פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטה איתנה לייצור בקנה מידה גדול של כדורים ליישומי סינון וניתוח בעלי תוכן גבוה
במאמר זה
סיכום
תקציר
סינון תוכן גבוה (HCS) וניתוח תוכן גבוה (HCA) הן טכנולוגיות המספקות לחוקרים את היכולת לחלץ מדידות פנוטיפיות כמותיות בקנה מידה גדול מתאים. גישה זו הוכיחה את עצמה כבעלת עוצמה להעמקת הבנתנו במגוון רחב של אירועים בסיסיים ויישומיים בביולוגיה של התא. עד כה, רוב היישומים עבור טכנולוגיה זו הסתמכו על השימוש בתאים הגדלים monolayers, אם כי הוא הבין יותר ויותר כי מודלים כאלה אינם מסכמים רבים של אינטראקציות ותהליכים המתרחשים ברקמות. ככזה, חלה הופעתה בהתפתחות ושימוש במכלולי תאים תלת מימדיים (3D), כגון כדוריות ואורגנוידים. למרות שמודלים תלת-ממדיים אלה חזקים במיוחד בהקשר של ביולוגיה של סרטן ומחקרי אספקת תרופות, הייצור והניתוח שלהם באופן ניתן לשחזור המתאים ל- HCS ו- HCA מציבים מספר אתגרים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר שיטה ליצירת כדוריות גידול רב-תאיות (MCTS), ומדגים כי ניתן להחיל אותה על שלושה קווי תאים שונים באופן התואם את HCS ו- HCA. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות כדוריות לבאר, ומספקת את היתרון הספציפי שכאשר משתמשים בו במשטר סינון, ניתן להשיג נתונים מכמה מאות מבנים לבאר, כולם מטופלים באופן זהה. דוגמאות מסופקות גם, המפרטות כיצד לעבד את הספרואידים להדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה וכיצד HCA יכול לחלץ תכונות כמותיות הן ברמת הספרואיד והן מתאים בודדים בתוך כל ספרואיד. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מיושם כדי לענות על מגוון רחב של שאלות חשובות בביולוגיה של התא.
מבוא
באופן מסורתי, בדיקות מבוססות תאים בוצעו ב-monolayers הגדלים על מצע מוצק, אשר למעשה יכול להיחשב כסביבה דו-ממדית (דו-ממדית). עם זאת, זה הופך להיות מוכר יותר ויותר כי מודלים תרבית תאים 2D חסר רלוונטיות פיזיולוגית בהקשרים מסוימים ולא יכול לשכפל רבים של אינטראקציות מורכבות המתרחשות בין תאים1. שיטות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) של תרבית תאים הופכות במהירות לפופולריות בקרב החוקרים, ומודלים של תאים תלת-ממדיים מראים פוטנציאל גבוה לחקות טוב יותר את התנאים הפיזיולוגיים בהם נתקלים התאים בסביבת הרקמה2. ישנם מספר סוגים שונים של מכלולי תאים תלת-ממדיים שהועסקו, אך שני הסוגים הנפוצים ביותר הם כדוריות ואורגנוידים. ניתן לגדל כדורים מקווי תאים ר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות התא
- הכנת מדיה
- הכן מדיית תרבית תאים ספציפית בהתאם לסוג קו התא. ודא שכל המדיה לתחזוקת התא מכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS).
הערה: שורות תאים שונות משתמשות במדיה שונה. תאי קרצינומה במעי הגס HT-29 (ATCC HTB-38) גדלים ב- McCoys 5A + 10% FBS. תאי קרצינומה hepG2 hepatocellular (ATCC HB-8065) גדלים במדיום חיוני מינימלי + 1% L-גלוטמין + 10% FBS. תאי קרצינומה סימפונולוגית H358 סימפונות (ATCC CRL-5807) גדלים ב-RPMI 1640 בינוני + 1% L-גלוטמין + 10% FBS. כל המדיה המכילה L-גלוטמין ו- FBS נקראים מדיה מלאה. כאשר ציפוי תאים לגדול כמו spheroids, מדיום פנול אדום חינם עם 10% FBS נדרש כדי למנוע צביעה של חומר המרתף ECM, אשר בתורו יכול לגרום חפצי....
