הליקוי העצבי המוקדם שנראה בחולים. ההתקדמות בטכנולוגיה של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSCs) מאפשרת ייצור של אורגנוידים תלת ממדיים (3D) במוח שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעה של מחלות על הפיתוח והארגון של מערכת העצבים. חוקרים, כולל מחברים אלה, הציגו לאחרונה אורגנוידים במוח האנושי מודל הפרעות מיטוכונדריאליות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לדור החזק של אורגנוידים אנושיים שמקורם ב- IPSC והשימוש בהם בפרופילים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים וניתוחי הדמיה. ניסויים אלה יאפשרו שימוש באורגנוידים במוח כדי לחקור תפקודים מטבוליים והתפתחותיים ועשויים לספק מידע חיוני כדי לנתח את הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות.

מבוא

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים1. הם נגרמים על ידי מוטציות גנטיות המשבשות תהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כולל זרחן חמצוני (OXPHOS)2, הרכבת שרשרת הנשימה, דינמיקה מיטוכונדריאלית, ותעתיק DNA מיטוכונדריאלי או שכפול3. רקמות עם דרישות אנרגיה מושפעים במיוחד על ידי תפקוד מיטוכונדריאלי4. בהתאם, חולים עם מחלות מיטוכונדריאליות בדרך כלל לפתח ביטויים נוירולוגיים מוקדמים.

אין כיום טיפולים זמינים לילדים הנגועים במחלות מיטוכונדריאליות5. מכשול מרכזי להתפתחות תרופות של מחלות מיטוכונדריאליות הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את קורס המחלה האנושית6. כמה מהמודלים החייתיים הנחקרים כיום אינם מציגים את הפגמים הנוירולוגיים הקיימים בחולים7. לפיכך, המנגנונים שבביד הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות עדיין אינם מובנים במלואם.

מחקרים אחרונים יצרו IPSCs מחולים מושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות והשתמשו בתאים אלה כדי להשיג תאים עצביים ספציפיים לחולה. לדוגמה, פגמים גנטיים הקשורים למחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, נמצאו כגורמים לסטיות בביו-אנרגטיקה תאית8,9, סינתזת חלבונים10 וסידן הומאוסטזיס9,11. דיווחים אלה סיפקו רמזים מכניים חשובים על הליקוי העצבי המתרחש במחלות מיטוכונדריאליות, וסללו את הדרך לגילוי תרופות למחלות חשוכות מרפא אלה12.

תרבויות דו-ממדיות (דו-ממדיות), לעומת זאת, אינן מאפשרות לחקור את המורכבות האדריכלית והארגון האזורי של איברים תלת-ממדיים13. לשם כך, השימוש באורגנוידים מוחיים תלת-ממדיים הנגזרים מ- iPSCs14 ספציפי למטופל עשוי לאפשר לחוקרים להשיג מידע חשוב נוסף ובכך לעזור לנתח כיצד מחלות מיטוכונדריאליות משפיעות על התפתחותה ותפקודה של מערכת העצבים15. מחקרים המעסיקים אורגנוידים במוח שמקורם ב- IPSC כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות מתחילים לחשוף את המרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות.

אורגנוידים חוט השדרה נושא מוטציות הקשורות למחלה המיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית, ותסמונת פרקים דמויי שבץ (MELAS), הראו נוירוגנזה פגומה ובידול נוירון מוטורי מושהה16. אורגנוידים קליפת המוח נגזרים מחולים עם המחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, הראו גודל מופחת, פגמים ביצירת ניצני אפיתל עצביים, ואובדן ארכיטקטורה קליפת המוח17. אורגנוידים במוח מחולי תסמונת לי הראו כי פגמים המחלה ליזום ברמה של תאי אבות עצביים, אשר לא יכול להתחייב חילוף החומרים המיטוכונדריאלי, גרימת הסתעפות עצבית חריגה מורפוגנזה18. לכן, אבות עצביים עשויים לייצג יעד טיפולי תאי למחלות מיטוכונדריאליות, ואסטרטגיות לקידום תפקודם המיטוכונדריאלי עשויות לתמוך בהתפתחות התפקודית של מערכת העצבים.

