הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

3.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62757

⸱

5 בינואר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

תקציר

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) מאפשרת הדמיה של תנועת תאים, חלוקה ומוות ברזולוציה של תא בודד. IVM דרך חלונות הדמיה שהוכנסו בניתוח הוא חזק במיוחד מכיוון שהוא מאפשר תצפית אורכית של אותה רקמה במשך ימים עד שבועות. חלונות הדמיה טיפוסיים כוללים כיסוי זכוכית במסגרת מתכת תואמת ביולוגית הנתפרת לעור העכבר. חלונות אלה יכולים להפריע לתנועה החופשית של העכברים, לעורר תגובה דלקתית חזקה, ולהיכשל עקב זכוכית שבורה או תפרים קרועים, שכל אחד מהם עשוי להצריך המתת חסד. כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחו חלונות להדמיה ארוכת טווח של איברי בטן ובלוטות החלב מסרט דק של פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון צלול אופטית ששימש בעבר להדמיית חלונות הדמיה גולגולתיים. חלונות אלה יכולים להיות מודבקים ישירות לרקמות, ובכך להפחית את הזמן הדרוש להחדרה. PDMS הוא גמיש, ותורם לעמידותו בעכברים לאורך זמן – עד 35 יום נבדקו. הדמיה אורכית היא הדמיה של אותו אזור רקמה במהלך מפגשים נפרדים. רשת נירוסטה הוטמעה בתוך החלונות כדי למקם את אותו אזור, מה שאפשר הדמיה של תהליכים דינמיים (כמו אינבולוציה של בלוטת החלב) באותם מקומות, בהפרש של ימים ספורים זה מזה. חלון סיליקון זה איפשר גם ניטור של תאים סרטניים בעלי תפוצה יחידה המתפתחים למיקרו-גרורות לאורך זמן. חלונות הסיליקון ששימשו במחקר זה פשוטים יותר להחדרה מאשר חלונות זכוכית ממוסגרים במתכת וגורמים לדלקת מוגבלת של הרקמות המצולמות. יתר על כן, רשתות משובצות מאפשרות מעקב פשוט אחר אותו אזור רקמה במפגשי הדמיה חוזרים ונשנים.

מבוא

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM), הדמיה של רקמות בבעלי חיים מורדמים, מציעה תובנות על הדינמיקה של אירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית ברקמות שלמות. היישומים של טכניקה זו משתנים מאוד, אך IVM סייע בתחום הביולוגיה של הסרטן כדי לעזור להבהיר כיצד תאים סרטניים פולשים לרקמות וגרורות, מתקשרים עם המיקרו-סביבה שמסביב ומגיבים לתרופות 1,2,3. בנוסף, IVM היה המפתח לקידום ההבנה של המנגנונים המורכבים השולטים בתגובות החיסוניות על ידי מתן תובנות המשלימות לגישות פרופיל ex vivo (למשל, ציטומטריה של זרימה). לדוגמה, ניסויי הדמיה תוך-ורידיים חשפו פרטים על תפקודי מערכת החיסון בכל הקשור לנדידת תאים ולמגע בין תאים, והציעו פלטפורמה לכמות הדינמיקה המרחבית-טמפורלית בתגובה לפציעה או לזיהום 4,5,6,7. רבים מהתהליכים הללו יכולים להיחקר גם באמצעות כתמים היסטולוגיים, אך רק IVM מאפשר מעקב אחר שינויים דינמיים. למעשה, בעוד שמקטע היסטולוגי מציע תמונת מצב של הרקמה בזמן נתון, הדמיה תוך-תאית יכולה לעקוב אחר אירועים בין-תאיים ותת-תאיים בתוך אותה רקמה לאורך זמן. בפרט, ההתקדמות בתיוג הפלואורסצנטי והתפתחותם של כתבים מולקולריים אפשרו לאירועים מולקולריים להיות מתואמים עם התנהגויות תאיות, כגון התפשטות, מוות, תנועתיות ואינטראקציה עם תאים אחרים או עם המטריצה החוץ-תאית. רוב טכניקות IVM מבוססות על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, אשר בשל פיזור אור, מה שהופך את ההדמיה של רקמות עמוקות יותר למאתגרת. הרקמה המעניינת, אם כן, צריכה לעתים קרובות להיחשף בניתוח בהליך פולשני וסופי לעתים קרובות. לכן, בהתאם לאתר האיבר, ניתן לדמות את הרקמה ברציפות במשך תקופה שנעה בין כמה ל -40 שעות8. לחלופין, החדרה כירורגית של חלון הדמיה קבוע מאפשרת הדמיה של אותה רקמה ברצף על פני תקופה של ימים עד שבועות 7,9.

