מאמר שיטה

שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה

DOI:

10.3791/63436

⸱

28 בדצמבר 2021

 ,  , 
1Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינון תוכן גבוה (HCS) וניתוח תוכן גבוה (HCA) הן טכנולוגיות המספקות לחוקרים את היכולת לחלץ מדידות פנוטיפיות כמותיות בקנה מידה גדול מתאים. גישה זו הוכיחה את עצמה כבעלת עוצמה להעמקת הבנתנו במגוון רחב של אירועים בסיסיים ויישומיים בביולוגיה של התא. עד כה, רוב היישומים עבור טכנולוגיה זו הסתמכו על השימוש בתאים הגדלים monolayers, אם כי הוא הבין יותר ויותר כי מודלים כאלה אינם מסכמים רבים של אינטראקציות ותהליכים המתרחשים ברקמות. ככזה, חלה הופעתה בהתפתחות ושימוש במכלולי תאים תלת מימדיים (3D), כגון כדוריות ואורגנוידים. למרות שמודלים תלת-ממדיים אלה חזקים במיוחד בהקשר של ביולוגיה של סרטן ומחקרי אספקת תרופות, הייצור והניתוח שלהם באופן ניתן לשחזור המתאים ל- HCS ו- HCA מציבים מספר אתגרים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר שיטה ליצירת כדוריות גידול רב-תאיות (MCTS), ומדגים כי ניתן להחיל אותה על שלושה קווי תאים שונים באופן התואם את HCS ו- HCA. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות כדוריות לבאר, ומספקת את היתרון הספציפי שכאשר משתמשים בו במשטר סינון, ניתן להשיג נתונים מכמה מאות מבנים לבאר, כולם מטופלים באופן זהה. דוגמאות מסופקות גם, המפרטות כיצד לעבד את הספרואידים להדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה וכיצד HCA יכול לחלץ תכונות כמותיות הן ברמת הספרואיד והן מתאים בודדים בתוך כל ספרואיד. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מיושם כדי לענות על מגוון רחב של שאלות חשובות בביולוגיה של התא.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן מסורתי, בדיקות מבוססות תאים בוצעו ב-monolayers הגדלים על מצע מוצק, אשר למעשה יכול להיחשב כסביבה דו-ממדית (דו-ממדית). עם זאת, זה הופך להיות מוכר יותר ויותר כי מודלים תרבית תאים 2D חסר רלוונטיות פיזיולוגית בהקשרים מסוימים ולא יכול לשכפל רבים של אינטראקציות מורכבות המתרחשות בין תאים1. שיטות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) של תרבית תאים הופכות במהירות לפופולריות בקרב החוקרים, ומודלים של תאים תלת-ממדיים מראים פוטנציאל גבוה לחקות טוב יותר את התנאים הפיזיולוגיים בהם נתקלים התאים בסביבת הרקמה2. ישנם מספר סוגים שונים של מכלולי תאים תלת-ממדיים שהועסקו, אך שני הסוגים הנפוצים ביותר הם כדוריות ואורגנוידים. ניתן לגדל כדורים מקווי תאים רבים ושונים, והם יכולים לאמץ צורות וגדלים שונים בהתאם לסוג התא המשמש ולשיטת ההרכבה שלהם3. יתר על כן, spheroids יכול גם להיקרא spheroids גידול רב תאי (MCTS) כאשר הם גדלים מקווי תאים סרטניים, ומודלים אלה מצאו שימוש מיוחד עבור משלוח תרופות הפריה-קלינית במבחנה ומחקרי רעילות4,5. Organoids, לעומת זאת, שואפים לחקות טוב יותר את הרקמות והאיברים בגוף שלנו והוא יכול לאמץ סידורים מורפולוגיים מורכבים יותר. הייצור של organoids כרוך בשימוש בתאי גזע בוגרים או תאי גזע pluripotent, אשר ניתן לתכנת מחדש לתוך התאים המתאימים כדי להידמות לרקמה או איבר העניין. הם משמשים בעיקר כדי לחקור את התפתחות האיברים וכדי מודל מחלות ואינטראקציות מארח-פתוגן6.