השימוש באורגנוידים במוח עשוי לעזור לחשוף את הרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות. מחלות מיטוכונדריאליות נחשבות בעיקר ניוון עצבי מוקדם5. עם זאת, פגמים נוירו-התפתחותיים קיימים גם בחולים המושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות, כולל עיכוב התפתחותי ופגיעה קוגניטיבית19. אורגנוידים מוחיים ספציפיים לחולה עשויים לעזור לטפל בהיבטים אלה ולפרט כיצד מחלות מיטוכונדריאליות עשויות להשפיע על התפתחות המוח האנושי. תפקוד לקוי של מיטוכונדריה יכול גם לשחק תפקיד פתוגנטי במחלות נוירולוגיות נפוצות יותר, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון4. לפיכך, לפרט את ההשפעה של פגמים מיטוכונדריאליים נוירו-פיתוח באמצעות organoids המוח עשוי גם להיות אינסטרומנטלי לחקר מחלות אלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח לשחזור שניתן להשתמש בהם לביצוע מודל מחלות של מחלות מיטוכונדריאליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: השימוש ב- IPSCs אנושי עשוי לדרוש אישור אתי. iPSCs בשימוש במחקר זה נגזרו מאנשים בקרה בריאה לאחר אישור אתי מקומי (#2019-681). כל נהלי תרבית התא חייבים להתבצע תחת מכסה המנוע של תרבית תאים סטרילית, בזהירות חיטוי כל ריאגנטים ומתכלים לפני המעבר מתחת למכסה המנוע. IPSCs אנושי המשמש לבידול צריך להיות מספר מעבר מתחת 50 כדי למנוע סטיות גנומיות פוטנציאליות שעלולות להתרחש על תרבות נרחבת. המצב pluripotent של התאים צריך להיות מאומת לפני יצירת organoid, למשל, על ידי ניטור הביטוי של סמנים הקשורים pluripotency כגון NANOG או OCT4. בדיקות Mycoplasma צריכות להתבצע כל שבוע כדי להבטיח תרבויות ללא מיקופלסמה.