הפיתוח של חלונות הדמיה חדשים הודגש כצורך טכנולוגי לשיפור נוסף של גישות ההדמיה התוך-ויראלית10. חלון ההדמיה התוך-עינית הוא טבעת מתכת המכילה כיסוי זכוכית המחובר לעור עם תפרים11. הפרעה לתנועה חופשית, הצטברות של הפרשה ונזק לכיסוי הזכוכית הם בעיות נפוצות שנראו בשימוש בחלונות כאלה. יתר על כן, החלון האבטיפוסי דורש ייצור מיוחד, וההליך הכירורגי יכול לדרוש הכשרה נרחבת. כדי לטפל בבעיות אלה, פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון, ששימש בעבר בחלונות גולגולת להדמיה ארוכת טווח במוח12, הותאם לשימוש בהדמיית איברי בטן ובלוטת החלב. כאן מוצגת שיטה מפורטת ליצירת חלונות סיליקון מבוססי PDMS, כולל כיצד להטיל את החלון סביב רשת נירוסטה כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת של אותם אזורי רקמה. יתר על כן, מתואר הליך כירורגי פשוט ונטול תפרים להחדרת החלון מעל איברי הבטן או בלוטת החלב. גישה חדשה זו מתגברת על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום ומגבירה את הנגישות של הדמיה תוך-ורידית אורכית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים שתוארו בוצעו בהתאם להנחיות הכירורגיות של מעבדת קולד ספרינג הארבור ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת קולד ספרינג הארבור.

1. יציקת חלון הסיליקון

  1. הכן את פולימר הסיליקון (PDMS) על ידי ערבוב האלסטומר הבסיסי וחומר הריפוי ביחס של 10:1 (v/v).
  2. יציקו חלון על ידי הפקדת כמות קטנה של PDMS על משטח סטרילי וחלק והתאימו את יחס הנפח לאזור לעובי הרצוי.
    הערה: שימוש בתמיסת פולימר של 200 מ"ג עבור עיגול בקוטר 22 מ"מ על מכסה של מכסה של 24 לוחות היטב מביא לפשרה טובה בין עמידות החלון לבהירות אופטית.
  3. אופציונלי: כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת ונשנית של אותם אזורי רקמה, לחץ קלות על רשת נירוסטה לתוך הסיליקון לאחר שה- PDMS נמצא על משטח היציקה הרצוי.
  4. כדי להסיר בועות אוויר, מניחים את המשטח המצופה במייבש ואקום למשך 45 דקות כדי לנטרל את הפולימר.
  5. יש לרפא את חלונות הסיליקון בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  6. נקבו את הפולימר בשולי התבנית וקלפו בעדינות את החלונות הנרפאים מהמשטח המשמש ליציקה עם מלקחיים.
  7. לפני הניתוח, לעקר את החלונות על ידי autoclaving.

2. הכנת העכבר להכנסת חלון הסיליקון

  1. הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות 4% (v/v) איזופלורן. העבירו את העכבר למשטח חימום על שולחן הניתוח, הניחו את העכבר במסכת האף להרדמה והורידו את ריכוז האיזופלורן ל-2% לצורך תחזוקה לאורך כל הניתוח.
  2. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטה של בהונות הגפיים האחוריות. אין להמשיך עד שהעכבר אינו פעיל ואינו מראה תגובת רפלקס צביטה בבוהן.
  3. יש למרוח על העיניים חומר סיכה אופתלמי כדי למנוע מהן להתייבש ולמנוע טראומה.
  4. נהלו משכך כאבים מונע (בופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג) תת עורית.
  5. לגלח את אתר הניתוח ולהסיר לחלוטין את השיער עם קרם להסרת שיער.
  6. יש למרוח תמיסת פובידון-יוד (10% v/v) ואתנול (70% v/v) ברצף פי 3 כדי למנוע את ההדבקה באתר הניתוח.