יש מגוון של שיטות שונות המשמשות ליצירת הרכבות תאים תלת-ממדיות. שיטות מבוססות פיגומים מספקות מצע או תמיכה שבהם תאים יכולים להיצמד או לגדול בתוכם. פיגומים אלה יכולים להיות צורות שונות והוא יכול להיעשות ממגוון רחב של חומרים שונים. הנפוצים ביותר הם רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) והידרו-ג'לים, והם נועדו להידמות לסביבה החוץ-תאית הטבעית של התאים ובכך להקל על אינטראקציות פיזיולוגיות4,7. חומר מרתף ECM הופק מגידול סרקומה עכבר אנגלברט-הולם-נחיל והוכח שהוא מכיל תערובת עשירה של רכיבי ECM, כולל למינין, קולגן מסוג IV ופרלקן8. עם זאת, למרות הרכב היתרון שלה, ישנם שני אתגרים עיקריים עם השימוש בו, כלומר שונות אצווה לאצווה שלה וכי יש לו שני מצבים מצרפיים שונים מתחת ומעל 10 °C8,9. לעומת זאת, הידרוג'לים יש את היתרון של להיות גמיש ביחס לרכיבים שלהם קשיחות, והם יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים את הרכבה ספציפית 3D התא הרצוי 7,10. שיטות מבוססות פיגומים חיוניות לצמיחת אורגנויד אך משמשות גם באופן נרחב עבור כדוריות. שיטות נטולות פיגומים, הפועלות על ידי מניעת הצמדת תאים לפני השטח שעליהם הם גדלים, תואמות בדרך כלל רק להרכבה כדורית. דוגמאות כוללות לוחות קובץ מצורף אולטרה-נמוך (ULA), עם תחתית שטוחה או U-bottom, המאפשרים צבירה של התאים לתוך spheroids, או שימוש בתסיסה מתמשכת של התאים בבקבוקי ספינר / סיבוב10.

השימוש במכלולי תאים תלת-ממדיים כדי לחקור מגוון רחב של אירועים ביולוגיים צובר במהירות פופולריות; עם זאת, זה חיוני כי השיטה שנבחרה עבור התרבות שלהם מתאימה ותואמת עם התוכניות לניתוח במורד הזרם שלהם. לדוגמה, השימוש בלוחות ULA יוצר כדוריות של עקביות גבוהה; עם זאת, שיטה זו מוגבלת לייצור של ספרואיד יחיד לבאר, ובכך להגביל את התפוקה. שיקול מסוים נדרש כאשר הדמיית פלואורסצנטיות של המבנה 3D מתוכנן. המצע או הצלחת שעליהם גדל ההרכבה צריכים להיות תואמים אופטית, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למזער את ההשפעות של פיזור אור שנגרם על ידי פיגומים שאולי נעשה בהם שימוש11. בעיה מסוימת זו הופכת חריפה יותר ככל שהצמצם המספרי של עדשות המטרה של המיקרוסקופ עולה.

ניתן לטעון שאחת הסיבות העיקריות לבחירה לעבוד עם מודל תא תלת-ממדי היא לחלץ נתוני הדמיה נפחית לא רק על ההרכבה כולה אלא גם על התאים הבודדים שבתוכה. מודלים של MCTS, בפרט, מתחילים להיות חזקים מאוד להעמקת ההבנה שלנו כיצד טיפוליות עוברות מבחוץ לתאים מרכזיים (כפי שהם יצטרכו בגידול)12, ולכן רכישת ידע מתאים בודדים בשכבות שונות היא חיונית. טכנולוגיית ההדמיה המחלצת מידע כמותי מתאים בודדים נקראת ניתוח תוכן גבוה (HCA) והיא גישה רבת עוצמה בהקשר של סינון13. עד כה, HCA יושם כמעט אך ורק על תרבויות monolayer, אבל יש הבנה הולכת וגוברת כי גישה זו יש את הכוח להיות מיושם על תרבויות 3D המאפשר מגוון רחב של פונקציות ותהליכים הסלולר להיחקר14. זה יהיה היתרון הברור כי מספר גדול של הרכבות 3D ניתן לנתח, פוטנציאל מתן נתונים ברמת התא מכל מבנה. עם זאת, יש להתגבר על אתגרים הקשורים להדמיה של הרכבות תאים עבות פוטנציאליות, כמו גם את ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו.

