מאמר שיטה

כתמים אימונוהיסטוכימיים פלואורסצנטיים מרובים של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון רירית הרחם בהפלה חוזרת ונשנית

DOI:

10.3791/62931

⸱

4 באוגוסט 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, Shenzhen Baoan Women’s and Children’s Hospital, Shenzhen University, 4School of Medicine, Faculty of Medicine and Health Sciences, Keele University, 5Li Ka Shing Institute of Health Sciences; School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות ההתקדמות באימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס והדמיה רב ספקטרלית, אפיון הצפיפות וההקבצות של תאי מערכת החיסון העיקריים בו זמנית באנדומטריום נותר אתגר. מאמר זה מתאר פרוטוקול מכתים מולטיפלקס מפורט והדמיה עבור לוקליזציה בו זמנית של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון באנדומטריום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונוהיסטוכימיה היא השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי והדמיה של אנטיגנים רקמה במחקר ביולוגי ואבחון קליני. זה יכול לשמש כדי לאפיין תהליכים ביולוגיים שונים או פתולוגיות, כגון ריפוי פצעים, תגובה חיסונית, דחיית רקמות, ואינטראקציות רקמות-biomaterial. עם זאת, ההדמיה וכימות של אנטיגנים מרובים (במיוחד עבור תאי מערכת החיסון) בסעיף רקמה אחת באמצעות כתמים אימונוהיסטוכימיים קונבנציונליים (IHC) נותר לא משביע רצון. לפיכך, טכנולוגיות מולטיפלקס הוצגו בשנים האחרונות כדי לזהות סמנים ביולוגיים מרובים בדגימת רקמה אחת או הרכב של דגימות רקמות שונות.

טכנולוגיות אלה יכולות להיות שימושיות במיוחד בהבחנה בין השינויים באינטראקציות בין תאים בתוך רירית הרחם בין נשים פוריות ונשים עם הפלות חוזרות ונשנות במהלך ההשתלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להכתמת IHC פלואורסצנטיות מרובת-קסים כדי לחקור את הצפיפות וההקבצות של ארבעה סוגי תאי חיסון עיקריים בו זמנית בדגימות רירית הרחם המתוזמנות במדויק במהלך השתלת העובר. השיטה כוללת הכנת מדגם, אופטימיזציה מולטיפלקס עם סמנים עבור תת-סוגים של תאי מערכת החיסון, ואת הסריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים, עם התייחסות ספציפית לזיהוי תאי מערכת החיסון רירית הרחם.

בשיטה זו, ניתן לנתח בו זמנית את הצפיפות והאשכול של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון העיקריים באנדומטריום בסעיף רקמה אחת. בנוסף, מאמר זה ידון בגורמים הקריטיים ובפתרון בעיות כדי להתגבר על הפרעות פלואורופור אפשריות בין הבדיקות הפלואורסצנטיות המיושמות. חשוב לציין, התוצאות מטכניקת הכתמת מולטיפלקס זו יכולות לסייע בהבנה מעמיקה של האינטראקציה והוויסות האימונולוגיים במהלך השתלת העובר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפלה חוזרת (RM) יכולה להיות מוגדרת כהפסד של שני הריונות או יותר לפני 24 שבועות של הריון1. מצב פוריות תכוף זה משפיע על עד 1% מהזוגות ברחבי העולם2,3. הפתופיזיולוגיה היא רב-גורמית וניתן לחלקה לגורמים עובריים (בעיקר בשל קריוטיפ עוברי חריג) וגורמים מונעים אימהית המשפיעים על רירית הרחם ו/או התפתחות השליה. ביטוי זה יכול לנבוע מפגמים גנטיים הוריים, אנומליות ברחם, מצבים פרותרומבוטיים, גורמים אנדוקרינולוגיים והפרעות אימונולוגיות4.