1. דור האורגנוידים במוח

  1. תרבות של IPSCs אנושיים
    1. תרבות IPSCs אנושי בתנאים ללא הזנה במדיום iPSC (ראה את טבלת החומרים) על לוחות מצופים 6-באר ולשמור אותם בחממה תרבית רקמות לחות ב 37 °C (5% CO2.
      הערה: נשיאת תאי מאכיל עלולה לעכב את ההבחנה האורגנוידת. מעבר התאים לפחות פעם אחת בתנאים ללא מאכילה.
    2. מעבר IPSCs ב 80% השפעה באמצעות מדיום ניתוק ללא אנזימים ביחסים הנעים בין 1:4 ל 1:12. כדי להגביר את הישרדות התאים, הוסיפו מעכב 10 מיקרומטרי קינאז חלבון הקשור לרו (ROCK) (Y27632) לאחר כל פיצול.
  2. נתק את ה- IPSCs (80% השפעה)-יום 0.
    1. הכן בידול קליפת המוח בינוני I (CDMI) (טבלה 1). מדיום CDMI לפני המלחמה בטמפרטורת החדר (22-25 °C (22 °F) לפני הוספתו לתאים.
    2. לשטוף את הבארות המכילות את iPSCs עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי להסיר תאים מתים ופסולת.
    3. הוסף 500 μL של ריאגנט A (טבלת חומרים) מחמם מראש לכל באר ודגר במשך 5 דקות ב 37 °C (7 °F). בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק תאים.
    4. הוסף 1 מ"ל של iPSC בינוני כדי לדלל reagent A כדי לנטרל את פעילותה.
    5. השתמש בצינור 1000 μL כדי לנתק את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
    6. צנטריפוגות בעדינות IPSCs ב 125 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (22-25 °C (25 °F).
    7. בזהירות לשאוף supernatant כדי למנוע הפרעה גלולה התא.
    8. תגדיל מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של CDMI כדי להשיג השעיה של תא בודד, ולספור את מספר התא.
    9. הכן את מדיום הזריעה עם 9,000 iPSCs לכל 100 μL ב- CDMI בתוספת מעכב 20 מיקרומטר ROCK, מעכב WNT-קטנין 3 מיקרומטר (IWR1) ו 5 μM SB431542.
    10. הוסף 100 μL של מדיום זריעה לבאר לצלחת V-תחתון 96-well.
    11. שמור את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לחות ב 37 °C (5% CO2.
  3. דור נוירוספירה
    1. ביום הראשון, שימו לב כי נוצרים אגרגטים של תאים עגולים (נוירוספירות) עם גבולות חלקים מוגדרים. שים לב לתאים המתים סביב האגרגטים. המשך לתרבות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
    2. ביום 3, להסעיר את הצלחת על ידי הקשה על הצדדים שלוש פעמים כדי לנתק תאים מתים.
    3. הוסף 100 μL של CDMI בתוספת 20 מעכב רוק μM, 3 μM IWR1, ו 5 μM SB431542 לכל באר.
    4. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    5. ביום 6, בזהירות להסיר 80 μL של מדיום על טבעי מכל באר. הימנעו מלגעת בתחתית הבאר.
    6. הוסף 100 μL של CDMI בתוספת 3 μM IWR1 ו 5 μM SB431542 לכל באר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    7. חזור על שלבים 5 ו- 6 כל 3 ימים עד יום 18.
  4. העברת נוירוספרות
    1. ביום 18, הכן את בידול קליפת המוח בינוני II (CDMII) (טבלה 1) והוסף 10 מ"ל ללוח תרבית תאים אולטרה-נמוך בגודל 100 מ"מ.
    2. השתמש פיפטה 200 μL עם קצה מנותק כדי להעביר את הנוירוספרות העגולות מן צלחת 96-well ללוח תרבית תא מצורף 100 מ"מ אולטרה נמוך.
      הערה: להיות עדין כדי למנוע פגיעה בנוירוספירות על ידי מוודא את פתיחת הקצה רחב מספיק וכי האגרגטים אינם שואפים מהר מדי.
    3. הסר 5 מ"ל של בינוני מהצלחת המכילה את הנוירוספירות ולהוסיף 5 מ"ל של CDMII טרי.
      הערה: הליך זה מסייע להפחית את כמות מדיום CDMI שייתכן שנשאה מהעברת נוירוספירות.
    4. מניחים את הלוח על שייקר מסלולית ב-70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית רקמות לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      הערה: בדוק חזותית את הנוירוספירות למחרת. להגביר את המהירות של שייקר מסלולית אם הנוירוספירות מגושמות זו לזו או מחוברות לתחתית הלוח.
    5. כל 3 ימים, שאפו בזהירות את המדיום העל-טבעי והחליפו אותו ב-CDMII טרי. השאירו כמות קטנה של המדיום כדי למנוע מהנוירוספירות להתייבש.
    6. ביום 35, הכן בידול קליפת המוח בינוני III (CDMIII) (טבלה 1).
      הערה: יש להמיס את רכיב המטריצה ב- CDMIII קר.
    7. שאפו את המדיום מהצלחת והוסיפו 10 מ"ל של CDMIII קר.
      הערה: זה יעיל יותר להשתמש במדיום קר, כך רכיב המטריצה יכול לצפות את organoids מבלי ליצור גושים.
    8. לאחר שינוי המדיום, מניחים את הצלחת בחזרה על שייקר מסלולית ב 70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח ב 37 °C (5%) ו 5% CO2.
    9. לשנות את המדיום כל 3-5 ימים בהתאם לקצב הצמיחה, כפי שצוין על ידי צבע המדיום.
    10. ביום 70, הכן את ההבחנה הקליפתית בינונית IV (CDMIV) (טבלה 1). השתמש במדיום CDMIV עד להגעה לגיל הרצוי של organoids. במהלך תקופה זו, לשמור את הצלחת על שייקר מסלולית להגדיר ב 70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח (37 °C (37 °C (5% CO2).
    11. לשנות את המדיום כל 3-5 ימים, בהתאם לקצב הצמיחה.