במאמר זה מוצגת שיטה חזקה המבוססת על פיגומים לייצור בקנה מידה גדול של MCTS בפורמט של 96 בארות. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות מכלולי תאים תלת-ממדיים בכל באר. דוגמאות מוצגות עבור שלושה סוגי תאים שונים, המייצגים מודלים של גידול מוצק של הכבד, הריאות והמעי הגס. הספרואידים הנוצרים יכולים להיות במגוון גדלים, ולכן HCA משמש לבחירת מבנים בגודל ו/או מורפולוגיה מסוימים. תכונה זו מספקת את היתרון הנוסף כי כל פנוטיפים שנצפו ניתן להשוות על פני כדוריות בגדלים שונים, אבל כל מטופלים באותו אופן באותה באר. גישה זו תואמת הדמיה ברזולוציה גבוהה, וחשוב מכך מספקת נתונים כמותיים ברמת התא והן ברמת התא התת-תאית מאותן מכלולים תאיים. שיטה זו של ייצור כדורי יש יתרון נוסף על פני שיטות המייצרות ספרואיד יחיד לכל באר, כי המספרים הגדולים של spheroids המיוצר בכל באר פוטנציאל לספק ביומסה מספקת עבור ניתוחים אחרים במורד הזרם, כגון תמלול ופרופיל פרוטאום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבות התא

  1. הכנת מדיה
    1. הכן מדיית תרבית תאים ספציפית בהתאם לסוג קו התא. ודא שכל המדיה לתחזוקת התא מכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS).
      הערה: שורות תאים שונות משתמשות במדיה שונה. תאי קרצינומה במעי הגס HT-29 (ATCC HTB-38) גדלים ב- McCoys 5A + 10% FBS. תאי קרצינומה hepG2 hepatocellular (ATCC HB-8065) גדלים במדיום חיוני מינימלי + 1% L-גלוטמין + 10% FBS. תאי קרצינומה סימפונולוגית H358 סימפונות (ATCC CRL-5807) גדלים ב-RPMI 1640 בינוני + 1% L-גלוטמין + 10% FBS. כל המדיה המכילה L-גלוטמין ו- FBS נקראים מדיה מלאה. כאשר ציפוי תאים לגדול כמו spheroids, מדיום פנול אדום חינם עם 10% FBS נדרש כדי למנוע צביעה של חומר המרתף ECM, אשר בתורו יכול לגרום חפצים במהלך תהליך ההדמיה.
  2. תאי תת-תרבות
    1. כאשר תאים הם כ 80% יחד, לשטוף בקצרה עם 2 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25% (w / v) טריפסין / 0.53 mM EDTA). לשאוף את טריפסין-EDTA, להוסיף 3 מ"ל של טרי-EDTA ודגור במשך 3-5 דקות ב 37 °C (37 °F).
    2. כאשר תאים מנותקים מצלחת תרבית התא, מוסיפים 7 מ"ל של מדיום מלא טרי.
    3. פיפטה 1 מ"ל של השעיית תאים לתוך צלחת חדשה של תרבית תאים 10 ס"מ ולהוסיף 9 מ"ל של מדיום שלם טרי לתת דילול של 1:10 של תאים.
    4. תרבית את התאים ב 37 °C (5° C) באינקובטור לח עם 5% CO2.
    5. תת תרבות התאים כל 3-5 ימים, בהתאם לקו התא.

