מאמר שיטה

iNEXT-Discovery and Instruct-ERIC: שילוב שירותים מתקדמים למחקר תרגומי בביולוגיה מבנית

DOI:

10.3791/63435

⸱

16 בנובמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biochemistry and Oncode Institute, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, 2CERM/CIRMMP, University of Florence, 3Instruct-ERIC, Oxford University, 4MISTRAL beamline, Alba Light Source, 5Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Goethe University Frankfurt, 6Division of Structural Biology, Oxford University, 7Macromolecular Crystallographyy, Helmholtz-Zentrum Berlin

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמרים שנדונו:

Ahmad, M. U. D. et al. פלואורמטריית סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בגילוי עופרת מבוססת שבר. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62469 (2021).

Barbieri, L., Luchinat, E. ניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד בתאים אנושיים על ידי תמ"ג כמותי בזמן אמת בתוך התא באמצעות ביו-ריאקטור בצפיפות תאים גבוהה. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (169), e62323 (2021).

Berg, H. et al. סינון מקטעים מבוסס NMR במצב מדגם מינימלי אך מקסימלי. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (172), e62262 (2021).

Beriashvili, D., Schellevis, R. D., Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. מחקרים ברזולוציה גבוהה של חלבונים בממברנות טבעיות על ידי NMR במצב מוצק. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (169), e62197 (2021).

Cornaciu, I. et al. צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטיים במתקן EMBL HTX בגרנובל. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (172), e62200 (2021).

Crawshaw, A. et al. צינור הכנת דגימה למיקרו-גבישים בקו האלומה של VMXm. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (172), e62306 (2021).

Douangamath, A. et al. השגת סינון שברים יעיל במתקן XChem במקור אור יהלום. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62414 (2021).

Groen, J. et al. תיאור קרטוגרפי תלת מימדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן Cryo Soft. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (169), e62190 (2021).

Horrell, S. et al. איסוף נתונים סדרתי יעד קבוע במקור אור יהלום. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (168), e62491 (2021).

Jiménez-Moreno, A. et al. Cryo-EM וניתוח חלקיק יחיד עם סקיפיון. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62261 (2021).

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. הכנה ומיקרו-עיבוד CryoFIB של Saccharomyces cerevisiae עבור טומוגרפיה של CryoElectron. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. E62351 (2021).

Vyas, N. et al. איסוף נתונים מיקרוסקופיים של תאורה מובנית קריו מתאים שהשתמרו קריוגנית. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62274 (2021).

Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתוני טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (169), e62383 (2021).

White, J. B. R. et al. מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים של חלקיק יחיד: ממדגם למבנה. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (171), e62415 (2021).

Wollenhaupt, J. et al. זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-צנטרום ברלין. כתב העת לניסויים חזותיים: JoVE. (169), e62208 (2021).

מאמר מערכת

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחום הביולוגיה המבנית התפתח למערכת רבת עוצמה של הבנת הביולוגיה באמצעות הפרטים האטומיים של מבנים ביומולקולריים, מעשירה את הבנתנו את המסלולים הביוכימיים ואת הבסיס המולקולרי של מחלות, ומציעה כלי הכרחי למחקר תרגומי.

במהלך השנים, הביולוגיה המבנית הרחיקה לכת הרבה מעבר לספק מבנים סטטיים, לדווח גם על אינטראקציות מולקולריות, הן בתמיסה והן בתאים, תוך בחינת טווחי זמן ודינמיקה. ניתן לקבל מידע כדי להסביר תהליכים בקני מידה שונים, כלומר, מאטומים ומולקולות בודדות ועד חלקיקי וירוס ותאים שלמים. טכנולוגיות שונות מספקות מערך סינרגטי של גישות ניסיוניות, כולל שיטות פיזור המבוססות על קרני רנטגן, נויטרונים או אלקטרונים, למשל, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן (MX) או פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS); תהודה מגנטית גרעינית של מצב מוצק ותמיסה (NMR); ושחזור חלקיקים בודדים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו (cryo-EM). שיטות כגון טומוגרפיה קריו-EM, טומוגרפיה של קרני רנטגן קריו-רכות ותמ"ג בתוך התא מוסיפות לארסנל זה של גישות לחקר מערכות מקרומולקולריות, במיוחד בקשר לכלי הדמיה אחרים. יחד עם שיטות ביופיזיקליות נוספות המספקות מידע משלים על זיקות וטווחי זמן של אינטראקציה מולקולרית, ביולוגיה מבנית אינטגרטיבית מציעה כיום חבילה אדירה להבנת החיים ולפיתוח תרופות, תרופות ביולוגיות (נוגדנים, ננו-גופים, חיסונים), ביו-חומרים וגורמים ביולוגיים אחרים, כגון אנזימים שניתן להשתמש בהם לפירוק פלסטיק ולעזור לסביבה.

