פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש במערכת תרביות תאים תלת-ממדית כדי למדל, לטפל ולנתח שינויי כרומטין במצב כמעט פיזיולוגי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות ברמה הגלובלית של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון במודל תרבית תאים תלת-ממדית של רקמת כבד
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרביות שטוחות של תאי יונקים הן גישה נפוצה במבחנה להבנת הפיזיולוגיה של התא, אך מערכת זו מוגבלת במידול רקמות מוצקות עקב שכפול תאים מהיר באופן לא טבעי. זה מאתגר במיוחד כאשר מידול כרומטין בוגר, מכיוון שתאים המשכפלים במהירות מעורבים לעתים קרובות בשכפול DNA ויש להם אוכלוסייה פוליפלואידית הטרוגנית. להלן זרימת עבודה למידול, טיפול וניתוח של שינויים בכרומטין באמצעות מערכת תרביות תאים תלת-ממדית (3D). באמצעות פרוטוקול זה, קווי תאי קרצינומה הפטוצלולריים גדלים כספרואידים תלת-ממדיים הניתנים לשחזור באינקובטור המספק דיפוזיה פעילה של חומרים מזינים וכוחות גזירה נמוכים. הטיפול בנתרן בוטיראט ונתרן סוקסינט גרם לעלייה באצטילציה של היסטון ובסוקצינילציה, בהתאמה. עליות ברמות של אצטילציה היסטון ותמציתינילציה קשורות למצב כרומטין פתוח יותר. לאחר מכן נאספים כדוריים לבידוד גרעיני התא, שמהם מופקים חלבוני היסטון לניתוח השינויים שלאחר התרגום שלהם. ניתוח היסטון מתבצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב מקוון עם ספקטרומטריית מסה טנדם, ואחריה צינור חישובי פנימי. לבסוף, מוצגות דוגמאות לייצוג נתונים כדי לחקור את התדירות וההתרחשות של סימני היסטון קומבינטוריים.
מבוא
מאז סוף המאהה-19, מערכות תרביות תאים שימשו כמודל לחקר הצמיחה וההתפתחות של תאים מחוץ לגוף האדם 1,2. השימוש בהם הורחב גם כדי לחקור כיצד רקמות ואיברים מתפקדים בהקשרים בריאים וחוליםכאחד 1,3. תאי ההשעיה (למשל, תאי הדם) גדלים בצלחות פטרי או בצלוחיות בצורה חלקה ומתחלפת מכיוון שהם אינם מורכבים במבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) in vivo. תאים שמקורם באיברים מוצקים יכולים לגדול במערכות תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) או תלת-ממדיות. בתרבית דו-ממדית, התאים גדלים בחד-שכבתית שנצמדת למשטח שטוח 2,4
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מאגרים וריאגנטים
- מדיית גדילת תאים (עבור תאי HepG2/C3A): הוסף סרום בקר עוברי (FBS) (10% v/v), חומצות אמינו לא חיוניות (1% v/v), תוסף L-גלוטמין (1% v/v) ופניצילין/סטרפטומיצין (0.5% v/v) למדיום הנשר המהונדס של דולבקו (DMEM, המכיל 4.5 גרם/ל' גלוקוז). מדיית הצמיחה מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לכל היותר.
- תמיסת 200 mM נתרן בוטיראט (NaBut): כדי להכין 10 מ"ל, resuspend 220.18 מ"ג של NaBut ב 10 מ"ל של ddH2O. אחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C (76 °F). לפני הטיפול בתא, סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים בקוטר 0.45 מ"מ והוסף 1 מ"ל של התמיסה המסוננת ל-9 מ"ל של מדיית גדילת תאים לריכוז עובד של 20 מ"מ.
- תמ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרוטוקול זה, הספרואידים HepG2/C3A טופלו ב-20 mM NaBut וב-10 mM NaSuc, שניהם השפיעו על הרמות הגלובליות של PTMs היסטון (איור 3A). לאחר מכן זוהו וכומתו PTMs של Histone ברמת השאריות הבודדות באמצעות רכישת MS/MS (איור 3B).