3. החדרת חלון גחון להדמיה בכבד; ניתן להתאמה לאיברי בטן אחרים (איור 1)

  1. מקם את העכבר במצב שכיבה.
  2. בצע חתך 10 מ"מ החל 3 מ"מ למטה מתהליך xiphoid באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
  3. יש להסיר מקטע של 1-1.5 ס"מ2 של העור לאורך קו האמצע.
  4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
  5. אופציונלי: כדי לדמיין חלק גדול יותר מהכבד, השתמשו במטושי כותנה סטריליים לחים במי מלח סטריליים כדי לדחוף את הכבד כלפי מטה מהסרעפת החושפת את הרצועה הפלציפורמית המחברת את הכבד לסרעפת. נתקו את הרצועה תוך הקפדה שלא לחתוך את הווריד הנבוב התחתון.
  6. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הכבד סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה. דבק זה יוצר אטימה עגולה, ומשאיר את אזור המרכז שלם להדמיה.
    אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק. אין צורך לייבש את הרקמה לפני החלת הדבק.
    הערה: ניתן להשתמש בהצלחה בכל הדבקים המבוססים על ציאנואקרילט עבור הליך זה. דבק כירורגי מבטיח סטריליות. עבור הליכים סופניים, דבקי-על לכל מטרה מניבים תוצאות טובות.
  7. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הכבד עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
  8. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
  9. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
  10. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
    הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הכבד צריך להיראות כעת דרך החלון.
  11. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.
    אזהרה: אם ההליך מתבצע בטכניקות כירורגיות סטריליות והחלון מעוקר לפני ההחדרה, די באיטום הפצע באמצעות דבק כירורגי כדי למנוע זיהומים. עם זאת, אי ביצוע טכניקות אספטיות נכונות במהלך החדרה כירורגית או סגירה לא מושלמת עלול להוביל לזיהום גלוי או תת-קליני ולהתייבשות מהרקמה.

4. החדרת חלון רוחבי להדמיה בכבד; התואם את ההזרקה המקבילה של תאים סרטניים בווריד הפורטל (איור 2)

  1. מקם את העכבר על מיקום הדקוביטוס הצדדי השמאלי
  2. בצע חתך 10 מ"מ באגף הימני 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
  3. יש להסיר קטע עור בגודל 1 ס"מו-2 .
  4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
  5. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הכבד סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
    אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
    הערה: ניתן להשתמש בהצלחה בכל הדבקים המבוססים על ציאנואקרילט עבור הליך זה. דבק כירורגי מבטיח סטריליות. עבור הליכים סופניים, דבקי-על לכל מטרה מניבים תוצאות טובות.
  6. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הכבד עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
  7. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
  8. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
  9. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
    הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הכבד צריך להיראות כעת דרך החלון.
  10. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.
  11. אם נדרשת הזרקת וריד פורטל:
    1. מקם את העכבר במצב שכיבה.
    2. בצע חתך של 10 מ"מ החל מתהליך ה- xiphoid בעור.
    3. באמצעות זוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים, לבצע חתך 10 מ"מ בצפק.
    4. טובלים שני צמר גפן מלוחים במי מלח סטריליים.
    5. השתמשו במטושים מכותנה כדי למשוך בעדינות את המעי על גזה סטרילית הרטובה במי מלח סטריליים, תוך הקפדה שלא לסובב או לשבש את הכיוון בדרך אחרת.
    6. יש להמשיך לעקור את המעי מחלל הבטן עד לווריד הפורטלי להיראות בצד ימין של הבטן.
    7. מכניסים מחט 31–33 גרם בקוטר 5–7 מ"מ עד לנקודת הכניסה של וריד הפורטל לתוך הכבד, תוך הקפדה להמשיך בתוך כלי הדם ולא דרכו.
    8. לאט לאט להזריק את התאים הסרטניים (resuspended ב 100 μL של PBS סטרילי).
      הערה: עבור ניסוי זה ניתן לתרבית את קו תאי סרטן הלבלב של אמורין (לדוגמה, KPC-BL/6-1199) בתרבית במדיית DMEM מלאה וב-1 x 10 105 תאים מוזרקים ב-100 μL של PBS סטרילי.
    9. כדי למנוע דימום, מיד לאחר משיכת המחט, להפעיל לחץ עדין על אתר ההזרקה עם חתיכה קטנה של ספוג כירורגי במשך 1-2 דקות.
    10. לאחר שחרור הלחץ, יש לעקוב אחר האתר במשך 1-2 דקות כדי לוודא שהמוסטזיס.
    11. באמצעות צמר גפן לח, להחזיר את המעי לתוך חלל הבטן בעקבות הכיוון הפיזיולוגי של האיבר.
    12. באמצעות מלקחיים סטריליים, להכניס את החלון מיד מתחת לצפק, בצד שמאל של חלל הבטן של העכבר.
    13. תפר עם תפרים משי 4-0 ומהדק את החתך בקו האמצע עם קליפסים לפצעים מפלדת אל-חלד 7 מ"מ.
    14. הזזת העכבר למצב דקוביטוס לרוחב שמאלה
    15. בצע חתך 10 מ"מ באגף הימני 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית דרך העור באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
    16. יש להסיר מקטע של 1 ס"מ2 של העור סביב החתך.
    17. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
    18. משוך את החלון למקומו מעל הכבד לפני הדבקתו במקומו, כמתואר בשלבים 4.8-4.10.