בשנים האחרונות, תפקוד לקוי של תאי המחולל החיסוני היה מעורב בפתוגנזה של אובדן הריון מוקדם5. זה השראה חקירות רבות לתוך לפרט את האוכלוסיות הספציפיות של תאי מערכת החיסון באנדומטריום במהלך המחזור החודשי, ההשתלה, והריון מוקדם, עם תפקידים ספציפיים בתחילת ההריון. בין תאי מערכת החיסון האלה, תאי הרוצח הטבעי הרחם (uNK) ממלאים תפקיד קריטי במהלך השתלת העובר וההריון, במיוחד בתהליכי פלישה trophoblastic ו אנגיוגנזה6. מחקרים הראו צפיפות תאי uNK מוגברת באנדומטריום של נשים עם RM7,8, אם כי ממצא זה לא היה קשור לסיכון מוגבר להפלה9. עם זאת, מחקר זה עורר הערכת הצפיפות של סוגי תאי חיסון אחרים (כגון מקרופאגים, תאים דנדריטיים ברחם) באנדומטריום אצל נשים עם RM10,11. עם זאת, עדיין לא ברור אם יש שינוי משמעותי בצפיפות תאי החיסון באנדומטריום פרי-השתלה אצל נשים עם RM.

הסבר אפשרי אחד לאי הוודאות הוא שהערכת צפיפות תאי החיסון רירית הרחם עשויה להיות קשה בשל השינויים המהירים באנדומטריום במהלך חלון ההשתלה. במהלך מסגרת הזמן של 24 שעות, שינויים משמעותיים רירית הרחם לשנות את צפיפות תאי החיסון הפרשת ציטוקינים, הצגת מקור של וריאציה בתוצאות אלה12. בנוסף, רוב הדיווחים מסתמכים בעיקר על השימוש בהכתמה של תא יחיד (למשל, שיטות IHC מסורתיות) שלא יכלו לבחון סמנים מרובים באותו מקטע רקמות. למרות ציטומטריית זרימה יכול לשמש לאיתור אוכלוסיות תאים מרובים במדגם אחד, כמויות גדולות של תאים הנדרשים ואת אופטימיזציה זמן רב לעכב את הפופולריות והיעילות של שיטה זו. לפיכך, ההתקדמות האחרונה בהכתמת IHC מולטיפלקס יכולה לפתור בעיה זו על ידי חיסון סמנים מרובים באותה שקופית כדי להעריך פרמטרים מרובים, כולל שושלת תאים ולוקליזציה היסתולוגית של תת-אוכלוסיות חיסוניות בודדות. יתר על כן, טכנולוגיה זו יכולה למקסם את המידע המתקבל במקרה של זמינות רקמות מוגבלת. בסופו של דבר, טכניקה זו יכולה לעזור לברוח את ההבדלים באינטראקציות תאי החיסון באנדומטריום בין נשים פוריות ונשים עם RM.

שתי קבוצות של נשים גויסו מבית החולים הנסיך מוויילס, כולל נשים פוריות (FC) ונשים עם הפלה חוזרת בלתי מוסברת (RM). שליטה פורייה הוגדרה כנשים שלפחות לידה חיה אחת ללא כל היסטוריה של הפלה ספונטנית, ונשות RM הוגדרו כמי שהיו להם היסטוריה של ≥2 הפלות רצופות לפני 20 שבועות ההריון. הנבדקים משתי הקבוצות עמדו בקריטריוני ההכללה הבאים: (א) גיל בין 20 ל -42 שנים, (ב) לא מעשן, (ג) מחזור וסת רגיל (25-35 ימים) ומבנה הרחם הרגיל, (ד) אין שימוש בכל משטר הורמונלי לפחות 3 חודשים לפני הביופסיה רירית הרחם, (ה) ללא הידרוסלפינקס על ידי היסטרו-salpingogram. בנוסף, כל הנבדקים שגויסו היו קריוטיפינג רגיל, אולטרה-סאונד נורמלי 3 ממדים היסטרוזלפינוגרמה, יום 2 הורמון מגרה זקיק < 10 IU / L, פרוגסטרון באמצע luteal > 30 נמול / L, תפקוד בלוטת התריס נורמלי, ונבדק שלילי עבור זאבת נוגדן קרישה ו נוגדני Iticardioliping ו- IgM.