2. חיסונים של אורגנוידים במוח

  1. הכנת רקמות
    1. הכן פתרון paraformaldehyde 4%, והנח אותו מתחת למכסה המנוע בטיחות.
      הערה: ללבוש ציוד בטיחות אישי בעת טיפול PFA.
    2. לאסוף organoids המוח ולהעביר אותם בעדינות עם פיפטה פסטר פלסטיק 3 מ"ל קהה לצלחת 6-באר מלא PFA.
      הערה: השתמש organoids מעל 40 ימים כדי לאפשר הדמיה של מבנים עם מורכבות תאית גבוהה יותר.
    3. שמור את האורגנוידים בתמיסת PFA למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    4. הסר בזהירות את PFA עם פיפטה פסטר פלסטיק 3 מ"ל, ולשטוף את organoids קבוע שלוש פעמים באמצעות PBS.
    5. יש לאחסן את האורגנוידים הקבועים ב-4 °C ב- PBS עד לשימוש נוסף.
  2. הכנת פרוסות אורגנויד במוח
    1. מכינים תמיסה של 3% אגר ומחממים לאט עד להנזלה.
    2. מניחים את התבנית (הקצה החתוך של מזרק 10 מ"ל) על פיסת נייר סינון סופג (צד חלק למעלה). מניחים עליו טיפת אגר.
    3. מוציאים במהירות אורגנואיד אחד מהצלחת בעלת 6 הבאר עם מרית ומסירים PBS מוגזמים עם נייר סינון.
      הערה: היזהר לא לגעת organoid ישירות עם נייר מסנן.
    4. מניחים את האורגנויד על טיפת אגר.
    5. חזור על הליך זה עם עד שלושה organoids.
      הערה: עבוד מהר כדי למנוע התגבשות של אגר במהלך שלב זה.
    6. ממלאים את התבנית באגר עד שכל האורגנוידים מכוסים במלואם.
    7. המתינו עד שהאגר יתחיל להתמצק, ולאחר מכן מעבירים בעדינות את כל התבנית המכילה את האורגנוידים, כולל נייר המסנן הסופג, לאלמנט קירור.
      הערה: אם אלמנט קירור אינו זמין, לאחסן את organoids במשך כמה דקות במקרר ב 4 °C (70 °F).
    8. בינתיים, היכונו להליך החתך: הניחו סכין גילוח (ניקה עם אצטון ונשטפו במים מזוקקים כפולים) לתוך מחזיק הוויברטום, הר על האמבטיה, ולמלא אותו עם PBS.
    9. מוציאים את התבנית מהאגר (המוצק) ומשתמשים באזמל כדי לקצץ אותו ליצירת קובייה.
    10. חברו את קוביית אגר המכילה את האורגנוידים על צלחת המוביל של הוויברטום עם ג'ל דבק (ראו טבלת החומרים), ומניחים אותה באמבטיה המכילה PBS.
    11. כוונן את הוויברטום (ראה טבלת החומרים) כדי לחתוך פרוסות בעובי של 150 מיקרומטר.
      הערה: הגדרות ויברטום (זווית נכונה, משרעת, תדירות ומהירות הלהב) עשויות להיות דומות לאלה המשמשות לחתוך רקמת מוח קבועה המופקת מבעלי חיים מוקדמים לאחר ההולכה. עם זאת, ההגדרות האידיאליות תלויות מאוד בסוג הוויברטום ויש לקבוע בצעד הראשון כדי למנוע עיוות או אפילו קריעת הרקמה בעת חיתוך.
    12. התחל את הליך החיתוך. השתמשו בפיפטה מזכוכית או במרית כדי להעביר בעדינות כל פרוסה חתוכה טרייה לצלחת 24-well מלאה ב-PBS.
    13. לאחסן את הצלחת המכילה פרוסות ב 4 °C (עד כמה ימים) עד עיבוד נוסף.
    14. מעבירים את הפרוסות מהצלחת עם פיפטה מזכוכית או מרית על מגלשות מיקרוסקופ. השתמש במינימום של 2 פרוסות לשקופית.
    15. הסר בזהירות את אגר ועודף PBS עם מזרק.
    16. אפשר לפרוסות להתייבש עד שהן נצמדות לשקופיות.
      הערה: בעוד שקופיות מיקרוסקופ ניתן לאחסן בתאי פלסטיק מלא PBS ב 4 °C (4 °F), הם צריכים להיות מוכתמים בהקדם האפשרי לאחר הליך חיתוך.
  3. כתמים אימונוהיסטוכימיים
    1. הכן את פתרון החסימה (טבלה 1).
    2. השתמש בעט PAP כדי לצייר גבול הידרופובי סביב הפרוסות בשקופית כדי לעזור לשמור את כל הפתרונות בשקופיות.
    3. בזהירות להוסיף את פתרון חסימה על השקופית, ודגור במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר (22-25 °C (25 °F). כדי למנוע השמדת הרקמה, לא להוסיף את הפתרון ישירות על גבי הפרוסות.
    4. שאפו את פתרון החסימה והחלו את הנוגדן הראשי הרצוי מדולל בתמיסת החסימה.
    5. לדגור את השקופית לילה בחדר לח ב 4 °C (5 °F).
    6. יש לשטוף את השקופית שלוש פעמים עם PBS 1x למשך 10 דקות כל אחת.
    7. לדגור את הפרוסות עם הנוגדן המשני הספציפי מדולל בתמיסת החסימה ולבצע הכתמת Hoechst (1:2,500) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
      הערה: זכור לבצע פקדים שליליים כדי לאשר שאין איגוד לא ספציפי או פלואורסצנטיות אוטומטית.
    8. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS 1x למשך 10 דקות כל אחת בחושך.
    9. מוסיפים טיפה אחת של מדיום הרכבה לפרוסה, מניחים כיסוי על קצה הטיפה, ומניחים לאט את הכיסוי כלפי מטה לכיוון הפרוסה כדי למנוע בועות אוויר.
    10. אפשר למגלשה לנוח לילה בטמפרטורת החדר. החל לק על גבול כיסוי כדי לאטום עוד יותר את השקופית. לאחסון לטווח ארוך, יש לאחסן ב- 4 °C (70 °F).
  4. תיעוד של כתמים
    1. כדי לסרוק תמונות גדולות לתפירה, השתמש במיקרוסקופ רחב-שדה ממונע המצויד (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים) במטרה באיכות גבוהה; ערכת מסנני DAPI (למשל, עירור (EX): 340-380 ננומטר, מראה דיכרואית (DM): 400 ננומטר, מסנן מחסום (BA): 435-485 ננומטר); ערכת מסננים פלואורסצין איזוטיוצינט (למשל, EX: 465-495 ננומטר, DM: 505 ננומטר, BA: 515-555 ננומטר); ערכת מסננים Alexa594 (למשל, ET 575/40; T 600 LPXR; ח"כ 623/24); מצלמה דיגיטלית; תוכנת רכישה בעלת ביצועים גבוהים המאפשרת תפרים אוטומטיים ופעולות מחסנית.
    2. לטיפול בתמונה, השתמש בתוכנית עיבוד תמונה המסוגלת ליצור קבצי tif של 8 סיביות, לחתוך תפרים, להתאים ניגודיות ובהירות, למזג את הערוצים (לדוגמה, כחול, ירוק ואדום) והוספת סרגלי קנה מידה.
    3. כדי לסרוק פרטים, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ממונע המצויד במטרה באיכות גבוהה, לייזר UV (EX: 408 ננומטר), לייזר ארגון (EX: 488 ננומטר), לייזר הליום-ניאון (EX: 543), תוכנת הדמיה למיקרוסקופ קונפוקלי.
    4. לטיפול בתמונה בפרטים, השתמש בתוכנית עיבוד תמונה המסוגלת ליצור תחזיות בעוצמה המרבית של ערימות z קונפוקליות (לדוגמה, מקטעים אופטיים של 0.6 מיקרומטר כל אחד), יצירת קבצי tif של 8 סיביות, התאמת ניגודיות ובהירות, מיזוג הערוצים (לדוגמה, כחול, ירוק ואדום), הוספת סרגלי קנה מידה.
    5. השתמש בעורך גרפי כדי לסדר את האיור.