בשלב מוקדם, הנציבות האירופית (EC) הכירה ביתרונות שיש למחקר בביולוגיה מבנית לחברה, ומאז שנות ה-80 אירופה השקיעה רבות בפתיחת ציוד יקר לביולוגיה מבנית בחינם לקהילה המדעית הרחבה יותר. דמוקרטיזציה זו של הגישה למתקנים בשווי מיליוני אירו הייתה כוח מניע ואבן פינה לפיתוח תחום הביולוגיה המבנית בעולם. זה הציב את אירופה בחוד החנית של התחום, ובכך אפשר מגזר תעשייתי חזק ותורם לכלכלה המקומית.

ה-EC מוקיר מסורת ארוכה ומרשימה של גישה והכשרה של חוקרים חיצוניים בטכנולוגיות ביולוגיה מבנית. בעקבות תוכנית iNEXT המוצלחת (תשתית לתמ"ג, EM וקרני רנטגן למחקר תרגומי) שאפשרה גישה חופשית לביולוגיה מבנית למתקנים מתקדמים ולכל החוקרים האירופאים עד סוף 2019, פרויקט Horizon2020 iNEXT-Discovery החל בפברואר 2020 לתקופה נוספת של ארבע שנים של גישה במימון מלא לתשתיות ביולוגיה מבנית. במקביל, Instruct-ERIC הוא ציון דרך של הפורום האסטרטגי האירופי לתשתיות מחקר, המהווה מעוז בר קיימא בביולוגיה מבנית עבור הקהילה המדעית האירופית והבינלאומית. יחד, הם שואפים להעסיק מדעני חיים ואחרים במחקר בביולוגיה מבנית, ולשם כך הם מציעים גישה לכמה מהמומחיות, הטכנולוגיות והמתקנים הטובים ביותר בביולוגיה מבנית ברחבי העולם, לחוקרים מהאקדמיה ומהתעשייה כאחד. יחד עם שותפים נוספים, הם גם מארגנים סדנאות והכשרה מעשית.

בגלל מגיפת Covid19, הנסיעה למתקני המחקר iNEXT-Discovery ו-Instruct-ERIC נפגעה במידה רבה, ולמעשה אסרה על הזדמנויות הכשרה מעשיות. כדי לפצות על כך באופן חלקי, iNEXT-Discovery ו-Instruct-ERIC ארגנו שניהם סדרות סמינרים מקוונים (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function), כמו גם את גיליון השיטות המיוחד הזה של כתב העת Journal of Visualized Experiments. כאן תמצאו תיאורים מפורטים לא רק עבור כמה מהליכי הגישה המיינסטרים שלנו, אלא גם עבור שגרות מיוחדות הנמצאות בפיתוח בתחום הביולוגיה המבנית האינטגרטיבית. בעוד שהשיטות שלנו מתוארות בגיליון זה בפירוט, חלקן דורשות מומחיות וציוד שקשה להקים באופן מקומי. מתקני Instruct-ERIC ו-iNEXT-Discovery זמינים לספק שיטות אלה, כולל ייצור הביו-מולקולות הדרושות למחקרים מבניים, בסיוע ופיקוח של צוות מקומי מיומן.

שיטות משופרות לקביעת מבנים מקרומולקולריים
בעשור האחרון, cryo-EM התפתחה לטכנולוגיה פופולרית ביותר לקביעת מבנים מורכבים מקרומולקולריים. הצוות מאוניברסיטת לידס (בריטניה) מספק סקירה כללית של כל השלבים הכרוכים בניתוח EM של חלקיק יחיד, תוך התמקדות במשתנים שניתן לייעל במהלך זרימת העבודה ופתרון בעיות נפוצות1. כאשר הפעלת מיקרוסקופ מקוון על ידי משתמשים חיצוניים הופכת לסטנדרט, נדרשים פרוטוקולים להפעלה והדמיה יעילים מרחוק. עם ניתוח של חלקיק בודד, דגימות מזוגגות מצולמות כדי לייצר סרטים המציגים חלקיקים בכיוונים אקראיים. זרימת עבודה של עיבוד תמונה מזהה את הפרמטרים לשחזור הדגימה הנחקרת. התוכנה Scipion מבית CSIC (ES) מספקת את כל הכלים ליצירת זרימת עבודה זו, ומאפשרת גם מעקב ישיר אחר התוצאות2.