2. דור של כדוריות

  1. מעיל 96-היטב צלחות עם חומר מרתף ECM
    1. להפשיר חומר מרתף ECM על קרח לילה.
    2. לדלל את חומר המרתף ECM במדיום נטול סרום נטול פנול קר ללא רדום באמצעות טיפים מצוננים מראש שנשמרו בטמפרטורה של -20 °C (60 °F).
      הערה: הריכוז הסופי של חומר מרתף ECM תלוי בקו התא המשמש. עבור תאי HT-29 ו- H358, השתמש ב- 4 mg·mL-1 של חומר מרתף ECM. עבור תאי HepG2, השתמש 4 mg·mL-1 של חומר מרתף ECM גורם גדילה מופחת.
    3. פיפטה 15 μL של חומר מרתף ECM / פתרון בינוני לתוך צלחת הדמיה 96-well.
      הערה: עבור ייצור כדורי בקנה מידה גדול, שלב זה יכול להתבצע עם פיפטה 8 ערוצים וראש צינור 96 ערוצים, כל עוד הטיפים והמאגר המכילים את חומר המרתף ECM מקוררים.
    4. צנטריפוגה הצלחת במשך 20 דקות ב 91 x g ב 4 °C (4 °F).
    5. לדגור על הצלחת במשך לא יותר מ 30 דקות ב 37 °C (50 °F).
  2. תת-תרבות ותאי ספירה
    1. במהלך תקופת הדגירה של הצלחת, דגירה התאים עם טריפסין-EDTA ו resuspend אותם במדיום שלם המכיל 10% FBS.
    2. פיפטה 10 μL של השעיית התא לתוך תא ספירת המוציטומטר. לספור את מספר התאים ב 4 רבעים של התא.
    3. חשב את מספר התאים בתוך ההשעיה התאית על-ידי קביעת המספר הממוצע של תאים בתוך 4 הרביעים.
      הערה: ניתן לספור תאים גם באמצעות התקני ספירת תאים אוטומטיים.
    4. צנטריפוגה התאים ב 135 x g במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. ברגע שהתאים הם גלולה, לשאוף את supernatant resuspend התאים במדיום מלא ללא פנול אדום כדי לקבל ריכוז של 1 x 106 תאים לכל mL.
  3. תאי זרעים לתוך לוחות מצופים חומר מרתף ECM
    1. לדלל את התאים במדיום מלא ללא פנול אדום.
      הערה: צפיפות התאים שנזרעו תלויה בקו התאים שבו נעשה שימוש. עבור תאי HT-29 ו- HepG2, 3 x 104 תאים נזרעים לבאר; עבור תאי H358, 4 x 104 תאים נזרעים לבאר.
    2. זרע את התאים בנפח כולל של 35 μL לבאר. הקפד להוסיף אותם טיפה בתנועה מעגלית.
      הערה: עבור ייצור כדורי בקנה מידה גדול, שלב זה יכול להתבצע עם פיפטה 8 ערוצים, כל עוד ניתן להשיג את התנועה המעגלית pipetting.
    3. לדגור על התאים במשך 1 שעות ב 37 °C (37 °F) באינקובטור לח עם 5% CO2.
    4. הכן פתרון של חומר מרתף ECM במדיום מלא ללא פנול אדום, אשר התוצאה בריכוז סופי של 2% חומר מרתף ECM בבאר. כדי להשיג זאת, להוסיף 1.2 μL של חומר מרתף ECM ל 23.8 μL של פנול אדום חינם בינוני מלא לכל באר, וכתוצאה מכך נפח סופי של 60 μL לבאר.
    5. לדגור על התאים ב 37 °C (5 ° C ) באינקובטור לח עם 5% CO2.
    6. למחרת, להחליף את המדיום עם 100 μL של פנול טרי אדום חינם מדיום מלא.
    7. החלף את המדיום בכל יום שני עם 100 μL של פנול טרי אדום חינם בינוני מלא.

3. כתמי אימונופלואורסצנטיות של כדוריות

הערה: פרוטוקול זה מותאם מ נירנברג ואח ', 202015. התאמות אלה מבוססות בעיקר על העובדה כי spheroids המתוארים בפרוטוקול זה הם קטנים יותר מאלה המשמשים Nürnberg et al. work15 , וככזה, להקל על זמני דגירה קצרים יותר. לדוגמה, זמני חסימה מופחתים מ 2 שעות ל 1 שעות. בנוסף, כמו הפרוטוקול מיועד לייצור תפוקה גבוהה של spheroids, כל שלבי העיבוד מתבצעים בבאר שבה spheroids הם תרבותיים, כלומר, העברת spheroids בודדים לתוך צינורות אינו נדרש.