3. פרופיל ביו-אנרגטי של אורגנוידים במוח

  1. הכנת אורגנוידים לפרופיל ביו-אנרגטי
    1. הכן את פתרון הפפאין וה- DNase בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    2. מעבירים 3-5 אורגנוידים לצלחת 6-באר. לשטוף אותם פעמיים עם PBS קדם-קדם.
    3. הוסף 2 מ"ל של פתרון פפאין פעיל מחמם מראש המכיל DNase. בעזרת להב, חותכים את האורגנוידים לחתיכות קטנות.
    4. מניחים את הלוח על שייקר מסלולית שנקבע ב-27 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית תאים (ב-37 °C (ב-37 °C(5%CO2), ודגרה למשך 15-20 דקות.
      הערה: זמן הדגירה תלוי בשלב האורגנויד. אורגנוידים בשלב מוקדם יכולים לשמש כפי שהם. עבור organoids מעל 3 חודשים, מומלץ לחתוך את organoids לתוך 2-3 חתיכות לפני ניתוק ודגרה את החלקים במהירות נדנדה להגדיר על 27 סל"ד במשך 15-20 דקות ב 37 °C (75 °F). הליך זה יכול לעזור להסיר רקמה נמקית שעשויה להיות נוכחת באורגנוידים בשלב מאוחר יותר.
    5. לאסוף את הרקמות מעוכל לתוך צינור 15 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל של CDMIV בינוני תרבות organoid (טבלה 1).
    6. טריטוריאט את הרקמה עם פיפטה מפלסטיק 10 מ"ל על ידי צנרת למעלה ולמטה 10-15 פעמים. תן לרקמה הלא מזוהה להתיישב לתחתית הצינור.
    7. בזהירות להעביר את השעיית התא לצינור 15 מ"ל, הימנעות כל חתיכות של רקמה לא מזוהה. לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר (למשל, צינורות עגולים פוליסטירן עם כובעי מסננת התא).
    8. גלולה את התאים על ידי centrifuging ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. להעריך את מספר התא ואת האיכות באמצעות כחול טריפן.
    10. צלחת את המספר הרצוי (~ 20,000 / טוב) של תאים על מצופה 96-היטב מיקרו-לוחות. שנה את הבינוני 6-8 שעות לאחר ציפוי למדיום עצבי (טבלה 1).
    11. לדגור על המיקרו-לוח מצופה 96-well באינקובטור CO2 (37 °C(37 °C, 5% CO2) למשך 4 ימים.
  2. פרופיל ביו-אנרגטי
    1. ביום 3 לאחר שתשובו לתאים המנותקים, הוסיפו 200 מיקרו-אל של פתרון כיול לכל באר בחלק התחתון של המיקרו-לוח בן 96 הבארות, והנחו את מחסנית החיישן הירוק העליון על המיקרו-לוח hydrated.
      הערה: הנח את מחסנית החיישן על גבי המיקרו-לוח בכיוון הנכון, וודא שפתרון הכיול מכסה את כל החיישנים.
    2. לדגור על מיקרו-לוחית 96-באר hydrated באינקובטור שאינו CO2 ב 37 °C (50 °F) לילה.
    3. הפעל את המנתח כדי לאפשר למכשיר להתייצב ב 37 °C (50 °F) לילה.
    4. ביום 4 לאחר ההשתלה, בדוק את התרבות האורגנויד מנותק על 96-well microplate מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי התאים מופיעים כמו monolayer confluent.
    5. הכן את אסאי מדיום (טבלה 1).
    6. הסר בינוני עצבי מכל בארות עם pipette מבלי לגעת בתחתית הבאר כדי למנוע נזק לתא. לחלופין, בזהירות הפוך את כל הצלחת ולאחר מכן לייבש אותו על נייר נקי. עבוד במהירות כדי למנוע מוות בתא.
    7. לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL 200 μL של אסאי מדיום. הוסף את מדיום אסאי לנפח סופי של 180 μL לבאר. לדגור על 96-היטב microplate בחממה שאינה CO2 ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעה.
    8. הכן 10 פתרונות μM של מעכבי מיטוכונדריאליים במדיום אסאי. שים לב כי הריכוז הסופי לאחר הזרקה הוא 1 μM.
    9. טען את מחסנית החיישן המוצבת במיקרו-לוח hydrated עם פתרונות פי 10 של מעכבי המיטוכונדריה.
      1. הוסף 18 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 1 לתוך יציאה A.
      2. הוסף 19.8 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 2 לתוך יציאה B.
      3. הוסף 21.6 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 2 לתוך יציאה C.
      4. הוסף 23.4 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 3 לתוך יציאה D.
    10. מניחים את המחסנית הטעון במיקרו-לוח hydrated בחממה שאינה CO2 ב 37 °C (7 °F) עד תחילת ההסתה.