איסוף נתוני עקיפה של קרני רנטגן על דגימות גבישיות קטנות מאוד מציע הזדמנויות מחקר נהדרות כמו גם אתגרים טכניים. צוות Diamond (בריטניה) מציג את השימוש בכלי cryo-EM להכנת מאות מיקרו-גבישים על רשת אחת עם נוזל מקיף מינימלי על תומך רעש נמוך, לפני איסוף נתונים בסביבת קו אלומה ייעודית הכוללת ואקום בנתיב קרני הרנטגן לפני ואחרי הדגימה3. איסוף נתוני רנטגן סדרתי בסינכרוטרון הוא גם מפתח לחקר מערכות גבישיות קשות אחרות. בתרומה אחרת, דיימונד מציג הוראות שלב אחר שלב, דמויות וסרטונים לאיסוף נתונים באמצעות מגוון מערכות העברת גבישים, באמצעות סדרה של דוגמאות4.

ביולוגיה מבנית אינטגרטיבית מודרנית בגילוי תרופות
קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן מבוססת היטב לגילוי תרופות מבוססות פרגמנטים וכבר משמשת בדרך כלל לזיהוי פגיעות שניתן לפתח בצורה חלקה על מועמדים מובילים. צוותים מ-Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) ו-MAX IV (SE)6, ויחידת EMBL Grenoble (FR)7 מתארים את ההתפתחויות האחרונות שלהם באוטומציה של זרימות עבודה להתגבשות מטרה יעילה, השריית שברים, הרכבה גבישית, סינון שברים מונע קריסטלוגרפיה ושקיעת מבנה. הצינורות שלהם אוטומטיים למדי ומשמשים חוקרים חיצוניים ברחבי העולם. הם יושמו כבר על יותר מ-100 מטרות (לעתים קרובות מרחוק) כדי לזהות פגיעות לתכנון תרכובות נוספות ופיתוח לידים בסיוע מבנה.

NMR משמש בדרך כלל גם לסינון מקטעים בקמפיינים לפיתוח תרופות, המכוונים לחלבונים או לפולינוקלאוטידים, מסיסים או קשורים לממברנה. אוניברסיטת גתה בפרנקפורט (DE) מציגה צינורות סינון NMR אופטימליים, המפחיתים התערבות ידנית במהלך ניסויים וניתוחים8. מחליפי הדגימות שלהם מטפלים במאות דגימות NMR בריצה אחת במהלך מספר ימים של ניסויים ללא הפרעה וניתוח אוטומטי.

בנוסף, שיטות ביופיזיקליות משלימות את קרני הרנטגן והתמ"ג. הצוות ממכון הסרטן ההולנדי (NL) מציג זרימת עבודה המשתמשת בקלורימטריית סריקה ננו-דיפרנציאלית לבדיקות הסטה תרמית למדידת שינויים בטמפרטורת ההיתוך של היעד עם הוספת שברים9. לאחר דרישות מוקדמות לגבי איכות וריכוז החלבון מגיע פרוטוקול אנליטי לתכנון ניסויים, איסוף נתונים וניתוח.

לקראת ביולוגיה מבנית תאית
טומוגרפיה קריו-אלקטרונית היא לרוב שיטת הבחירה לבחינת קומפלקסים מקרומולקולריים בתאים. תמונות מדגימות מזוגגות נרכשות בזוויות הטיה שונות, ומשוחזרת טומוגרפיה תלת מימדית, שממנה מופקים נפחי משנה כדי לתת רזולוציה גבוהה יותר על ידי ממוצע תת-טומוגרמה. מכיוון שאלקטרונים מקיימים אינטראקציה חזקה עם חומר, מחקרים כאלה דורשים דגימות בעובי של פחות מ-200 ננומטר. צוות CEITEC (CZ) מציג פרוטוקול10 להכנת למלות תאיות לאחר הקפאת צלילה. למרות שהאוטומציה ב-cryo-ET עשתה התקדמות מרשימה, נדרשות שעות של איסוף נתונים לפני שמתבצעת רכישת סדרת הטיה, ומטרות בדרך כלל עדיין מזוהות על ידי בדיקת רשת חזותית. פרוטוקול אוטומציה הוכן על ידי EMBL היידלברג (DE) למיפוי רשתות וריבועי רשת, לבחירת מטרות והגדרת רכישת סדרת הטיה11.