5. החדרת החלון להדמיה בלבלב (איור 3)

  1. מקם את העכבר על מיקום הדקוביטוס הצדדי הימני.
  2. בצע חתך 10 מ"מ באגף השמאלי 3 מ"מ מתחת לקשת הקוסטלית באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
  3. יש להסיר מקטע של 1 ס"מ2 של העור סביב החתך.
  4. השתמש בזוג שני של מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר קטע של הצפק מעט קטן יותר מחלק העור.
  5. באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים, משכו בעדינות את הטחול כדי לדמיין את הלבלב. המשך למקם מחדש את הלבלב עם מטושים מכותנה לחה כדי להפוך שטח פנים גדול יותר לנראה דרך החתך.
    הערה: בשלב זה, תאים סרטניים בלבלב יכולים להיות מוזרקים באופן אורתוטופי לתוך הלבלב אם זה חלק מהתכנון הניסויי.
  6. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של הלבלב סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
    אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
  7. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד הלבלב עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
  8. קפלו את קצות החלון מתחת לצפק.
  9. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לצפק. דחפו כלפי מטה את הצפק עם מלקחיים כדי להדק אותו לחלון.
  10. באופן דומה, הפקידו כמות קטנה של דבק כירורגי על הצפק לפני שהם דוחפים כלפי מטה את העור עם מלקחיים כדי להצמיד אותו לצפק.
    הערה: אם מבוצע כראוי, אזור מעגלי של רקמת הלבלב צריך להיות גלוי כעת דרך החלון.
  11. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.

6. החדרת החלון להדמיה בבלוטת החלב (איור 4)

  1. מקם את העכבר על מצב השכיבה.
  2. הכינו חתך 10 מ"מ מדיאלי לאחת הפטמות המפשעתיות באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים.
  3. יש להסיר קטע עור בגודל 0.5 ס"מ2 מעל בלוטת החלב.
  4. השתמשו בזוג שני של מספריים סטריליים כדי להפריד בזהירות את בלוטת החלב מהעור על ידי פיזור המספריים בין שני המשטחים כדי לשבש את ההדבקה.
    הערה: כדי להקל על הדמיה של אזור בלוטת החלב המפשעה, הקפידו לנתח חלק מהעור מעל בלוטת החלב אך עדיף על הרגל האחורית, כך שהחלון אינו מגביל את ניידות העכבר.
  5. למשוך דבק כירורגי עם מזרק 31 G, להחיל כמות קטנה ממנו על פני השטח של בלוטת החלב סביב הקצוות של האזור כדי להיות תמונה.
    אזהרה: הגבילו את הדבק לטיפות קטנות היוצרות תבנית מעגלית סביב אזור ההדמיה. לא ניתן לדמיין רקמה במגע מיידי עם הדבק.
  6. מקמו את החלון באמצעות מלקחיים והחזיקו אותו בחוזקה כנגד בלוטת החלב עד שהדבק התייבש (כ-2 דקות).
    הערה: אזור מעגלי של רקמת בלוטת החלב צריך להיות גלוי כעת דרך החלון אם הוא מבוצע כראוי.
  7. מקפלים את שולי החלון מתחת לעור.
  8. עם מזרק, להפקיד כמות קטנה של דבק כירורגי בשולי החלון שנמצאים כעת מתחת לעור. לדחוף למטה על העור עם מלקחיים כדי להצמיד את העור לחלון.
  9. יש למרוח דבק סביב קצוות החלון כדי ליצור חישוק שיעזור למנוע מהעור לצמוח בחזרה מעל החלון.