כאשר דגימות מופעלות בשכפולים, ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי כדי להעריך את העשרת שינוי הקיפול של PTM בין דגימות, כמו גם את יכולת השחזור של התצפית. הנתונים המוצגים מראים כי פפטידים שעברו שינוי עם אצטילציות מועשרים בספרו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הניתוח של PTMs היסטון שונה במהותו מצינור ניתוח הפרוטאומיקה הטיפוסי. לרוב ה-PTMs של היסטון עדיין יש פונקציות ביולוגיות אניגמטיות; כתוצאה מכך, ביאורים כגון Gene Ontology או מסדי נתונים של מסלולים אינם זמינים. קיימים מספר משאבים המקשרים שינויי היסטון עם האנזים האחראי על הקטליזה שלהם או חלבונים המכילים תחומים הקושרים את ה-PTMs האלה (למשל, HISTome36). כמו כן, ניתן לשער את המצב הכולל של הכרומטין כאשר רמות גלובליות של PTMs היסטון מוסדרות. לדוגמה, עלייה כוללת של אצטילציה היסטון או אצילציות אחרות כמו תמצית.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
מעבדת סידולי מכירה בהכרת תודה לקרן לחקר הלוקמיה (מענק מחקר לחוקר חדש של הוליס בראונשטיין), AFAR (פרס Sagol Network GerOmics), לדירפילד (פרס Xseed), ל-Relay Therapeutics, ל-Merck ולמשרד המנהל של NIH (1S10OD030286-01).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת טריפסין-EDTA 0.05% | גיבקו | 25300054 | |
| 0.5-20 ומיקרו; L קצות פיפט | BRAND | 13-889-172 (פישר סיינטיפיק) | |
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 ומיקרו; L פיפטה רב ערוצית | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| מזרק 10 מ"ל | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | קצה נעילת Luer, בוגר ל-12 מ"ל |
| 10, 20, 200 ו-1000 ומיקרו; L פיפטות חד ערוציות | Eppendorf | 14-285-904 (פישר סיינטיפיק) | |
| 1000 ומיקרו; קצות פיפט L | Rainin | 30389164 | |
| 18 גרם מחט מזרק | Air-Tite | 14-817-100 (פישר סיינטיפיק) | אורך 3 אינץ', קוטר 0.05 אינץ' |
| 200 ומיקרו; L פיפטה רב ערוצית | קורנינג | 4082 | |
| 2-200 ומיקרו; קצות פיפט L | Z740118 מותג | (Millipore Sigma) | |
| 24 בארות חיבור נמוך במיוחד מיקרופלייט | קורנינג | 07-200-602 | |
| 75 ס"מ2 בקבוק תרבית תאים בצורת U | קורנינג | 461464U | לא מטופל, עם מכסה אוורור |
| צלחת עם חצאית 96 באר | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | יש להשתמש באצטון קר |
| אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| אמוניום הידרוקסיד פתרון | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| תרבית תאים בדרגת מים | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor לתרבית תאים תלת מימדית |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 חממה ליחידת בקרת תרבית תאים תלת מימדית |
| CelVivo | N/A | טאבלט עבור ClinoStar הגדרות | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובט, ללא L-גלוטמין ופנול אדום |
| סרום בקר עוברי (FBS) | קורנינג | 35-010-CV | |
| חומצה פורמית | Thermo Scientific | 28905 | |
| קולט אדים | Mott | N/A | דגם 7121000 |
| זכוכית פסטר פיפטה | פישר סיינטיפיק | 13-678-8B | 9 אינץ', כותנה סתומה, זכוכית בורוסיליקט, |
| תוסף גלוטגרו | קורנינג | 25-015-CI | 200 מ"מ L-אנניל-L-גלוטמין |
| האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) | קורנינג | 21-022-CV | תמיסה 1X ללא סידן, מגנזיום ופנול |
| אדום HPLC אצטוניטריל | פישר סיינטיפיק | A955-4 | |
| HPLC מים בדרגת | פישר סיינטיפיק | W6-1 | |
| חומצה הידרוכלורית (HCl) | פישר סיינטיפיק | A481-212 | |
| קרח | N/A | N/A | |
| MEM חומצות אמינו לא חיוניות | תמיסת Corning | 25-025-CI | 100X |
| שרף Oasis HLB | Waters | 186007549 | שרף הידרופילי-ליפופילי מאוזן (HLB) עם 30µ m גודל חלקיקים |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ספקטרומטר מסה | תרמו פישר מדעי | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה |
| Oro-Flex I לוחית מסנן פוליפרופילן | Orochem | OF1100 | 96 בארות פלטת מסנן פוליפרופילן עם 10 ומיקרו; M PE פריט |
| פניצילין-סטרפטומיצין | קורנינג | 30-002-CI | 100X |
| תמיסת נייר pH | הידריון | Z111848 (סיגמא-אולדריץ') | 0-13 נייר בדיקת pH |
| אקדח פיפטה | אפנדורף | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| נימי פולימיקרו | Molex | 50-110-7740 (פישר סיינטיפיק) | צינורות נימי סיליקה גמישים התמזגו עם ציפוי פולימיד, 75 ומיקרו; M ID x 363 ומיקרו; M OD |
| פוליסטירן 10 מ"ל צנרת סרולוגית, סטרילי | Fisher Scientific | 1367549 | |
| פרופיוני אנהידריד | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| צנטריפוגה מקוררת | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| שרף Reprosil-Pur | MSWIL | R13. AQ.0003 | 120 Å גודל נקבוביות, שלב C18-AQ, 3 ומיקרו; M גודל חרוז |
| מסובב | קליי אדמס | 25477 (מסחר במעבדה האמריקאית) | מערבל אגוזים 1105 |
| רצף שונה טריפסין | Promega | V5111 | |
| נתרן בוטיראט | Thermo Scientific | A11079 | |
| נתרן סוקסינט דיבסיסי | סיגמא-אולדריץ' | 14160-100G | |
| רכז ואקום SpeedVac (1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה) | Savant | 20249 (מסחר במעבדה אמריקאית) | |
| רכז ואקום SpeedVac (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| קולט אדים סטרילי | Thermo Scientific | 1375 | Class II, |
| חומצה גופרתית מסוג A2 (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker ניתח מגיב |
| ACSתרבית רקמות מטופלת 100 מ"מ x 20 מ"מ צלחת | פישר סיינטיפיק | 08-772-23 | |
| חומצה טריכלורואצטית (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | השעיה של 100% w/v במים בדרגת HPLC |
| חומצה טריפלואורואצטית (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | רצף כיתה |
| סעפת ואקום 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| מערבולת | סיגמא-אולדריץ' | Z258415 | |
| אמבט מים | פישר סיינטיפיק | FSGPD10 | |
| קצות פיפט רחבים 1000 ומיקרו; L | Axygen | 14-222-703 (פישר סיינטיפיק) | |
| קצות פיפט רחבים 200 ומיקרו; L | Axygen | 14-222-730 (פישר סיינטיפיק) |
מקורות
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing lin....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