    11. הגדר פרוטוקול פועל בתוכנת המכשיר (טבלה 2).
    12. לחץ על התחל. קח את המחסנית הטעונה מהחממה שאינה CO2 והנח אותה במנתח לכיול.
      הערה: ודאו שהצלחת מוכנסת לכיוון הנכון וללא המכסה.
    13. לאחר סיום שלב הכיול, הסר את לוח הכיול. קח את המיקרו-לוחית 96-well מהחממה שאינה CO2 והכנס אותו למנתח. לחץ על CONTINUE כדי להתחיל את המדידות.
    14. כאשר הריצה מסתיימת, להסיר את 96-היטב תרבית התא microplate מן המנתח ולאסוף את המדיום מכל בארות מבלי להפריע לתאים.
      הערה: המדיום יכול להיות מאוחסן ב -20 °C (20 °F) ולהשתמש מאוחר יותר למדידת כמות הלקטאט ששוחררו על ידי התאים במדיום באמצעות ערכת בדיקות לקטט מתאימה.
    15. לשטוף את התאים עם 200 μL של 1x PBS בכל באר.
    16. לאחר הסרת PBS, להקפיא את הצלחת ב -20 °C (50 °F).
      הערה: ניתן להשתמש בלוח הקפוא כדי לכמת תאים, חלבונים או DNA בכל באר של המיקרו-פלט. כימות זה יהיה צורך לנרמל את שיעורי הביו-אנרגטית המתקבלים. בצע את הוראות היצרן לבדיקות כימות תאים, חלבונים או דנ"א.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור החזק של organoids עגול (איור 1A). האורגנוידים שנוצרו מכילים נוירונים בוגרים שניתן לדמיין באמצעות סמני חלבון ספציפיים לאקסונים (SMI312) ודנדריטים (חלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2)) (איור 1B). אורגנוידים בוגרים מכילים לא רק תאים עצביים (MAP2-חיובי) אלא גם תאי גליה (למשל, חיוביים עבור סמן האסטרוציטים S100 חלבון מחייב סידן B (S100ß)) (איור 1B)<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתאר את הדור הניתב לשחזור של אורגנוידים אנושיים המופקים מ- IPSC ואת השימוש בהם למידול מחלות מיטוכונדריאליות. הפרוטוקול המתואר כאן משתנה בהתבסס על עבודה שפורסמה בעבר20. אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא אינו דורש הטמעה ידנית של כל אורגנויד במטריצה פיגומים. למעשה, פתרון המטריצה פשוט מומס למדיום תרבית התא. יתר על כן, אין צורך להעסיק bioreactors יקר, כמו organoids ניתן תרבית בתרבות רקמות סטנדרטית 6-היטב לוחות ממוקם על שייקר מסלולית בתוך האינקובטור. הליך זה מאפשר גם טיפוח מקביל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על אינטרסים פיננסיים או לא פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מודים למרים בנינג על התמיכה הטכנית. אנו מכירים בתמיכה של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ל- A.P.), ספארק ומכון הבריאות של ברלין (BIH) (קרנות אימות BIH ל- A.P.), הקרן המאוחדת למחלות מיטוכונדריאליות (UMDF) (מענק הקונסורציום הבינלאומי של תסמונת לי ל- A.P.), דיסלדורף של בית החולים האוניברסיטאי (Forschungskommission UKD ל- A.P.), ומשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (ה: ביו חוקר צעיר להעניק AZ 031L0211 לא.פ.). העבודה במעבדה של C.R.R. נתמכה על ידי DFG (עבור 2795 "סינפסות תחת לחץ", Ro 2327/13-1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (אירופה) בע"מתוכנת פריסה; עורך גרפיקה וקטורית
Alexa Fluor 488 חמור אנטי שרקןסיגמא אולדריץ'SAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 חמור נגד עכברThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimycin ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
לייזר ארגוןMelles Griotכל לייזר אחר, למשל, לייזרי דיודה הפולטים 488 זה בסדר, גם
חומצה אסקורביתSigmaA92902
B-27 עם ויטמין AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% ב-PBS, אחסן תמיסה ב-20 מעלות; C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
תרבית תא כוכב תא 6 צלחתבאר Greiner-Bio-One657160
תרכיז שומנים מוגדר כימיתGibco11905031
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי C1פתרונות מיקרוסקופ ניקון מיקרוסקופמודולרי מערכת
קורנינג מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) מטריצת ממברנת בסיס, פנול ללא אדום, ללא LDEVרכיב 356231 מטריקסקורנינג