כדי להבין טוב יותר את הבסיס החיסוני של RM, רצוי ביותר לכמת ולמקם בו זמנית את סוגי תאי החיסון העיקריים הקיימים באנדומטריום בזמן ההשתלה. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול כולו מהכנת מדגם, את אופטימיזציית מולטיפלקס עם סמנים עבור תת-סוגים של תאי מערכת החיסון, ואת הסריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים עם התייחסות ספציפית לזיהוי תאי מערכת החיסון רירית הרחם. יתר על כן, מאמר זה מתאר כיצד לקבוע את הצפיפות ואת קיבוץ של סוגי תאי החיסון בו זמנית באנדומטריום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי האוניברסיטה הסינית המשותפת של הונג קונג טריטוריות חדשות מזרח אשכול ועדת האתיקה מחקר קליני. הסכמה מדעת התקבלה מהמשתתפים לפני איסוף הביופסיות רירית הרחם. עיין במקטע המבוא עבור קריטריוני הכללה של קבוצות הפקד וה- RM.

1. הכנת מדגם

  1. ודא כי כל הנשים במחקר זה לעבור בדיקת dipstick שתן יומית מהיום 9 של המחזור החודשי ואילך כדי לזהות את ההורמון מחלמן (LH) נחשול לזהות ביוץ, וזמן ביופסיות רירית הרחם בדיוקביום 7 לאחר נחשול LH (LH +7).
  2. השג שבר 0.5 ס"מ2 של ביופסיה רירית הרחם באמצעות סמפלר פיפל או פיפט קורט מנשים ונשים פוריות עם RM בלתי מוסבר. סמן את המיכל והניח את הדגימה מיד בפורמלין ניטרלי של 10% חוצץ נייטרלי (pH 7) לקיבעון לילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: נפח הקיבעון צריך להיות פי 5-10 מזה של הרקמה.
  3. מניחים את הרקמה במחסנית להתייבשות במכונת עיבוד רקמות לפני הטמעתה בשעווה פרפין מותכת. הטמע את הרקמות בפרפין ב 58-60 °C (58 °F).
  4. אפשר לבלוק הפרפין להתקרר בלילה בטמפרטורת החדר. השתמש microtome כדי לקצץ את בלוקים פרפין לעובי של 3 מיקרומטר.
    הערה: השימוש במים מזוקקים מסייע בהרכבה נכונה של רקמות ודבקות לאורך כתמי מולטיפלקס.
  5. מניחים את סרט הפרפין באמבט מים ב 40-45 מעלות צלזיוס במשך 30 מעלות צלזיוס.
  6. התקן את המקטעים על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ מצופות פולי-L-0.1% עם ציפוי. מניחים את השקופיות עם הרקמה הפונה כלפי מעלה ומאפשרים להתייבש ב 37 °C (50 °F) לילה. אחסן את השקופיות בתיבת שקופיות הרחק מטמפרטורות קיצוניות עד לשימוש נוסף.

2. לקבוע את הריכוז האידיאלי של נוגדנים עבור IHC מולטיפלקס באמצעות IHC קונבנציונאלי.

הערה: זה חשוב לזיהוי רמת הביטוי ואת התבנית של כל סמן חיסוני במדגם רירית הרחם, ולקבוע את רצף הכתמים של כל סמן, כמו גם את זיווגי פלואורופור אות טיירמיד הקשורים שלהם."

  1. בדוק את הנוגדנים להתאמתם ל- IHC מולטיפלקס באמצעות IHC קונבנציונלי ידני13.
  2. השתמש ברקמות רירית הרחם לבדיקת נוגדנים בודדים.
  3. כלול שליטה חיובית (למשל, טחול) ושליטה שלילית (בקרת איזוטיפ) למיטוב מצב הכתמים של כל נוגדן.
  4. בצע את הכתמים באמצעות הדילול המומלץ על-ידי גליון הנתונים של הנוגדן.
  5. בצע כתמים נוספים באמצעות ריכוזים מעל ומתחת לדילול המומלץ המשמש בשלב 2.3.
    הערה: פתולוג קליני צריך להעריך את השקופיות המוכתמות בעיוורון כדי לאשר את לוקליזציה של בדיקת הנוגדנים ואת שלמות התא.