- הכן מדיית תרבית תאים ספציפית בהתאם לסוג קו התא. ודא שכל המדיה לתחזוקת התא מכילה 10% סרום בקר עוברי (FBS).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרוטוקול זה, מפורטת שיטה חזקה לייצור הרכבות תרבית תאים תלת-ממדית בצורה של כדוריות, תוך שימוש בסוגי תאים שונים כדי לייצג רקמות גידול שונות. שיטה זו מאפשרת יצירת מאות כדוריות לבאר, המאפשרת ביצוע בדיקות מבוססות תאים באופן בעל תוכן גבוה (איור 1). גישה זו שימשה בעבר כדי ללמוד ספיגת חלקיקים ב HT-29 spheroids16 ורעילות הנגרמת על ידי חלקיקים ב HepG2 spheroids17. השיטה מסתמכת על ייצור חלוקה דקה ואחידה של חומר פיגומים על פני תחתית הבאר של צלחת איכות אופ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הגישה המתוארת כאן מפרטת פלטפורמה ליצירת כמה מאות כדוריות לבאר באופן המתאים ל- HCS ו- HCA. בהשוואה לשיטות פופולריות אחרות, כגון שימוש בלוחות ULA שטוחים עם תחתית ועגולה, המאפשרים היווצרות של ספרואיד אחד בלבד לכל well18,19, שיטה זו מספקת את ההזדמנות להפקת מידע ברזולוציה גבוהה ממספר גדול של כדוריות בתבנית הקרנה. ראוי לציין כי שיטה זו הודגמה בשלושה קווי תאים שונים, המייצגים סוגי גידולים שונים, תוך הדגשת התאמתה הרחבה לחקר מגוון תהליכים תאיים במודלים שונים. למרות sphero.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים הקשורים לעבודה זו.
תודות
המחברים מכירים בתמיכתו של מענק מחקר תשתית מקרן המדע אירלנד (SFI) (16/RI/3745) ל- JCS. העבודה במעבדה להקרנת תאים של UCD נתמכת על ידי המכללה למדעים של UCD. ASC ממומן על ידי מועצת המחקר האירית (IRC) ממשלת אירלנד מלגת תואר שני (GOIPG/2019/68). המחברים מודים גם לכל חברי המעבדה על הקלט והדיונים המועילים שלהם. הגרפיקה באיור 1 נוצרה ב-BioRender.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום | Gibco | 25300054 | |
| בקר סרום אלבומין (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| סידן כלורי | פישר סיינטיפיק | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, תרבית רקמות מטופלת, שחורה, 96-בארות עם מכסה | Perkin Elmer | 6055302 | צלחות אלה שינו את שמות הלוחות ל-Phenoplates |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, מאושר על ידי האיחוד האירופי, מוצא דרום אמריקה, מומת בחום | Gibco | 10500064 | |
| Glycine Fisher | Scientific | BP381-1 | |
| עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, תמיסת L-גלוטמין Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| , 200 מ"מ | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| מגנזיום כלוריד | פישר סיינטיפיק | 10647032 | |
| מטריג'ל מטריצת ממברנת בסיס, ללא פנול אדום, ללא LDEV, 10 מ"ל | קורנינג | 356237 | ניתן למצוא נוסחת מטריג'ל זו גם עם אותו מספר קטלוגי ב- BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | ניתן למצוא את נוסחת המטריג'ל הזו גם עם אותו מספר קטלוגי במדיום |
| 5A של Corning McCoy | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A מדיום עם L גלוטמין וסודיום ביקרבונט, ללא פנול אדום | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| מדיום חיוני מינימלי (MEM), ללא גלוטמין, ללא פנול אדום | Gibco | 51200046 | |
| עכבר נוגדן חד שבטי נגד LAMP1 (תרכיז) | מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| תא ספירת נויבאואר | הירשמן | 8100203 | |
| צלחת תרבית רקמה Nunclon עם מכסה, פוליסטירן, 92 מ"מ x 17 מ"מ | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| מערכת Opera Phoenix HCS ותוכנת Harmony HCA | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| טבליות מלח חוצץ פוספט (PBS) | Sigma Aldrich | P4417 | |
| פוליסורבט 20 | סיגמא אולדריץ' | P5927 | |
| RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 בינוני, ללא גלוטמין, ללא פנול אדום | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| יחידות מסנן ואקום סטריליות Stericup | Millipore | SCGVU05RE |
מקורות
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
