מאמר שיטה

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

DOI:

10.3791/62757

⸱

5 בינואר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) מאפשרת הדמיה של תנועת תאים, חלוקה ומוות ברזולוציה של תא בודד. IVM דרך חלונות הדמיה שהוכנסו בניתוח הוא חזק במיוחד מכיוון שהוא מאפשר תצפית אורכית של אותה רקמה במשך ימים עד שבועות. חלונות הדמיה טיפוסיים כוללים כיסוי זכוכית במסגרת מתכת תואמת ביולוגית הנתפרת לעור העכבר. חלונות אלה יכולים להפריע לתנועה החופשית של העכברים, לעורר תגובה דלקתית חזקה, ולהיכשל עקב זכוכית שבורה או תפרים קרועים, שכל אחד מהם עשוי להצריך המתת חסד. כדי להתמודד עם בעיות אלה, פותחו חלונות להדמיה ארוכת טווח של איברי בטן ובלוטות החלב מסרט דק של פולידימתילסילוקסן (PDMS), פולימר סיליקון צלול אופטית ששימש בעבר להדמיית חלונות הדמיה גולגולתיים. חלונות אלה יכולים להיות מודבקים ישירות לרקמות, ובכך להפחית את הזמן הדרוש להחדרה. PDMS הוא גמיש, ותורם לעמידותו בעכברים לאורך זמן – עד 35 יום נבדקו. הדמיה אורכית היא הדמיה של אותו אזור רקמה במהלך מפגשים נפרדים. רשת נירוסטה הוטמעה בתוך החלונות כדי למקם את אותו אזור, מה שאפשר הדמיה של תהליכים דינמיים (כמו אינבולוציה של בלוטת החלב) באותם מקומות, בהפרש של ימים ספורים זה מזה. חלון סיליקון זה איפשר גם ניטור של תאים סרטניים בעלי תפוצה יחידה המתפתחים למיקרו-גרורות לאורך זמן. חלונות הסיליקון ששימשו במחקר זה פשוטים יותר להחדרה מאשר חלונות זכוכית ממוסגרים במתכת וגורמים לדלקת מוגבלת של הרקמות המצולמות. יתר על כן, רשתות משובצות מאפשרות מעקב פשוט אחר אותו אזור רקמה במפגשי הדמיה חוזרים ונשנים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM), הדמיה של רקמות בבעלי חיים מורדמים, מציעה תובנות על הדינמיקה של אירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית ברקמות שלמות. היישומים של טכניקה זו משתנים מאוד, אך IVM סייע בתחום הביולוגיה של הסרטן כדי לעזור להבהיר כיצד תאים סרטניים פולשים לרקמות וגרורות, מתקשרים עם המיקרו-סביבה שמסביב ומגיבים לתרופות 1,2,3. בנוסף, IVM היה המפתח לקידום ההבנה של המנגנונים המורכבים השולטים בתגובות החיסוניות על ידי מתן תובנות המשלימות לגישות פרופיל ex vivo (למשל, ציטומטריה של זרימה). לדוגמה, ניסויי הדמיה תוך-ורידיים חשפו פרטים על תפקודי מערכת החיסון בכל הקשור ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים שתוארו בוצעו בהתאם להנחיות הכירורגיות של מעבדת קולד ספרינג הארבור ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדת קולד ספרינג הארבור.