בדיקת התפשטות תאיםThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
חמור נגד עזים Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
חמור נגד עכבר Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
חמור נגד ארנב Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc מצלמהNikon Microscope Solutions
Eclipse 90i מיקרוסקופ שדה רחב זקוףניקון פתרונות מיקרוסקופ
Eclipse E 600FN מיקרוסקופ זקוףניקון פתרונות
Eclipse Ts2 מיקרוסקופ הפוךניקון פתרונות מיקרוסופ
EZ-C1 כסף גרסה 3.91ניקון פתרונותמיקרוסקופ הדמיה תוכנה למיקרוסקופ קונפוקלי
FCCPסיגמא אולדריץ'370-86-5
סרום בקר עובריGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
גלזגו MEMGibco11710-035
פיפטה מזכוכית פסטרמותג747715
הפוך GlutamaxGibco35050-061
הליום-ניאוןלייזר Melles Griotכל לייזר שני, למשל, לייזרי דיודה הפולטים 594 זה בסדרגם
HeparinMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubatorThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband המכון הלאומי לבריאותתוכנה לעיבוד תמונה
Injekt Solo 10 מ"ל / LuerBraun4606108V
החלפת סרום נוקאאוטלייזר Gibco10828010
(407 ננומטר)קוהרנטיכל לייזר אחר, למשל, לייזרי דיודה הפולטים 407 זה בסדר, גם
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR Plusטכנולוגיית תאי גזע85850iPSC בינוני
Multifuge X3R צנטריפוגהתרמו מדעית10325804
MycoAlert ערכת זיהוי מיקופלזמהLonza# LT07-218
N2 תוסףGibco17502-048
מחט לשימוש חד פעמי (23G x 1 אינץ' TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonImaging software
Oligomycin ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EAכדי לצייר מחסום הידרופובי על מגלשות.
ערכת מערכת דיסוציאציה פפאיןוורת'ינגטוןLK003150
פרפורמלדהידMerck8187154% ב-PBS, תמיסת אחסון ב-20 מעלות; C
פסטר פיפטה 7 מ"לVWR612-1681מדורג עד 3 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon MicroscopeSolutions תוכנית אובייקטיבית מיקרוסקופ
Apo VC 60x / 1.40 שמן DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13פתרונותמיקרוסקופ של ניקוןשמן טבילה מיקרוסקופ אובייקטיבי
פוליסטירן צלחת פטרי (100 מ"מ)גריינר ביו-וואן664161
פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים (5 מ"ל)פלקון352235
אשלגן כלוריRoth6781.1
ProLong זכוכית Antifade MoutantInvitrogenP36980
נייר סינון איכותיVWR516-0813
מעכב סלעיםMerckSCM075
רוטנוןסיגמא83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
להבי אזמלHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend837904 1:500
נתרן ביקרבונטMerck/Sigma31437-1kg-M
נתרןכלורי רוט3957
נתרן דימימן פוספטApplichem131965
נתרן פירובטGibco11360070
SOX2סנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-173201:100
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibco / StemProA1110501מגיב
ג'ל דבק סופר UHU63261ג'ל דבק
SuperFrost PlusVWR631-0108
מזרק לשימוש חד פעמי (1 מ"ל)BD פלסטיפאק300015
TB2 תרמובלוקביומטרה
צלחת TC 24 בארSarstedt83.3922
TC צלחת 6 בארSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
קולט אדיםלתרבית רקמותThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5MEDTA Invitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo Scientificהייצור הסתיים, כל מיקרוטום מתכוונן אחר גם הוא בסדר.
Vibratome Wilkinson Classic Razor BladeWilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt אנטגוניסט IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 מנתח שטף חוץ-תאיSeahorse Bioscience100737-101
XF Assay DMEM MediumSeahorse Bioscience103680-100
XF Calibrant SolutionSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (96 בארות מיקרוSeahorse Bioscience102416-100
ערכת מיקרוסקופ יבש , )