7. התאוששות לאחר הניתוח

  1. מניחים את העכבר בכלוב התאוששות נקי עם חומר קינון בשפע, ומבטיחים שחלק מהכלוב מונח על משטח חימום.
  2. נטר את העכבר באופן רציף עד שהוא מודע ונייד.
  3. במידת הצורך, לספק מנה נוספת של משכך כאבים 12 שעות לאחר המינון מראש.
    הערה: משככי כאבים נוספים הם בדרך כלל מיותרים, אך התייעצו עם וטרינר אם העכבר מראה סימני מצוקה (כגון גב חבוק, פרווה לא מטופחת או אובדן עניין במזון). עקוב אחר העכבר מדי יום במשך 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח עבור סימנים של זיהום או תופעות לוואי אחרות. פחות מ-2% מהעכברים זקוקים לטיפול וטרינרי או להמתת חסד, בדרך כלל עקב ניתוק חלקי של החלון. חשוב לציין כי עבור עכברים זכרים עם חלונות הדמיה של כבד גחוני, לחימה בין עכברים עלולה לגרום לניתוק חלונות. זה נמנע על ידי דיור העכברים בנפרד.

8. הדמיה דרך החלון

  1. הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה באמצעות 4% (v/v) איזופלורן.
  2. יש למרוח על העיניים חומר סיכה אופתלמי כדי למנוע מהן להתייבש ולמנוע טראומה.
  3. העבר את העכבר מתא האינדוקציה לשלב המיקרוסקופ. מניחים את העכבר במסכת האף להרדמה, ומורידים את ריכוז האיזופלורן לכ-1-1.5% לצורך הרדמה בתחזוקה לאורך כל הליך ההדמיה.
  4. הניחו חיישן כרית לחץ מתחת לעכבר כדי לנטר את קצב הנשימה ולקבע את העכבר לבמה באמצעות סרט ניתוח רך.
  5. הכנס מדחום רקטלי כדי לעקוב אחר טמפרטורת הגוף לאורך כל סשן ההדמיה.
  6. הפעל את המשטח המחומם, תוך ניטור הדוק של העכבר כדי להבטיח שטמפרטורת הגוף לא תעלה על 37 °C (76 °F).
  7. השתמש בתוכנה כדי לנטר את קצב הנשימה של העכבר. הקצב האופטימלי הוא ~ נשימה אחת לשנייה. התאימו את ההרדמה לפי הצורך.
  8. לפני כל סשן הדמיה, נקו את החלון מכל מדיום טבילה ופסולת של עדשה שיורית על ידי ניגוב עדין שלו עם צמר גפן טבול ב-70% אתנול (v/v).
  9. בעת שימוש בעדשת טבילה במים, יש למרוח ג'ל אולטרסאונד על החלון, תוך הימנעות מבועות.
    הערה: ניתן להשתמש גם במים מזוקקים, אך הם עשויים לדרוש יישום מחדש במהלך ההדמיה.
  10. כדי למצוא את העומק האופטימלי להדמיה, ראשית, אתרו את הרשת והניחו אותה בפוקוס.
  11. קבע את עומק הדמיית הרקמה המשוער על-ידי הגדרת החלק התחתון של הרשת ל- 0. מידע זה נחוץ כדי לאתר את מישור z המתאים במפגשי ההדמיה הבאים.
  12. כדי לזהות את אותו מיקום במשך מספר הפעלות הדמיה, השתמש בריבועים שעל הרשת כנקודת ייחוס. במהלך ההדמיה, שים לב לכיוון הרשת ולמיקום בתוך הרשת של כל שדה ראייה שצולם (לדוגמה, שורה 2 מלמעלה, ריבוע 4 משמאל).
  13. במהלך הפעלות הדמיה עוקבות, השתמש ברשת כדי לנווט בחזרה לאזורי רשת ספציפיים - וכך לשדות הדמיה.
  14. לאחר כל סשן הדמיה, יש להסיר את כל מדיום הטבילה והפסולת של העדשה השיורית על ידי ניגוב עדין של החלון באמצעות ספוגית צמר גפן טבולה ב-70% אתנול (v/v).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-ורידית דרך חלונות הדמיה כדי לצפות, לעקוב ולכמת מגוון רחב של אירועים תאיים ומולקולריים ברזולוציה של תא יחיד במשך תקופה של שעות עד שבועות. תכונות אידיאליות לחלון הדמיה כוללות: א) השפעה מוגבלת על רווחתו של העכבר ועל הפיזיולוגיה של הרקמה; ב) עמידות; ג) פשטות ההכנסה; ו-ד) ציוני דרך ברורים להדמיה חוזרת ונשנית של אותו אזור. התוצאה היא חלון סיליקון רב-תכליתי, אינרטי, המיוצר ומוכנס בקלות וניתן לצייד אותו ברשת כדי לאתר את אותו שדה ראייה לאורך מספר מפגשי הדמיה.