3. שיטת הכתמת מולטיפלקס

  1. הכנת שקופיות קיבוע
    1. מניחים את השקופיות (בשלב 1.6) שטוחות עם הרקמה הפונה כלפי מעלה בתנור ואופים ב 60 °C לפחות 1 שעה.
    2. מוציאים את השקופיות מהתנור ומאפשרים להן להתקרר לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שמניחים אותן בארון שקופיות אנכי.
    3. Dewax rehydrate המגלשות הפורמלין קבוע, פרפין מוטבע עם 10 דקות שהוקצו לכל אחד מהצעדים הבאים: קסילן (2x), 100% אתנול (2x), 95% אתנול (1x), 70% אתנול (2x), ומים מזוקקים (2x).
    4. מקם את מדף השקופיות בקופסת שקופיות מפלסטיק והטביע אותן בתמיסת מלח עם חציית טריס (TBS, pH 7.6).
      הערה: השקופיות חייבות להישאר לחות החל בשלב התייבשות זה ועד להרכבה בשלב הסופי.
    5. תקן את הדגימות על ידי טביעת השקופיות בקופסת שקופיות פלסטיק מלאה בתערובת של פורמלדהיד מדולל במתנול (1:9) במשך 30 דקות בחושך.
    6. לשטוף את המגלשות פעמיים במים deionized במשך 2 דקות ולאחר מכן להמשיך לאחזור אנטיגן.
  2. אחזור אפיטופה
    1. מניחים את מתלה השקופיות בקופסה עמידה בחום וממלאים אותו במאגר חומצת לימון (pH 6.0) כדי לכסות את השקופיות.
    2. מניחים את הקופסה במיקרוגל, ומחממים את השקופיות במשך 50 s ב 100% כוח ואחריו 20 דקות ב 20% כוח כדי לשמור על אותה טמפרטורה.
    3. אפשר לשקופיות להתקרר כ-15 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. לשטוף את המגלשות במים במשך 2 דקות ואחריו TBS-Tween 20 (TBST) במשך 2 דקות.
      הערה: TBST מורכב 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, ו 0.05% Tween 20 (v/v).
  3. חסימת
    1. לחסום פעילות peroxidase אנדוגני ברקמה על ידי טבילת השקופית על צנצנת המכילה פתרון חסימת peroxidase (ראה טבלת החומרים) במשך 10 דקות.
    2. לשטוף את השקופיות עם TBST במשך 5 דקות.
    3. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לסמן גבול סביב קטע הרקמה בשקופית.
    4. לכסות את מקטעי הרקמה עם חוצץ חסימה (ראה טבלה של חומרים) או אלבומין סרום בקר (5%, w / v), ודגרה את השקופיות בתא לח במשך 15 דקות.
  4. יישום נוגדנים ואות
    1. הסר את ריאגנטים חוסמים.
    2. דגירה עם הנוגדן העיקרי של עניין (למשל, CD3, 1:100 דילול בדלל נוגדנים, ראה טבלה 1) בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    3. הסר את הנוגדן העיקרי. לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות בכל פעם.
    4. דגירה עם פרוקסידאז חזרת פולימר (HRP) שכותרתו נוגדן משני(טבלה 1)במשך 15 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר. לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות בכל פעם.
    5. החל את פתרון העבודה TSA פלואורופור אופל (1:100 בדלל הגברה) ודגר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר הטיות פלואורופור לדגימת הרקמה באתרי כריכת הנוגדנים העיקריים. לשטוף עם TBST משולש במשך 5 דקות בכל פעם.
  5. הפשטה מבוססת מיקרוגל
    1. יש לשטוף עם מאגר אחזור האנטיגן (פתרון מאגר ציטוטים, pH 6.0).
    2. בצע הפשטה מבוססת מיקרוגל כדי להסיר את קומפלקס HRP הראשי-משני כדי להציג את הנוגדן הראשי הבא (למשל, CD20).
    3. מניחים את השקופיות במאגר אחזור אנטיגן, מחממים אותן במיקרוגל ב-100% חשמל למשך 50 s ואחריהן 20% חשמל למשך 20 דקות במיכלים בטוחים למיקרוגל, ומצננים אותן בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    4. חזור על שלבים 3.2.4 עד 3.5.2 עד שדגימות הרקמה נבדקו עם כל הנוגדנים העיקריים.
  6. הפעלה נגדית והרכבה
    1. לאחר הפשטה וקירור מבוססי מיקרוגל של מאגר אחזור האנטיגן, יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים וב-TBST.
    2. דגירה עם פתרון 4', 6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) (1.0 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 5 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות בכל פעם. לשטוף עם מים פעם אחת במשך 5 דקות.
    4. יבש את המגלשה והרכב עם מדיום ההרכבה המתאים (ראה טבלת החומרים).
      הערה: לא תידרש סטייה נגדית כדי שישמשו לפיתוח ספריה ספקטרלית.