1. יציקת חלון הסיליקון

  1. הכן את פולימר הסיליקון (PDMS) על ידי ערבוב האלסטומר הבסיסי וחומר הריפוי ביחס של 10:1 (v/v).
  2. יציקו חלון על ידי הפקדת כמות קטנה של PDMS על משטח סטרילי וחלק והתאימו את יחס הנפח לאזור לעובי הרצוי.
    הערה: שימוש בתמיסת פולימר של 200 מ"ג עבור עיגול בקוטר 22 מ"מ על מכסה של מכסה של 24 לוחות היטב מביא לפשרה טובה בין עמידות החלון לבהירות אופטית.
  3. אופציונלי: כדי לספק ציוני דרך להדמיה חוזרת ונשנית של אותם אזורי רקמה, לחץ קלות ע....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-ורידית דרך חלונות הדמיה כדי לצפות, לעקוב ולכמת מגוון רחב של אירועים תאיים ומולקולריים ברזולוציה של תא יחיד במשך תקופה של שעות עד שבועות. תכונות אידיאליות לחלון הדמיה כוללות: א) השפעה מוגבלת על רווחתו של העכבר ועל הפיזיולוגיה של הרקמה; ב) עמידות; ג) פשטות ההכנסה; ו-ד) ציוני דרך ברורים להדמיה חוזרת ונשנית של אותו אזור. התוצאה היא חלון סיליקון רב-תכליתי, אינרטי, המיוצר ומוכנס בקלות וניתן לצייד אותו ברשת כדי לאתר את אותו שדה ראייה לאורך מספר מפגשי הדמיה.

החלון עשוי PDMS, שהו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלונות הדמיה תוך-ורידיים הם כלים חשובים להדמיה ישירה של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים ברזולוציה תאית כשהם מתפתחים לאורך זמן. ההליך החדשני המתואר ליציקה והכנסת חלונות הדמיה גמישים מסיליקון בעכברים מתגבר על כמה מהבעיות הנפוצות ביותר עם חלונות הדמיה הנמצאים בשימוש כיום (הפרשה, שבירה והפרעה לניידות רגילה), מספק בטיחות נוספת לעכבר ומגביר את הנגישות של טכניקה זו.