הסינכרוטרונים ALBA (ES) ו-Diamond דנים יחד במלכודות וביתרונות של חלופה לטומוגרפיה cryo-EM המאפשרת בחינת תאים שלמים, כלומר, טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות (cryo-SXT)12. התאמת טכניקות סופר-רזולוציה לטמפרטורות קריוגניות מאפשרת הדמיה קורלטיבית עם cryo-ET ו-cryo-SXT. כמו כן, מיקרוסקופ תאורה מובנה קריו בתפוקה גבוהה (cryo-SIM) מכפיל את הרזולוציה של הקרינה הקונבנציונלית, מה שמוביל למיקום הספציפי של מולקולות או מבנים בדגימות עבות. ניתן לתאם זאת עם cryo-SXT כדי לאתר תכונות ספציפיות בהקשר התאי13.

צוות אוניברסיטת אוטרכט (NL) מדווח על הכנת דגימות וניסויי תמ"ג במצב מוצק ברגישות גבוהה שניתן להשתמש בהם כדי לחקור מערכות פיזיולוגיות מאתגרות, כולל ממברנות טבעיות ומערכות חלבון-שומנים-גליקן14. בנוסף, תמ"ג של פתרון בתוך התא מתפתח במהירות כדי להבהיר תהליכים פונקציונליים. צוות CERM/CIRMMP (IT) מתאר כיצד להרכיב ולהפעיל ביו-ריאקטורים המאפשרים חידוש של חומרים מזינים וחמצן לתאים חיים בתוך בדיקת ה-NMR בליבה של מגנט בעל שדה גבוה15. זה מאפשר מדידות מורחבות וניסויים שנפתרו בזמן, למשל, לניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד תוך תאיות.

הערות לסיכום
גיליון זה של JoVE מוקדש כולו להתפתחויות ויישומים אחרונים בביולוגיה מבנית בתשתיות מחקר אירופיות. יחד, iNEXT-Discovery ו-Instruct-ERIC מאפשרים למומחים לביולוגיה מבנית, אך יותר ויותר גם מדעני חיים שאינם מומחים וחוקרים אחרים, לקדם את מטרות המחקר שלהם על ידי הצעת שירותים מתקדמים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גיליון זה של JoVE Methods Collection ממומן על ידי iNEXT-Discovery, פרויקט מספר 871037, הממומן על ידי תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62415(2021).
  2. Jiménez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with scipion. Journal of. Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  3. Crawshaw, A., et al. A sample preparation pipeline for microcrystals at the VMXmbeamline. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62306(2021).
  4. Horrell, S., et al. Fixed target serial data collection at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62491(2021).
  5. Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at XChemfacility at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62414(2021).
  6. Wollenhaupt, J., et al. Workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum Berlin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62208(2021).
  7. Cornaciu, I., et al. The automated crystallography pipelines at the EMBL HTX facility in grenoble. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62200(2021).
  8. Berg, H., et al. NMR-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62262(2021).
  9. Ahmad, M. U. D., et al. Nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62469(2021).
  10. Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and CryoFIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for CryoElectrontomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e62351(2021).
  11. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62383(2021).
  12. Groen, J., et al. A 3D cartographic description of the cell by cryosoft X-ray tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62190(2021).
  13. Vyas, N., et al. Cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62274(2021).
  14. Beriashvili, D., Schellevis, R. D., Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. High-resolution studies of proteins in natural membranes by solid-state NMR. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62197(2021).
  15. Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring protein-ligand interactions in human cells by real-time quantitative in-cell NMR using a high cell density bioreactor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62323(2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Nano differential Scanning FluorimetryProtein ligand InteractionsIn cell NMRFragment based Lead DiscoverySolid state NMRAutomated CrystallographyCryo EMSingle particle AnalysisCryo electron TomographyData Acquisition StrategiesHigh resolution Protein StudiesBioreactor Technology

מאמרים קשורים