4. תמונה וניתוח

  1. הכנת שקופיות ספרייה ספקטרליות
    1. צור שקופיות ספריה (תמונות ייחוס של כתם יחיד) עבור כל פלואורופור, DAPI ופלואורסצנטיות אוטומטית עם אותה רקמת בקרה לניתוח תמונה רב-ספקטרלית.
    2. באמצעות השקופיות של דגימות ביופסיה רירית הרחם מנשים עם RM ונשים פוריות, לבצע שלבים 1.1 עד 3.6.4 לגילוי נוגדנים בודדים עבור כל שקופית (ללא תוספת נוגדן או פלואורופור נוספת).
    3. עבור כל זיהוי נוגדנים, הכתים את אחת השקופיות ב- DAPI (כמו בשלב 3.6.2) והותיר שקופית אחת לא מוכתמת לאיתור פלואורסצנטיות אוטומטית אפשרית של רקמות בספקטרום.
    4. השתמש במסננים המתאימים בתחנת העבודה כדי להשיג את התמונה עבור קבוצה זו של שקופיות עבור כל נוגדן ולהעלות אותם לספריית ניתוח התמונות (כמתואר בשלב 4.2).
    5. לאחר לכידת התמונה, בחר ב- inForm כמקור הספריה הספקטרלי ובנה את הספריה הספקטרלית.
    6. כמו פלואורופורים משמשים, בחר כתמים / פלואורים ... מהתפריט.
    7. בעת בחירת הכתמים או הפלורופורים, צמצם את האפשרויות על-ידי בחירת קבוצה אחת או יותר. בחר הכל כדי להציג את כל הספקטרום התואם לתמונות.
  2. הדמיה ספקטרלית
    הערה: תמונות צולמו באמצעות תחנת העבודה מנטרה עם הספריה הספקטרלית שהוקמה באמצעות התוכנה לניתוח תמונות InForm.
    1. לכוד את התמונה של השקופיות המוכתמות בנוגדן יחיד עם מסנני האפינפילואורסצנטיות המתאימים כפי שהוצע בטבלה 2 (למשל, DAPI, פלואורסין איסותיוצינאט [FITC], CY3, טקסס אדום ו- CY5) באמצעות תחנת העבודה.
      הערה: מסננים מומלצים עבור הפלורופורים הספציפיים המשמשים בפרוטוקול זה מוצגים בטבלה 2.
    2. זהה זמן חשיפה מתאים לאות אופטימלי על ידי בחינת כל סמן בערוץ הפלואורסצנטיות המתאים לו.
      הערה: האות האופטימלי נקבע על פי ההתייחסות על החיוביות והלוקוליזציה המתקבלת בהכתמת הנוגדנים הבודדת.
    3. קבע זמן חשיפה קבוע עבור כל ניתוח (שילוב של נוגדנים-פלואורופור) כדי לתקנן השוואה בין מדגמים.
      הערה: קביעת החשיפה הקבועה תלויה בעוצמת המדגם של תחומי העניין.
    4. סרוק את השקופיות המוכתמות במולטיפלקס במצב הסריקה המתאים באמצעות אלגוריתם מיקוד אוטומטי מוטבע.
      הערה: הספרייה הספקטרלית שהוקמה תשמש להבחנה בין קוביית התמונה הרב-ספקטרלית לרכיבים בודדים בודדים (ביטול ספקטרלי). פעולה זו תאפשר לעבד את הזיהוי מבוסס הצבע עבור כל סמני העניין באמצעות שני השלבים העיקריים הבאים: אימון וניתוח תמונה.
  3. ניתוח תמונה
    1. ספירת תאים של סוגי תאי מערכת החיסון שנבחרו באנדומטריום
    2. לכוד לפחות 10 שדות לניתוח תחת הגדלה של פי 200.
      הערה: השדות נלכדו על-ידי סריקת המקטע כולו ללא כל בחירה. זה יכול להבטיח לכידה בו זמנית של כל רכיבי התא של רירית הרחם, למשל, גבול אפיתל זוהר, סטרומה, ובלוטות.
    3. לספירת התאים, לחצו על הלחצן 'ספירת עצמים' בסרגל השלבים כדי להציג את החלונית 'קביעות ספירת אובייקטים'.
    4. סמן את התיבה בטל אובייקט אם הוא נוגע בקצה לקבלת אי-הכללה של אובייקטים כלשהם שנוגעים בקצה התמונה, אזור התהליך או אזור הרקמה.
    5. אם הרקמה פולחו, בחר את קטגוריית הרקמה שבה ניתן למצוא את האובייקטים. אל תספור אובייקטים מחוץ לקטגוריית הרקמה שנבחרה.
    6. בחרו בגישה הרצויה לזיהוי עצמים: מבוססי אובייקטים או מבוססי פיקסלים (סף).