מקורות

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
  3. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  4. Carelli, V., Chan, D. C. Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems. Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).
  5. Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. Mitochondrial diseases: hope for the future. Cell. 181 (1), 168-188 (2020).
  6. Weissig, V. Drug development for the therapy of mitochondrial diseases. Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).
  7. Tyynismaa, H., Suomalainen, A. Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease. EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).
  8. Ma, H., et al. Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease. Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).
  9. Galera-Monge, T., et al. Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons. International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191(2020).
  10. Zheng, X., et al. Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration. Elife. 5, 13378(2016).
  11. Lorenz, C., et al. Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
  12. Inak, G., et al. Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease. Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).
  13. Chiaradia, I., Lancaster, M. A. Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo. Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  15. Liput, M., et al. Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids. Developmental Neurobiology. , (2021).
  16. Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment. Cell Death and Disease. 11 (3), 182(2020).
  17. Romero-Morales, A. I., et al. Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis. bioRxiv. , (2020).
  18. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nature Communications. 12 (1), 1929(2021).
  19. Falk, M. J. Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease. Journal of Developmental & Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).
  20. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  21. Pfiffer, V., Prigione, A. Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).
  22. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).
  23. Menacho, C., Prigione, A. Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids. International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).
  24. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע פלורסנטים מושרוצים אנושיים (Human iPSCs)יצירת אורגנואידיםגבייה קורטיקליתיצירת נוירוספירותפרופיל ביואנרגטידימוי קונפוקאליקצב צריכת חמצןמטבוליזם מיטוכונדריאלי
דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.