מאמר שיטה

כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד

DOI:

10.3791/63606

⸱

5 במאי 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית כדי למדל, לטפל ולנתח שינויי כרומטין במצב כמעט פיזיולוגי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרביות שטוחות של תאי יונקים הן גישה נפוצה במבחנה להבנת הפיזיולוגיה של התא, אך מערכת זו מוגבלת במידול רקמות מוצקות עקב שכפול תאים מהיר באופן לא טבעי. זה מאתגר במיוחד כאשר מידול כרומטין בוגר, מכיוון שתאים המשכפלים במהירות מעורבים לעתים קרובות בשכפול DNA ויש להם אוכלוסייה פוליפלואידית הטרוגנית. להלן זרימת עבודה למידול, טיפול וניתוח של שינויים בכרומטין באמצעות מערכת תרביות תאים תלת-ממדית (3D). באמצעות פרוטוקול זה, קווי תאי קרצינומה הפטוצלולריים גדלים כספרואידים תלת-ממדיים הניתנים לשחזור באינקובטור המספק דיפוזיה פעילה של חומרים מזינים וכוחות גזירה נמוכים. הטיפול בנתרן בוטיראט ונתרן סוקסינט גרם לעלייה באצטילציה של היסטון ובסוקצינילציה, בהתאמה. עליות ברמות של אצטילציה היסטון ותמציתינילציה קשורות למצב כרומטין פתוח יותר. לאחר מכן נאספים כדוריים לבידוד גרעיני התא, שמהם מופקים חלבוני היסטון לניתוח השינויים שלאחר התרגום שלהם. ניתוח היסטון מתבצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב מקוון עם ספקטרומטריית מסה טנדם, ואחריה צינור חישובי פנימי. לבסוף, מוצגות דוגמאות לייצוג נתונים כדי לחקור את התדירות וההתרחשות של סימני היסטון קומבינטוריים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז סוף המאהה-19, מערכות תרביות תאים שימשו כמודל לחקר הצמיחה וההתפתחות של תאים מחוץ לגוף האדם 1,2. השימוש בהם הורחב גם כדי לחקור כיצד רקמות ואיברים מתפקדים בהקשרים בריאים וחוליםכאחד 1,3. תאי ההשעיה (למשל, תאי הדם) גדלים בצלחות פטרי או בצלוחיות בצורה חלקה ומתחלפת מכיוון שהם אינם מורכבים במבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) in vivo. תאים שמקורם באיברים מוצקים יכולים לגדול במערכות תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) או תלת-ממדיות. בתרבית דו-ממדית, התאים גדלים בחד-שכבתית שנצמדת למשטח שטוח 2,4

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מאגרים וריאגנטים

  1. מדיית גדילת תאים (עבור תאי HepG2/C3A): הוסף סרום בקר עוברי (FBS) (10% v/v), חומצות אמינו לא חיוניות (1% v/v), תוסף L-גלוטמין (1% v/v) ופניצילין/סטרפטומיצין (0.5% v/v) למדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM, המכיל 4.5 גרם/ל' גלוקוז). מדיית הצמיחה מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לכל היותר.
  2. תמיסת 200 mM נתרן בוטיראט (NaBut): כדי להכין 10 מ"ל, resuspend 220.18 מ"ג של NaBut ב 10 מ"ל של ddH2O. אחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C (76 °F). לפני הטיפול בתא, סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים בקוטר 0.45 מ"מ והוסף 1 מ"ל של התמיסה המסוננת ל-9 מ"ל של מדיית גדילת תאים לריכוז עובד של 20 מ"מ.
  3. תמ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, הספרואידים HepG2/C3A טופלו ב-20 mM NaBut וב-10 mM NaSuc, שניהם השפיעו על הרמות הגלובליות של PTMs היסטון (איור 3A). לאחר מכן זוהו וכומתו PTMs של Histone ברמת השאריות הבודדות באמצעות רכישת MS/MS (איור 3B).