החלון עשוי PDMS, שהו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חלונות הדמיה תוך-ורידיים הם כלים חשובים להדמיה ישירה של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית כשהם מתפתחים לאורך זמן. ההליך החדשני המתואר ליציקה והכנסת חלונות הדמיה גמישים מסיליקון בעכברים מתגבר על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום (הפרשה, שבירה והפרעה לניידות רגילה), מספק בטיחות נוספת לעכבר ומגביר את הנגישות של טכניקה זו.

חלונות ההדמיה הנפוצים ביותר כוללים מסגרת מתכת המחזיקה כיסוי זכוכית. מכשול מרכזי לשימוש בחלונות אב-טיפוס אלה הוא שאבטחת טבעת המתכת כרוכה ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

M.E. הוא חבר במועצה המייעצת למחקר עבור brensocatib עבור Insmed, Inc.; חבר במועצה המדעית המייעצת של Vividion Therapeutics, Inc.; יועץ עבור Protalix, Inc.; ומחזיקה במניות באגיוס פרמצבטיקה בע"מ. D.A.T. היא מייסדת שותפה של Mestag Therapeutics, והיא חברה במועצה המדעית המייעצת ומחזיקה במניות ב- Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology ו- Cygnal Therapeutics. המחברים האחרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים לרוב אייפרט על עזרתו בתכנון ואופטימיזציה של רשתות הנירוסטה שנחתכו בלייזר. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז הסרטן CSHL (P30-CA045508) וכספים עבור M.E. מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (1R01CA2374135 ו- 5P01CA013106-49); CSHL ונורת'וול בריאות; קרן משפחת תומפסון; לשחות ברחבי אמריקה; ומענק מקרן סימונס ל-CSHL. M.S. נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תוכנית הכשרה למדעים רפואיים (T32-GM008444) והמכון הלאומי לסרטן של NIH תחת פרס מספר 1F30CA253993-01. L.M. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של קרן ג'יימס ס. מקדונל. J.M.A. הוא חתן מלגת מכון לחקר הסרטן/מלגת אירווינגטון פוסט-דוקטורט (פרס CRI #3435). D.A.T. נתמך על ידי המעבדה הייעודית של קרן לוסטגרטן לחקר סרטן הלבלב וקרן משפחת תומפסון. קריקטורות נוצרו עם Biorender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרט כירורגי בד רך 3M Medipore 3Mתפר
4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18 אינץ' RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP עכברימעבדת ג'קסון22974
ערכת מצע AEC, פרוקסידאז (HRP), (3-אמינו-9-אתילקרבזול)מעבדות וקטור SK-4200
ספוגיות אלכוהולBD 
326895 מערכת הרדמהמוצרי הדמיה מולקולרית ושות'
Acqknowledge תוכנה וחיישנים BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
ספריי בטדין LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) עכברימעבדת ג'קסון18549
C57BL/6J עכברימעבדת ג'קסון664
CD45 נוגדן חד שבטי (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 נוגדןAbcamab125212
ספוגי גזה Curity Covidien
חמור נגד עזים IgG H& L (HRP) Abcamab6885
חמור נגד ארנב IgG H& L (HRP) Abcamab97064
חמור נגד חולדות IgG H& L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 סיליקון Encapsulant שקוףאלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences24236-10שני חלקים, יחס ערבוב 10:1