  1. הכן את כל הפתרונות והמאגרים הדרושים לתיקון והכתמה
    1. הכן תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) על ידי הוספת טבלית PBS אחת לכל 200 מ"ל של מים. תסגור אוטומטית את ה-פי.בי.אס.
    2. הכן paraformaldehyde (PFA) בעקבות שלבים 3.1.3-3.1.4.
    3. השתמש מערבל מחומם כדי לחמם 400 מ"ל של PBS עד 60-70 °C (60 °F) במכסה המנוע אדים. מוסיפים 15 גרם של PFA תוך כדי ערבוב. לאחר PFA התמוסס, להוסיף 50 μL של 1 M CaCl2 ו 50 μL של 1 M MgCl2.
    4. הוסף 100 מ"ל של PBS כדי ליצור נפח סופי של 500 מ"ל. השתמש ב- NaOH כדי להשוות את רמת ה-PFA ל-pH 7.4. סנן את ה-PFA באמצעות מסנני ואקום סטריליים (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר), aliquot, ואחסן בטמפרטורה של -20 °C (60 °F).
    5. הכן פתרון מלאי גליצין 1 M על ידי הוספת 3.75 גרם של גליצין ל 50 מ"ל של PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F).
    6. הכן 5 מ"ל של מאגר פרמביליזציה על ידי הוספת 100 μL של טריטון X-100, 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ו 1.5 מ"ל של 1 M גליצין ל 2.4 מ"ל של PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך לא יותר משבועיים.
    7. הכן 5 מ"ל של חוצץ חסימה על ידי הוספת 100 μL של טריטון X-100, 0.5 מ"ל של DMSO ו 0.05 גרם של אלבומין סרום בקר (BSA) ל 4.9 מ"ל של PBS. Aliquot חוצץ חסימה לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (60 °F).
    8. הכן 5 מ"ל של מאגר דגירה נוגדנים על ידי הוספת 10 μL של פוליסורבט 20, 0.05 גרם של BSA, ו 250 μL של DMSO ל 4.74 מ"ל של PBS. Aliquot את חיץ הדגירה נוגדנים לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולאחסן אותו ב -20 °C (60 °F).
      הערה: בפרוטוקול המתואר כאן, כדוריות מורכבות רק ב -60 הבארות הפנימיות של צלחת של 96 בארות, אם כי ניתן להכין אותן בכל 96 הבארות של הצלחת. הסיבה להכנת כדוריות רק ב -60 הבארות הפנימיות היא שכמה עדשות אובייקטיביות צמצם מספריות גבוהות אינן מסוגלות פיזית לדמיין את כל הבאר של הבארות החיצוניות בשל 'החצאית' בסוגי לוחות מסוימים. הכרכים לעיל מספיקים להכנת 60 בארות המכילות כדוריות.
  2. לתקן ולחדירות את הספרואידים
    1. הסר בזהירות את המדיום מהספרואידים, והבטיח כי שכבת החומר במרתף ECM לא תופרע.
    2. לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    3. לתקן את spheroids עם 70 μL של 3% PFA עבור 1 h ב 37 °C (50 °F).
    4. לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    5. להרוות עם 70 μL של 0.5 M תמיסת גליצין במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F).
    6. Permeabilize spheroids באמצעות 70 μL של מאגר permeabilization במשך 30 דקות ב RT.
    7. לשטוף את spheroids פעמיים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    8. לדגור על spheroids ב 70 μL של חיץ חסימה במשך 1 שעות ב 37 °C (50 °F).
      הערה: לאחר שהספרואידים תוקנו, ניתן לבצע את כל שלבי העיבוד הבאים באמצעות פיפטה של 8 ערוצים, או ראש צנרת של 96 בארות, אם הם זמינים. זה מגביר את המהירות של הכנת spheroid לפני הדמיה.
  3. כדוריות חיסוניות המשתמשות בנוגדנים ראשוניים ומשניים
    1. לדלל את הנוגדן העיקרי לדילול מתאים במאגר הדגירה של הנוגדנים ולהוסיף 70 μL לכל באר. לדגור את הספרואידים עם הנוגדנים העיקריים בן לילה.
      הערה: הדילול תלוי בנוגדן הספציפי שבו נעשה שימוש. בדוגמה המוצגת כאן, ליזוזומים מחוסנים בנוגדני עכבר נגד LAMP1 באמצעות דילול של 1:500.
    2. למחרת, לשטוף את spheroids 5 פעמים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
    3. לדלל את הנוגדן המשני בדילול של 1:500, פלואורסצנטית מצומדת phalloidin ב 1:500, ו Hoechst 33342 (ממלאי 1 מ"ג מ"ג-1 ) ב 1:5000 במאגר הדגירה נוגדנים ולהוסיף 70 μL לכל באר. דגירה בין לילה.
      הערה: דילול הנוגדנים תלוי בנוגדן הספציפי שבו נעשה שימוש. מומלץ להשתמש בנוגדנים משניים בעלי סיפוח צולב גבוה, המראים יכולת צילום גבוהה ובהירות גבוהה.
    4. למחרת, לשטוף את spheroids 5 פעמים עם 70 μL של PBS במשך 3 דקות בכל פעם.
      הערה: ניתן לאחסן לוחות עד שבועיים ב- RT לפני ההדמיה, כל עוד הספרואידים נשארים מכוסים ב- PBS.