כאשר דגימות מופעלות בשכפולים, ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי כדי להעריך את העשרת שינוי הקיפול של PTM בין דגימות, כמו גם את יכולת השחזור של התצפית. הנתונים המוצגים מראים כי פפטידים שעברו שינוי עם אצטילציות מועשרים בספרו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניתוח של PTMs היסטון שונה במהותו מצינור ניתוח הפרוטאומיקה הטיפוסי. לרוב ה-PTMs של היסטון עדיין יש פונקציות ביולוגיות אניגמטיות; כתוצאה מכך, ביאורים כגון Gene Ontology או מסדי נתונים של מסלולים אינם זמינים. קיימים מספר משאבים המקשרים שינויי היסטון עם האנזים האחראי על הקטליזה שלהם או חלבונים המכילים תחומים הקושרים את ה-PTMs האלה (למשל, HISTome36). כמו כן, ניתן לשער את המצב הכולל של הכרומטין כאשר רמות גלובליות של PTMs היסטון מוסדרות. לדוגמה, עלייה כוללת של אצטילציה היסטון או אצילציות אחרות כמו תמצית.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעבדת סידולי מכירה בהכרת תודה לקרן לחקר הלוקמיה (מענק מחקר לחוקר חדש של הוליס בראונשטיין), AFAR (פרס Sagol Network GerOmics), לדירפילד (פרס Xseed), ל-Relay Therapeutics, ל-Merck ולמשרד המנהל של NIH (1S10OD030286-01).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת טריפסין-EDTA 0.05%גיבקו25300054
0.5-20 ומיקרו; L קצות פיפטBRAND13-889-172 (פישר סיינטיפיק)
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהBio-Rad2239480
10 ומיקרו; L פיפטה רב ערוציתBRANDBR7059000 (Millipore Sigma)
מזרק 10 מ"לHenke Sass Wolf14-817-31 (Fisher Scientific)קצה נעילת Luer, בוגר ל-12 מ"ל
10, 20, 200 ו-1000 ומיקרו; L פיפטות חד ערוציותEppendorf14-285-904 (פישר סיינטיפיק)
1000 ומיקרו; קצות פיפט LRainin30389164
18 גרם מחט מזרקAir-Tite14-817-100 (פישר סיינטיפיק)אורך 3 אינץ', קוטר 0.05 אינץ'
200 ומיקרו; L פיפטה רב ערוציתקורנינג4082
2-200 ומיקרו; קצות פיפט LZ740118 מותג(Millipore Sigma)
24 בארות חיבור נמוך במיוחד מיקרופלייטקורנינג07-200-602
75 ס"מ2  בקבוק תרבית תאים בצורת Uקורנינג461464Uלא מטופל, עם מכסה אוורור
צלחת עם חצאית 96 בארAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
AcetoneFisher ScientificA949-1יש להשתמש באצטון קר
אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3)Sigma-AldrichA6141-25G
אמוניום הידרוקסיד פתרוןFisher ScientificAC423300250
תרבית תאים בדרגת מיםCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-12Bioreactor לתרבית תאים תלת מימדית
ClinoStarCelVivoN/AClinostat CO2 חממה ליחידת בקרת תרבית תאים תלת מימדית
CelVivoN/Aטאבלט עבור ClinoStar הגדרות
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובט, ללא L-גלוטמין ופנול אדום
סרום בקר עוברי (FBS)קורנינג35-010-CV
חומצה פורמיתThermo Scientific28905
קולט אדיםMottN/Aדגם 7121000
זכוכית פסטר פיפטהפישר סיינטיפיק13-678-8B9 אינץ', כותנה סתומה, זכוכית בורוסיליקט,
תוסף גלוטגרוקורנינג25-015-CI200 מ"מ L-אנניל-L-גלוטמין
האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)קורנינג21-022-CVתמיסה 1X ללא סידן, מגנזיום ופנול
אדום HPLC אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA955-4
HPLC מים בדרגתפישר סיינטיפיקW6-1
חומצה הידרוכלורית (HCl)פישר סיינטיפיקA481-212
קרחN/AN/A
MEM חומצות אמינו לא חיוניותתמיסת Corning25-025-CI100X
שרף Oasis HLBWaters186007549שרף הידרופילי-ליפופילי מאוזן (HLB) עם 30µ m גודל חלקיקים
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ספקטרומטר מסהתרמו פישר מדעיIQLAAEGAAPFADBMBHQספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה
Oro-Flex I לוחית מסנן פוליפרופילןOrochemOF110096 בארות פלטת מסנן פוליפרופילן עם 10 ומיקרו; M PE פריט
פניצילין-סטרפטומיציןקורנינג30-002-CI100X
תמיסת נייר pHהידריוןZ111848 (סיגמא-אולדריץ')0-13 נייר בדיקת pH
אקדח פיפטהאפנדורףZ666467 (Millipore Sigma)
נימי פולימיקרוMolex50-110-7740 (פישר סיינטיפיק)צינורות נימי סיליקה גמישים התמזגו עם ציפוי פולימיד, 75 ומיקרו; M ID x 363 ומיקרו; M OD
פוליסטירן 10 מ"ל צנרת סרולוגית, סטריליFisher Scientific1367549
פרופיוני אנהידרידSigma-Aldrich240311-50G
צנטריפוגה מקוררתThermo Scientific75-217-420
שרף Reprosil-PurMSWILR13. AQ.0003120 Å גודל נקבוביות, שלב C18-AQ, 3 ומיקרו; M גודל חרוז
מסובבקליי אדמס25477 (מסחר במעבדה האמריקאית)מערבל אגוזים 1105
רצף שונה טריפסיןPromegaV5111
נתרן בוטיראטThermo ScientificA11079
נתרן סוקסינט דיבסיסיסיגמא-אולדריץ'14160-100G
רכז ואקום SpeedVac (1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה)Savant20249 (מסחר במעבדה אמריקאית)
רכז ואקום SpeedVac (96-well)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
קולט אדים סטריליThermo Scientific1375Class II,
חומצה גופרתית מסוג A2 (H2SO4)Fisher Scientific02-004-375Baker ניתח מגיב
ACSתרבית רקמות מטופלת 100 מ"מ x 20 מ"מ צלחתפישר סיינטיפיק08-772-23
חומצה טריכלורואצטית (TCA)Thermo ScientificAC421451000השעיה של 100% w/v במים בדרגת HPLC
חומצה טריפלואורואצטית (TFA)Fisher ScientificPI28904רצף כיתה
סעפת ואקום 96-wellMilliporeMAVM0960R
מערבולתסיגמא-אולדריץ'Z258415
אמבט מיםפישר סיינטיפיקFSGPD10
קצות פיפט רחבים 1000 ומיקרו; LAxygen14-222-703 (פישר סיינטיפיק)
קצות פיפט רחבים 200 ומיקרו; LAxygen14-222-730 (פישר סיינטיפיק)
תמיסה של לא סטרילי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing lin....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Histone ModificationsPost Translational Modifications3D Cell CultureHepatic SpheroidsChromatin StateLiquid Chromatography Mass SpectrometryHistone AcetylationHistone SuccinylationSpheroid FormationNuclei Isolation

מאמרים קשורים