זכוכית כיסוי עגול, קוטר 8 מ"מ, #1.5 עובי מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72296-08
Ender-3 Pro מדפסת תלת מימדשנזן Creality 3D Technology Co., LTD
שמיכה מחוממת אינפרא אדום רחוקקנט סיינטיפיקRT-0520
Fc חוסם קולטניםInnovex BiosciencesNB309
עיבוד הדמיה פיג'י
פלואורוספרות קרבוקסילט, 0.04 ומיקרו; m, צהוב-ירוק (505/515)מערכת שער InvitrogenF8795
BIOPAC Systems Inc.הרכיבים יחד מאפשרים ניטור חיוניים של העכבר במהלך הדמיה ואיסוף תמונות בנשימת העכבר. כולם נרכשו ממערכות BIOPAC.
Acqknowledge תוכנה ACK100W, ACK100M
מודול אמפר, סדרה C DA100C
מערכת שער כפול חיהDTU200 
MP160 עבור Windows - מערכתMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; 015000 
כרית לחץ TSD110 
GelfoamPfizer9031508ספוג ג'לטין נספג
מספריים עדינים מוקשיםFine Science Tools14090-11שני זוגות; נירוסטה, טיפים חדים
, קצה ישר, 26 מ"מ
קצה חיתוך, אורך 11 ס"מ
אדם/עכבר myeloperoxidase/MPO נוגדןR& D SystemsAF3667
מעקר חרוזים חמיםFine Science Tools18000-45הפעל כ<30 דקותbr/> לפני השימוש; עקר כלים בטמפרטורה של >200
° C ל-30 שניות
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
טבילה בינונית Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
מזרקי אינסולין עם BD מחט דקה במיוחד 6 מ"מ x 31G 1 מ"ל/סמ"BD324912
איזופלורן (פלוריסו)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (עגבנייה) לקטין (LEL, TL), DyLight® 594מעבדות וקטור DL-1177-1
LysM-eGFP עכבריםwww.mmrrc.org012039-MU
מלקחיים מיקרו ניתוחיםRobozRS-5135משונן, עקומה קלה, רוחב קצה 0.8 מ"מ; אורך 4 אינץ'
מיקרו מלקחייםRobozRS-51531 x 2 שיניים, עקומה קלה, 0.8 מ"מ קצה
רוחב, אורך 4 אינץ'
MTS MiniBionix II 808MTS מערכותמכונת בדיקת חומרים סרווהידראולית
Neutrophil Elastase 680 FAST בדיקהPerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
חברת אספקת ריתוך כלליתחמצן
נימה של חומצה פולילקטיתHatchboxקוטר 1.75 מ"מ
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
משחת עיניים PuralubeDechra NDC17033-211-38
קליפס פצע רפלקס 7 RobozSurgicalRS-9255
רשת נירוסטהFotofabרשת אחת בקוטר 0.200 אינץ', עם סך של 52 ריבועי רשת בודדים בגודל 0.016 x 0.016 אינץ'. יש רווח של 0.003 אינץ' בין כל ריבוע.  
צלחות תרבית רקמות סטריליות שטופלו על פני השטחFB012929 מדעי פישרהמשמש כמשטח ריפוי לחלונות הדמיה
TriM Scope Multiphoton Microscope הדמיית LaVision BioTecנעשתה במיקרוסקופ זקוף של 2 פוטונים (Trimscope, LaVision BioTec) המצויד בשני לייזרים Ti:Sapphire (Mai Tai ו-InSight, Spectra-Physics) ומתנד פרמטרי אופטי. מפצלי האלומה הדיכרואיים הבאים (Chroma) שימשו להכוונת האות לעבר ארבעה צינורות פוטו-מכפילים:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
זכוכית מיקרו כיסוי VWRVWR48404-453
משי 70200770819 חבילת https://imagej.net/software/fiji/: קטנה ניתוח ק , מכסה

מקורות

  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיקרוסקופיה אינטרה-ויטליתחלון דימוג סיליקונידימוג לונגיטודיחלון פולידימيثילסילוקסאןדימוג של בלוטות החלבדימוג של איברי הבטןמעקב אחר תאי חיסוןדימוג של תאי סרטןהשתלת חלון כירורגיתויזואליזציה של רקמות
הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.