4. רכישה וניתוח תמונה של כדוריות

  1. רכישת תמונה
    1. הכנס את הלוח בן 96 הבארות המכיל כדוריות למיקרוסקופ הקרנה בעל תוכן גבוה קונפוקלי.
    2. בחר את הלייזרים המתאימים כדי לרגש את הפלואורופורים המשמשים.
    3. לרכוש את הערוצים ברצף כדי למנוע דיבורים צולבים.
    4. דמיין את הספרואידים באמצעות מטרות מתאימות.
      הערה: מומלץ להשתמש ביעדי טבילה במים אם הם זמינים. לדוגמה, מטרה של 20x/1.0 NA יכולה לדמות באר שלמה ב- ~ 77 שדות תצוגה. מטרה 63x/1.15 NA יכולה לדמות באר שלמה בכ-826 שדות ראייה.
    5. תמונה ~ 30-40 פרוסות, בהתאם לעומק של spheroid, עם כל פרוסה נלקח במרווח של 1.5 מיקרומטר מן הקודם.
  2. ניתוח תמונה
    1. לניתוח מורפולוגי של כדוריות, בצע את השלבים 4.2.2-4.2.6.
    2. פלח את הספרואידים על סמך כתמי הפאלאואידין המצומדים בפלואורסצנטיות.
    3. לפזר את הגרעינים על סמך הכתם Hoechst 33342.
    4. פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי שאריות Hoechst 33342 כתם שנמצא ציטופלסמה התא.
    5. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של הספרואידים, כולל נפח, שטח פנים, כדוריות, ומספר הגרעינים לכל ספרואיד.
      הערה: מידע זה מופק באמצעות אלגוריתמים שונים המובנים בתוכנת ניתוח התמונה לפי בחירה.
    6. עבד תמונות עוד יותר כדי להסיר כדוריות קטנות מ 75,000 מיקרומטר3 גדול יותר מ 900,000 מיקרומטר3.
      הערה: ערכים אלה הם הצעות לאפשר הסרה של הרכבות תאים קטנות מאוד הרכבות גדולות שאולי התעוררו כתוצאה של היתוך של כדוריות מרובות. כדוריות ניתן גם לסווג לשיעורי גודל שונים בשלב זה.
    7. כדי לנתח תאים בודדים בתוך כדוריות, בצע את השלבים 4.2.8-4.2.12.
    8. פלח את הספרואידים על סמך כתמי הפאלאואידין המצומדים בפלואורסצנטיות.
    9. לפזר את הגרעינים על סמך הכתם Hoechst 33342.
    10. פלח את הציטופלסמה של כל תא על ידי שאריות Hoechst 33342 כתם שנמצא ציטופלסמה התא.
    11. פלח את הליזוזומים על סמך כתמי הנוגדנים המשניים.
    12. חשב תכונות מורפולוגיות שונות של התאים בתוך כל ספרואיד, כולל מספר הליזוזומים לכל תא, נפח התא ואזור הפנים של התא.
      הערה: מידע זה מופק באמצעות אלגוריתמים שונים המובנים בתוכנת ניתוח התמונה לפי בחירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, מפורטת שיטה חזקה לייצור הרכבות תרבית תאים תלת-ממדית בצורה של כדוריות, תוך שימוש בסוגי תאים שונים כדי לייצג רקמות גידול שונות. שיטה זו מאפשרת יצירת מאות כדוריות לבאר, המאפשרת ביצוע בדיקות מבוססות תאים באופן בעל תוכן גבוה (איור 1). גישה זו שימשה בעבר כדי ללמוד ספיגת חלקיקים ב HT-29 spheroids16 ורעילות הנגרמת על ידי חלקיקים ב HepG2 spheroids17. השיטה מסתמכת על ייצור חלוקה דקה ואחידה של חומר פיגומים על פני תחתית הבאר של צלחת איכות אופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה המתוארת כאן מפרטת פלטפורמה ליצירת כמה מאות כדוריות לבאר באופן המתאים ל- HCS ו- HCA. בהשוואה לשיטות פופולריות אחרות, כגון שימוש בלוחות ULA שטוחים עם תחתית ועגולה, המאפשרים היווצרות של ספרואיד אחד בלבד לכל well18,19, שיטה זו מספקת את ההזדמנות להפקת מידע ברזולוציה גבוהה ממספר גדול של כדוריות בתבנית הקרנה. ראוי לציין כי שיטה זו הודגמה בשלושה קווי תאים שונים, המייצגים סוגי גידולים שונים, תוך הדגשת התאמתה הרחבה לחקר מגוון תהליכים תאיים במודלים שונים. למרות sphero...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים הקשורים לעבודה זו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בתמיכתו של מענק מחקר תשתית מקרן המדע אירלנד (SFI) (16/RI/3745) ל- JCS. העבודה במעבדה להקרנת תאים של UCD נתמכת על ידי המכללה למדעים של UCD. ASC ממומן על ידי מועצת המחקר האירית (IRC) ממשלת אירלנד מלגת תואר שני (GOIPG/2019/68). המחברים מודים גם לכל חברי המעבדה על הקלט והדיונים המועילים שלהם. הגרפיקה באיור 1 נוצרה ב-BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדוםGibco25300054
בקר סרום אלבומין (BSA)Sigma AldrichA6003
סידן כלוריפישר סיינטיפיק10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, תרבית רקמות מטופלת, שחורה, 96-בארות עם מכסהPerkin Elmer6055302צלחות אלה שינו את שמות הלוחות ל-Phenoplates