חלונות ההדמיה הנפוצים ביותר כוללים מסגרת מתכת המחזיקה כיסוי זכוכית. מכשול מרכזי לשימוש בחלונות אב-טיפוס אלה הוא שאבטחת טבעת המתכת כרוכה ב.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E. הוא חבר במועצה המייעצת למחקר עבור brensocatib עבור Insmed, Inc.; חבר במועצה המדעית המייעצת של Vividion Therapeutics, Inc.; יועץ עבור Protalix, Inc.; ומחזיקה במניות באגיוס פרמצבטיקה בע"מ. D.A.T. היא מייסדת שותפה של Mestag Therapeutics, והיא חברה במועצה המדעית המייעצת ומחזיקה במניות ב- Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology ו- Cygnal Therapeutics. המחברים האחרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לרוב אייפרט על עזרתו בתכנון ואופטימיזציה של רשתות הנירוסטה שנחתכו בלייזר. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז הסרטן CSHL (P30-CA045508) וכספים עבור M.E. מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (1R01CA2374135 ו- 5P01CA013106-49); CSHL ונורת'וול בריאות; קרן משפחת תומפסון; לשחות ברחבי אמריקה; ומענק מקרן סימונס ל-CSHL. M.S. נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תוכנית הכשרה למדעים רפואיים (T32-GM008444) והמכון הלאומי לסרטן של NIH תחת פרס מספר 1F30CA253993-01. L.M. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של קרן ג'יימס ס. מקדונל. J.M.A. הוא חתן מלגת מכון לחקר הסרטן/מלגת אירווינגטון פוסט-דוקטורט (פרס CRI #3435). D.A.T. נתמך על ידי המעבדה הייעודית של קרן לוסטגרטן לחקר סרטן הלבלב וקרן ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרט כירורגי בד רך 3M Medipore 3Mתפר
4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18 אינץ' RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP עכברימעבדת ג'קסון22974
ערכת מצע AEC, פרוקסידאז (HRP), (3-אמינו-9-אתילקרבזול)מעבדות וקטור SK-4200
ספוגיות אלכוהולBD 
326895 מערכת הרדמהמוצרי הדמיה מולקולרית ושות'
Acqknowledge תוכנה וחיישנים BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
ספריי בטדין LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) עכברימעבדת ג'קסון18549
C57BL/6J עכברימעבדת ג'קסון664
CD45 נוגדן חד שבטי (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 נוגדןAbcamab125212
ספוגי גזה Curity Covidien
חמור נגד עזים IgG H& L (HRP) Abcamab6885
חמור נגד ארנב IgG H& L (HRP) Abcamab97064
חמור נגד חולדות IgG H& L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 סיליקון Encapsulant שקוףאלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences24236-10שני חלקים, יחס ערבוב 10:1
זכוכית כיסוי עגול, קוטר 8 מ"מ, #1.5 עובי מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72296-08
Ender-3 Pro מדפסת תלת מימדשנזן Creality 3D Technology Co., LTD
שמיכה מחוממת אינפרא אדום רחוקקנט סיינטיפיקRT-0520
Fc חוסם קולטניםInnovex BiosciencesNB309
עיבוד הדמיה פיג'י
פלואורוספרות קרבוקסילט, 0.04 ומיקרו; m, צהוב-ירוק (505/515)מערכת שער InvitrogenF8795
BIOPAC Systems Inc.הרכיבים יחד מאפשרים ניטור חיוניים של העכבר במהלך הדמיה ואיסוף תמונות בנשימת העכבר. כולם נרכשו ממערכות BIOPAC.
Acqknowledge תוכנה ACK100W, ACK100M
מודול אמפר, סדרה C DA100C
מערכת שער כפול חיהDTU200 
MP160 עבור Windows - מערכתMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; 015000 
כרית לחץ TSD110 
GelfoamPfizer9031508ספוג ג'לטין נספג
מספריים עדינים מוקשיםFine Science Tools14090-11שני זוגות; נירוסטה, טיפים חדים
, קצה ישר, 26 מ"מ
קצה חיתוך, אורך 11 ס"מ
אדם/עכבר myeloperoxidase/MPO נוגדןR& D SystemsAF3667
מעקר חרוזים חמיםFine Science Tools18000-45הפעל כ<30 דקותbr/> לפני השימוש; עקר כלים בטמפרטורה של >200
° C ל-30 שניות
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
טבילה בינונית Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
מזרקי אינסולין עם BD מחט דקה במיוחד 6 מ"מ x 31G 1 מ"ל/סמ"BD324912
איזופלורן (פלוריסו)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (עגבנייה) לקטין (LEL, TL), DyLight® 594מעבדות וקטור DL-1177-1
LysM-eGFP עכבריםwww.mmrrc.org012039-MU
מלקחיים מיקרו ניתוחיםRobozRS-5135משונן, עקומה קלה, רוחב קצה 0.8 מ"מ; אורך 4 אינץ'
מיקרו מלקחייםRobozRS-51531 x 2 שיניים, עקומה קלה, 0.8 מ"מ קצה
רוחב, אורך 4 אינץ'
MTS MiniBionix II 808MTS מערכותמכונת בדיקת חומרים סרווהידראולית
Neutrophil Elastase 680 FAST בדיקהPerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
חברת אספקת ריתוך כלליתחמצן
נימה של חומצה פולילקטיתHatchboxקוטר 1.75 מ"מ
ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
משחת עיניים PuralubeDechra NDC17033-211-38
קליפס פצע רפלקס 7 RobozSurgicalRS-9255
רשת נירוסטהFotofabרשת אחת בקוטר 0.200 אינץ', עם סך של 52 ריבועי רשת בודדים בגודל 0.016 x 0.016 אינץ'. יש רווח של 0.003 אינץ' בין כל ריבוע.  
צלחות תרבית רקמות סטריליות שטופלו על פני השטחFB012929 מדעי פישרהמשמש כמשטח ריפוי לחלונות הדמיה
TriM Scope Multiphoton Microscope הדמיית LaVision BioTecנעשתה במיקרוסקופ זקוף של 2 פוטונים (Trimscope, LaVision BioTec) המצויד בשני לייזרים Ti:Sapphire (Mai Tai ו-InSight, Spectra-Physics) ומתנד פרמטרי אופטי. מפצלי האלומה הדיכרואיים הבאים (Chroma) שימשו להכוונת האות לעבר ארבעה צינורות פוטו-מכפילים:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
זכוכית מיקרו כיסוי VWRVWR48404-453
משי 70200770819 חבילת https://imagej.net/software/fiji/: קטנה ניתוח ק , מכסה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים