מאמר שיטה

פיתוח מודל של תרבות משותפת של תאים כדי לחקות איסכמיה לב/רפרטפוזיה במבחנה במבחנה

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62913

⸱

13 באוקטובר 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

במאמר זה

סיכום

מרחק מרחבי הוא פרמטר מרכזי בהערכת פגיעה היפוקסיה/ראוקסיגניה במודל של תרבות משותפת של שכבות תאי אנדותל וקרדיומיוציטים נפרדות, מה שמרמז, לראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של תאי אנדותל בהגנה על קרדיומיוציטים.

תקציר

מחלת לב איסכמית היא הגורם המוביל למוות ולמוגבלות ברחבי העולם. רפרטפוזיה גורמת לפציעה נוספת מעבר לאיסכמיה. תאי אנדותל (ECs) יכולים להגן על קרדיומיוציטים (CMs) מפני פגיעה ברפרטוזיה באמצעות אינטראקציות בין תאים לתאים. תרבויות משותפות יכולות לעזור לחקור את התפקיד של אינטראקציות בין תאים לתאים. תרבות משותפת מעורבת היא הגישה הפשוטה ביותר, אך מוגבלת מכיוון שטיפולים מבודדים וניתוחים במורד הזרם של סוגי תאים בודדים אינם אפשריים. כדי לחקור אם ECs יכול למנות תלוי מינון להחליש נזק לתאי CM והאם הגנה זו יכולה להיות ממוטבת עוד יותר על ידי שינוי מרחק המגע בין שני קווי התאים, השתמשנו בתאי אנדותל עורק הכלילי הראשי של העכבר הראשי ובקרדיומיוציטים של עכבר בוגר כדי לבדוק שלושה סוגים של תוספות תרבית תאים שהשתנו במרחק השכבה הבין-תאית שלהם ב- 0.5, 1.0, ו 2.0 מ"מ, בהתאמה. ב- CMs בלבד, פגיעה תאית כפי שהוערכה על ידי שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH) גדלה באופן משמעותי במהלך היפוקסיה ובהמשך על reoxygenation כאשר המרחק היה 2.0 מ"מ לעומת 0.5 ו 1.0 מ"מ. כאשר ECs וCMs היו במגע כמעט ישיר (0.5 מ"מ), היה רק החלקה קלה של פגיעה reoxygenation של CMs בעקבות היפוקסיה. הנחתה זו הוגדלה באופן משמעותי כאשר המרחק המרחבי היה 1.0 מ"מ. עם מרחק של 2.0 מ"מ, ECs החלישו פגיעת CM במהלך היפוקסיה והיפוקסיה / reoxygenation, המציין כי התרחקות תרבותית מספקת נחוצה עבור ECs כדי להצליב עם CMs, כך מולקולות אות מופרש יכול להסתובב ולעורר באופן מלא מסלולי הגנה. הממצאים שלנו מראים, בפעם הראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת EC / CM נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של ECs בהגנה CM מפני איסכמיה מדומה / פגיעה reperfusion. מטרתו של דו"ח זה היא לספק גישה צעד אחר צעד לחוקרים להשתמש במודל חשוב זה לטובתם.

מבוא

מחלת לב איסכמית היא הגורם המוביל למוות ונכות ברחבי העולם 1,2. עם זאת, תהליך הטיפול של רפרטפוזיה יכול עצמו לגרום למוות cardiomyocyte, המכונה איסכמיה שריר הלב / רפרטפוזיה (IR) פגיעה, אשר עדיין אין תרופה יעילה3. תאי אנדותל (ECs) הוצעו להגן על cardiomyocytes (CMs) באמצעות הפרשת אותות paracrine, כמו גם אינטראקציות תא לתא4.

מודלים של תרבות משותפת של תאים שימשו בהרחבה כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות אוטוקרין ו/או פראקרין תא-תא על תפקוד התא וההבחנה. בין מודלים של תרבות משותפת, תרבות משותפת מעורבת היא הפשוטה ביותר, שבה שני סוגים שונים של תאי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה/ציפוי ניסיוני

  1. שמור על CMs ו- ECs בהתאם להוראות היצרן.
    1. להפשיר את שני קווי התא כאשר הם מגיעים מספקים. צלחת בבקבוקונים T25 לאחר שטף עם מדיה טרייה. מומלץ לרכוש כל מדיה של תרבית תאים מאותם ספקים שמהם נרכשו התאים. למחרת, רענן את התאים עם מדיה והשתמש כאשר הם נפגשים.
    2. לשמור על אינקובטור תרבית התא ב 37 °C (37 °F) עם 21% O2, 5% CO2, 74% N2 ולשמור אותו לח.
      הערה: תאי אנדותל העורק הכליליים העיקריים המשמשים בפרוטוקול זה מבודדים מעורקים כלילית של עכברי C57BL/6, וקרדיומיוציטים של עכברים בוגרים מבודדים מלבבות עכבר C57BL/ 6J בוגרים ומתקבלים באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כל שלושת סוגי התוספות (A, B, C) המשמשים בניסוי זה הם בעלי גודל נקבוביות זהה של 0.4 מיקרומטר. ההבדל היחיד ביניהם הוא גובה ההוספה לבסיס, המאפשר למרחקים בין שתי שכבות התאים בתרבית משותפת להיות 0.5, 1.0 ו-2.0 מ"מ, בהתאמה, (איור 3) ושהם מספקים שונים (לפרטים ראו טבלת חומרים).

כדי ליצור מודל של תרבות משותפת במבחנה עם שכבות נפרדות של שני קווי תאים העוברים משאבי אנוש כדי לדמות פגיעה ב- IR, בדקנו את שלמות קרום התא של CMs בתרבית משותפת עם או בלי ECs.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול
מודלים של תרבות משותפת של תאים שימשו לחקר מנגנונים תאיים של cardioprotection. כיצד ליצור שתי שכבות נפרדות עם מרחק משמעותי ביניהן הוא, אם כן, חיוני לפיתוח מודל תרבות משותפת מתאים. אתגר בחקר IR מדומה, כלומר, משאבי אנוש, פגיעה הוא כי לא רק איסכמיה (היפוקסיה) עצמה, אלא גם רפרפוזיה (reoxygenation) מחמיר תפקוד תאי. לכן, מודל מציאותי צריך לשקף מאפיינים אלה על ידי, למשל, הפגנת פגיעה מוגברת מספיק על ידי reoxygenation בעקבות היפוקסיה לעומת היפוקסיה לבד, אבל עדיין מאפשר הנחתה של פגיעה עם .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה, בין היתר, על ידי המחלקה האמריקאית לענייני יוצאי צבא שירות מו"פ מעבדה ביו-רפואית (I01 BX003482) ועל ידי קרנות מוסדיות ל- M.L.R.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים (CMs)Celprogen Inc11041-14מבודד מרקמת לב של עכבר C57BL/6J בוגר
מונה תאים אוטומטי Countess IIInvitrogenA27977ספירת תאים לחישוב מספרי תאים
ארון בטיחות ביולוגיתNuaireNU425400תרבית תאים מכסה מנוע סטרילי
תרבית תאים הקפאתתאים בינוניים ביולוגיים בע"מ6916משמש להקפאת תאים לאחסון קו תאים לטווח ארוך
חממת תרבית תאיםNuaireNu-5500כדי לספק תנאי חיים תקינים של תאים (21%O2, 5% CO2, 74%N2, 37° C, לח
חממת תרבית תאים מיכל גזAGL גזים דחוסיםUN1013גז הדרוש לחממת תרבית תאים 
מוסיף תרבית תאים A (0.5 מ"מ)Corning Inc353095משמש לתרבית משותפת EC-CM
מוסיף תרבית תאים B (1.0 מ"מ)Millicell MilliporePIHP01250משמש לתרבית משותפת EC-CM
מוסיף תרבית תאים C (2.0 מ"מ)Greiner Bio-One662640משמש לצנטריפוגה EC-CM קו-קולקציה
Anstel Enterprises Inc4235לציפוי ומעבר תרבית תאים
צלוחיות תרבית תאים CMs T25Celprogen IncE11041-14משמש לתרבית רגילה של CMs, מצופה על ידי היצרן
CMs תרבית תאים בינונית שלמהCelprogen IncM11041-14Sתרבית CMs מדיום שלם
CMs תרבית תאים בינונית שלמה ללא פנולCelprogen IncM11041-14PNמדיום תרבית CMs ללא פנול אדום בשימוש במהלך מדידת LDH
CMs צלחות תרבית תאים 96 ובכןCelprogen IncE11041-14-96wellמשמש לניסויים של מדידת LDH, מצופה על ידי היצרן
CMs תרבית תאי היפוקסיה בינוניCelprogen IncM11041-14GFPNCMs תרבית תאים במצב היפוקסי (ללא גלוקוז וסרום)
שקופיות תא ספירת תאיםשל רוזנת InvitrogenC10283שקופיות ספירת המשמשות לערכת
ציטוטוקסיות LDHתרמו סיינטיפיק C20301ערכת מדידת LDH
ECs צלוחיות תרבית תאים T25פישר סיינטיפיק FB012935משמש לתרבית רגילה
ECs תרבית תאים בינונית שלמהתאים ביולוגיים בע"מM1168תרבית ECs מדיום שלם
ECs תרבית תאים בינונית שלמה ללא פנולתאים ביולוגיים בע"מM1168PFמדיום תרבית ECs ללא פנול אדום בשימוש במהלך מדידת LDH
ECs צלחות תרבית תאים 96 בארפישר סיינטיפיק (קוסטאר)3370משמש לניסויים של LDH מדידה
ECs תרבית תמיסת ציפוי מבוססת ג'לטיןCell Biologics Inc6950משמשת לציפוי צלוחיות וצלחות עבור ECs
ECs תרבית תאי היפוקסיה MediumCell Biologics IncGPF1168ECs תרבית תאים בתנאים היפוקסיים (ללא גלוקוז וסרום)
סרום בקר עוברי (FBS)Fisher ScientificMT35011CVFBS-HI USDA מאושר לתרבית תאים ותחזוקה
HypoxiaChamber StemCell Technologies27310ליצירת מצב היפוקסי עם סביבה של 0.01% O2
מד זרימה של תא היפוקסיהStemCell Technologies27311לחיבור עם מיכל גז היפוקסי למהירות זרימת גז עקבית
מיכל גז היפוקסי (0.01% O2 צילינדר)AG גזים דחוסיםUN1956משמש לשטיפת תווך ותא היפוקסיים (0.01%O2/5% CO2/94.99N2)
מיקרוסקופ NikonTMSלצפייה במצב התא
תאי אנדותל עורק כלילי ראשוני של עכבר (ECs)Cell Biologics IncC57-6093מבודד מעורק כלילי של עכברי C57BL/6
NUNC 15ML CONICL TubesFisher Scientific12565269לתהליך תרבית תאים, ניסויים, הכנת תמיסה וכו'.
NUNC 50 מ"ל צינורות CONICLפישר סיינטיפיק12565271לתהליך תרבית תאים, ניסויים, הכנת תמיסה וכו'.
מלח פוספט חוצץ (PBS)Sigma-AldrichD8662משמש לשטיפת תאים במהלך תרבית או ניסויים
קורא צלחותBioTek Instrument11120533קריאת צלחות קולורימטרית או פלואורומטרית
תגובה 96 Well Palte (שקוף ללא מכסה)Fisher Scientific12565226משמש לקריאת לוחות מדידת LDH
Trypsin/EDTA עבור CMsCelprogen IncT1509-0141 x מסוננים סטריליים ותרבית רקמות נבדקו
Trypsin/EDTA עבור ECsCell Biologics Inc6914/06190.25%, נבדק חיתוך תאים
) של מונה תאים

מקורות

  1. Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
  2. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LDHIn Vitro

מאמרים קשורים