      הערה: יש לבחור את הגישה המבוססת על פיקסלים (Threshold) במקרה של כתם אמין או עקבי שעבורו היישום של סף פשוט יניב את פיקסלי האובייקט. הגישה המבוססת על אובייקט מומלצת כאשר נדרשות גישות מתקדמות יותר המבוססות על מורפומטריה במקרה של חוסר עקביות וספציפיות של הכתמת חפצים.
    7. בחר את קנה המידההרצוי של האות : שינוי קנה מידה אוטומטי או קנה מידה קבוע.
      הערה: בחירה בשינוי גודל אוטומטי תגרום לשינוי קנה מידה אוטומטי של כל מישור רכיב לפני ביצוע פילוח אובייקטים. האפשרות קנה מידה קבוע מומלצת כאשר נדרשים ביצועי פילוח טובים יותר, ואותות כתמים עקביים ואמינים.
    8. בחר את הרכיב הראשי עבור פילוח אובייקטים מהרשימה הנפתחת.
    9. התאם את ערך האות המינימלי עבור הרכיב הראשי לערך הסף הרצוי.
    10. למילוי אוטומטי של חורים באובייקטים, בחרו 'מלא חורים'.
    11. כדי לזהות אובייקטים שנוגעים באובייקטים אחרים כאובייקטים בודדים, במקום כאובייקט אחד, בחר בתיבת הסימון מקד פיצול לאחר בחירה בתיבת הסימון גודל מרבי (פיקסלים).
    12. כדי לא לכלול אובייקטים בהתבסס על העגולות של האובייקט, סמן את התיבה עיגול וציין את מעגליות המינימום הרצויה.
    13. ספירת כל התאים הסטרומליים (CD3−/CD20−/CD68−/CD56−ו- DAPI+), כולל התאים המקיפים את כלי הדם.
    14. ספירת תאי החיסון בנפרד, כולל תאי T (CD3+ ו- DAPI+), תאי B (CD20+ ו- DAPI+), מקרופאגים (CD68+ ו- DAPI+) ותאי uNK (CD56+ ו- DAPI+).
    15. לבטא את הנתונים כאחוזי תאי החיסון ביחס למספר הכולל של תאי סטרומליים עבור כל תמונה שנלכדה, ולדווח על ספירת התאים הסופיים כממוצע של כל השדות.
    16. השתמש בעורך התצוגה כדי להציג את עיבוד הטבלאות שהתקבלו. יצא את הטבלה נתוני ספירה.
    17. כימות של התפלגות מרחבית של תאי מערכת החיסון רירית הרחם
    18. תחת הגדלה של 200x, להעריך את הפונקציה L באמצעות תוכנית R לטווח של 0-20 מיקרומטר נחשב קשר תא מרחק מרבי14.
      הערה: ארגז הכלים 'spatstat' של שפת R שימש למדידת הפונקציה L.
      1. ציין את רמת קיבוץ הקבצות של זוגות שונים של תאי מערכת החיסון בהתבסס על האזור שמתחת לעקומה (AUC) של הפונקציה L שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התהליך הסכמטי הכולל של ביצוע בדיקת מולטיפלקס בת 4 צבעים לזיהוי 4 סוגי תאי מערכת החיסון רירית הרחם מוצג באיור 1. בקצרה, הפרוטוקול של מכתם אימונופלואורסצנטיות מולטיפלקס זה נדרש 8 צעדים עיקריים: 1. הכנת שקופית, 2. אחזור Epitope, 3. חסימה, 4. יישום נוגדנים ראשי, 5. יישום נוגדנים משני, 6. הגברת אותות, 7. הסרת נוגדנים, ו 8. נגד והרה. עיבוד וניתוח תמונה נערכו לאחר מכן באמצעות תחנת העבודה מנטרה עם הספרייה הספקטרלית שנוצרה באמצעות תוכנת inForm Image Analysis להבחנה בין 4 סוגי תאי החיסון במדגם רירית ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים בפרוטוקול