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma AldrichD2650
סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, מאושר על ידי האיחוד האירופי, מוצא דרום אמריקה, מומת בחוםGibco10500064
Glycine FisherScientificBP381-1
עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, תמיסת L-גלוטמין Alexa Fluor 488InvitrogenA-11029
, 200 מ"מGibco25030024
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
מגנזיום כלורידפישר סיינטיפיק10647032
מטריג'ל מטריצת ממברנת בסיס, ללא פנול אדום, ללא LDEV, 10 מ"לקורנינג356237ניתן למצוא נוסחת מטריג'ל זו גם עם אותו מספר קטלוגי ב- BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced MatrigelBD Biosciences356231ניתן למצוא את נוסחת המטריג'ל הזו גם עם אותו מספר קטלוגי במדיום
5A של Corning McCoyGibco26600023
McCoy's 5A מדיום עם L גלוטמין וסודיום ביקרבונט, ללא פנול אדוםHyclone10358633
Minimum Essential Medium (MEM)Gibco21090022
מדיום חיוני מינימלי (MEM), ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםGibco51200046
עכבר נוגדן חד שבטי נגד LAMP1 (תרכיז)מחקרים התפתחותיים Hybridoma BankH4A3-a
תא ספירת נויבאוארהירשמן8100203
צלחת תרבית רקמה Nunclon עם מכסה, פוליסטירן, 92 מ"מ x 17 מ"מThermoFisher Scientific150350
מערכת Opera Phoenix HCS ותוכנת Harmony HCAPerkin ElmerHCSHH14000000
Paraformaldehyde (PFA)Sigma AldrichP6148
Phalloidin Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
טבליות מלח חוצץ פוספט (PBS)Sigma AldrichP4417
פוליסורבט 20סיגמא אולדריץ'P5927
RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAXGibco61870010
RPMI 1640 בינוני, ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםGibco11835063
Triton X-100Sigma AldrichT9284
יחידות מסנן ואקום סטריליות StericupMilliporeSCGVU05RE

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  2. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  3. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  4. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  5. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  6. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  7. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  8. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
  9. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  10. Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784(2020).
  11. Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
  12. Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods' interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362(2020).
  13. Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
  14. Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
  15. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
  16. Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033(2019).
  17. Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
  18. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
  19. Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
  20. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  21. Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043(2020).
  22. Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
  23. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
  24. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904(2020).
  25. Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
  26. Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
  27. Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Spheroid ProductionMulticellular Tumor Spheroids3D Cell CultureConfocal MicroscopyFluorescence ImagingMorphological AnalysisCell SegmentationDrug Delivery StudiesProteomic Analysis

מאמרים קשורים