חשוב לציין כי כתמי מולטיפלקס דורשים אופטימיזציה שקדנית. אחזור אנטיגן, באמצעות טכנולוגיית חיץ סיטראט ומיקרוגל, דורש אופטימיזציה כדי להבטיח הפשטת נוגדנים מלאה ולשמור על כדאיות רקמות. כמו ריאגנטים TSA covalently לאגד לאתרים המקיפים את האנטיגן, הם יכולים לעכב את הכריכה של נוגדן ראשוני לאחר מכן באמצעות מכשול סטרי (הידוע גם בשם "אפקט מטריה"). זה נוטה להתרחש כאשר סמנים חיסוניים מרובים שוכנים בתא תא אחד וגורמים להפרעות פלואורופור. כדי לזהות אם תהיה השפעה, זה יהיה קריטי לבצע מונופלקס IH...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי קרן הנאמנות המיילדות והינקולוגית של הונג קונג בשנת 2018 וקרן הבריאות והמחקר הרפואי של הונג קונג (06170186, 07180226).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הגברה מדללפרקין אלמרFP1498פלואורופור מדלל
נוגדן מדללפרקין אלמרARD1001EAדילול הנוגדן
CD3Spring BioscienceM3072נוגדן ראשוני
CD20Biocare MedicalCM004Bנוגדן ראשוני
CD56LeicaNCL-CD56-504ראשוני נוגדן
CD68Spring BioscienceM5510ציטראט נוגדן ראשונית
, pH 6.0 (10x)תמיסת אחזור אנטיגןשל AbcamAB64214
EMSURE קסילן (תערובת איזומרית)Merck108297הסרת שעווה
אתנול מוחלטMerck107017אלכוהול אתילי להחזרת נוזלים
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica MicrotomeLeicaRM2125RTSחתך של רקמה משובצת פרפין
בטופס תוכנה מתקדמת לניתוח תמונותפרקין אלמרinForm® תוכנת איתור רקמות 2.2.1 (גרסה 14.0)תוכנת ניתוח נתונים
Mantra® תחנת עבודהAkoya BiosciencesCLS140089הדמיה ספקטרלית
מיקרוגלפנסוניקאינוורטרהפשטת מיקרוגל
אופל 520פרקין אלמרFP1487Aמגיב פלואורסצנטי מתאים על בסיס טירמיד
אופל 620פרקין אלמרFP1495Aמגיב פלואורסצנטי מתאים על בסיס טירמיד
אופל 650פרקין אלמרFP1496Aמגיב פלואורסצנטי מתאים על בסיס טירמיד
אופל 690פרקין אלמרFP1497Aמגיב פלואורסצנטי מתאים על בסיס טירמיד
תנורMemmertU10הסרת שעווה
תמיסת חסימת פרוקסידאזDAKOS2023הסרת פעילויות פרוקסידאז רקמות
שקופית מצופה פולי-L-ליזיןFISHER SCIENTIFIC120-550-15שקופית לשימוש היסטולוגי שגרתי
PolyHRP ספקטרום רחבפרקין אלמרARH1001EAנוגדן משני
ProLong™ תושבת זהב AntifadeThemoFisher ScientificP36930הרכבה
Spatstat/גרסה 2.1-0ניתוח דפוס נקודה מרחבית
ספקטרלי DAPIפרקין אלמרFP1490Aרקמות צביעת חומצות גרעין
Thermo FischerExcelsior ESעיבוד רקמות להתייבשות ופרפיניה
Tris Buffer Saline (TBS), 10xטכנולוגיית איתות תאים12498Sתמיסת כביסה
Tween 20Sigma-AldrichP1370-1Lחומר ניקוי לא יוני
תמיסת חיץ מעבד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004(2018).
  2. Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
  3. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  4. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
  5. King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
  6. Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
  7. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
  8. Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
  9. Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
  10. Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
  11. Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
  12. Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, Suppl 2 26-36 (1999).
  13. Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711(2019).
  14. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
  15. Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים