הערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED

כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) נמצאת בשימוש נרחב כטכניקה איכותית וכמותית בתחום הכימיה האורגנית ^1,2,3. היתרונות העיקריים של TLC הם שהיא מספקת זיהוי מהיר, דרישות מדגם גמישות, ואינה דורשת ציוד מיוחד⁴. עד כה, למרות שגישות מתקדמות רבות הוקמו, TLC היא עדיין השיטה העיקרית לזיהוי דגימות לא ידועות בתערובת. עם זאת, האתגר של גישה זו הוא היעדר ציוד בטוח וזול לכימות תפוקת הדגימה, במיוחד לפיתוח מעבדות עם תקציבים מוגבלים. המחקר הנוכחי, אם כן, נועד לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה בשילוב עם TLC כדי להעריך את התשואה של הדגימות.

שלא כמו TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) וכרומטוגרפיית גז (GC) עם דרישות דגימה מחמירות, זמן רב ומעורבות של multistep להכנת דגימה ^1,5, TLC הראה מספר יתרונות. ראשית, לצורך הכנת הדגימה, HPLC ו- GC אינם יכולים לזהות את התמצית הגולמית מכיוון שהתמצית הגולמית עשויה לחבר את העמודה של HPLC ו- GC. שנית, כאשר הדגימות אינן מתאימות ל- UV (חשוב לניתוח HPLC) או עם תנודתיות נמוכה (חשוב לניתוח GC), ניתן להחיל TLC על דגימות אלה, והשימוש במגיב הדמיה הופך את הדגימות המבודדות לגלויות על שכבות דקות ^6,7,8. שלישית, עבור משתמשים כלליים, HPLC ו- GC דורשים בדרך כלל זמן רב יחסית לפני שהם עובדים באופן עצמאי, בהשוואה ל- TLC. בנוסף, ניתוח TLC כמותי, המכונה TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), יכול להפוך את המידע על לוח TLC לדיגיטלי באמצעות סורק רגיש במיוחד. עם זאת, העלות של מערכת HPTLC הוא יקר יחסית. ככזה, פיתוח גישה חסכונית ומהירה לכימות דגימות על צלחת TLC הוא נושא חשוב.

שיטות דומות פותחו לכימות תפוקת TLC; לדוגמה, Johnson⁹ דיווח על טכניקה המאפשרת לכמת את הדגימות על צלחת TLC באמצעות סורק שטוח המחובר למחשב. בשנת 2001, El-Gindy et al.10 פיתחו את השיטה TLC- densitometric, אשר שימשה לאיתור התרכובת עם צפיפות אופטית, והטכניקה יושמה גם על ידי Elkady et ^al.11. בשנת 2007, הס² הציג את שיטת ה-TELC (DE-TLC) המשופרת דיגיטלית המיושמת כדי לזהות את התפוקה של תרכובת על צלחת TLC באמצעות מצלמה דיגיטלית בשילוב עם אור UV. הס גם השווה את הבדלי העלויות בין שיטת HPTLC לשיטת DE-TLC והגיע למסקנה כי ניתן להשתמש בשיטת DE-TLC במעבדות תיכון ומכללות בגלל עלותה הזולה². עם זאת, העלות של שיטת TLC-densitometric עדיין הייתה יקרה, והפעלת אור אולטרה סגול דורשת הכשרה מקדימה מספקת למקרה שהמשתמשים עלולים להיחשף לקרינה אולטרה סגולה. לכן, בהתאם ל- TLC, רצוי לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה לכימות תפוקת המדגם.

המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול לגילוי הדגימה על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה, ופיתח מודל רגרסיה עם אמינות גבוהה (ערך ריבועי R גבוה) כדי למדוד את מידות הפסים ולאחר מכן לקבוע את התפוקה המורכבת. לבסוף, נמצא כי שיטת התאורה blue-LED היא בטוחה יחסית (לעומת שיטת גילוי UV), זולה (לעומת. GC, HPLC ו-HPTLC), וגישה יעילה (לעומת שיטת bioassay) לכימות תשואה.

הפרוטוקול הנוכחי מתואר באמצעות lovastatin כדוגמה. לובסטטין הופק מאספרגילוס טראוס בן שבוע.

1. מיצוי תרכובת

הערה: לפרטים על מיצוי תרכובת, ראו איור 1.

1. תרבית אספרגילוס טראוס על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA, ראו טבלת חומרים) בינונית ב-30 מעלות צלזיוס.
2. ייבשו את התרבית בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. העבירו את התרבית המיובשת לצינור של 50 מ"ל באמצעות פינצטה מעוקרת והוסיפו 15 מ"ל אתיל אצטט.
3. נערו את התערובת במרץ על ידי מערבולת במשך דקה אחת ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד.
4. סוניקו את התערובת באמצעות אמבט אולטראסוני של 40 קילוהרץ (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 40°C למשך שעה אחת.
5. סובבו את התערובת בגודל 5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וסננו באמצעות נייר סינון של 11 מיקרומטר.
6. מוציאים את התסנין בנפח שווה של מים סטריליים במשפך מפריד.
7. לאחר הפרדת פאזה, אספו את השכבה האורגנית, ולאחר מכן התאדו במאייד סיבובי (ראו טבלת חומרים). ממיסים את השאריות ב-2 מ"ל של אתיל אצטט.

2. הפרדת התמצית הגולמית לפי עמודת ספיחה בפאזה רגילה (NP)

1. ארזו את העמודה עם ג'ל סיליקה NP כפאזה נייחת, והשתמשו ב-n-הקסאן:אתיל אצטט:חומצה טריפלואורואצטית (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) כשלב הנייד.
2. טען 2 מ"ל של התמצית (שלב 1) על העמודה והוסף את ממס הפאזה הנייד בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה כדי לחמוק מהתמצית.
   הערה: קצב הזרימה נשלט באופן ידני באמצעות stopcock.
3. אמת את השפכים על ידי TLC כדי לאשר את נוכחותו של lovastatin, ולאחר מכן להתאדות במאייד סיבובי ב 45 מעלות צלזיוס עד שהממס מוסר. צעד זה אורך כ-20-25 דקות.
4. ממיסים את השאריות ב-1 מ"ל של אתיל אצטט, ואז מערבבים עם נפח שווה של 1% חומצה טריפלואורואצטית.
5. צנטריפוגות התערובת בגודל 5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ואוספים את השכבה האורגנית בצינור זכוכית חדש.

3. הכנה וטעינה של לוחות כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC)

1. יש לזהות 5 μL של דגימות ותקני לובסטטין (ראו טבלת חומרים) על קו הבסיס של לוח TLC באמצעות פיפטה נימית, ולהשאיר גבול של 1 ס"מ בצידי לוח TLC.
2. יבשו את צלחת ה- TLC במכסה אדים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הניחו את הצלחת בעדינות על ידי מלקחיים בתא זכוכית רוויה המכיל את ממס הפאזה הנייד. מכסים את התא במכסה זכוכית ומאפשרים לצלחת להתפתח במלואה.
4. הסר את הצלחת מהתא כאשר קו הממס מגיע ל -1 ס"מ מראש הצלחת.

4. ניתוח על ידי תאורת ה- LED הכחולה

1. סמן את קו הממס בעיפרון. יבשו את הצלחת במכסה האדים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. לאחר הייבוש, יש להשרות מיד את הצלחת בממס 10% H₂SO₄ , ולאחר מכן לייבש במכסה האדים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. מניחים את הצלחת על לוח החימום עד להופעת הכתמים החומים. ודא שהצלחת אינה מחוממת יתר על המידה, מכיוון שהדבר עלול להקשות על הדמיה של לובסטטין.
4. העבירו את הלוחית לתאורת ה-LED הכחולה וסרקו באמצעות תוכנה חופשית תואמת (MiBio Fluo) (ראו טבלת חומרים).

5. הערכת תשואה לפי מודל הרגרסיה

1. מדוד את ממד הפסים באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים).
2. צור מודל רגרסיה באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים (ראה טבלת חומרים) המבוססת על הריכוזים היורדים של תקני לובסטטין, כולל 1 מ"ג/מ"ל, 0.75 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל ו-0.25 מ"ג/מ"ל.
3. החל את מודל הרגרסיה כדי להעריך את התשואה של הדגימות.

מחקר זה הציג את שיטת תאורת ה-LED הכחולה כדי להעריך את תפוקת התרכובות, ושיטה זו אומתה והושוותה לשיטות ביו-אסאי ו-UV שזוהו (טבלה 1). מודלי הרגרסיה פותחו על בסיס ממדי הפסים וריכוז התקנים לשלוש שיטות, בהתאמה, כדי לחזות את תפוקת הדגימות. ראשית, בתוצאות שיטת הביו-אסאי, ריבוע ה-R בין ממדי אזור העיכוב לתקני לובסטטין היה 0.99, ותפוקת הדגימה הייתה 0.56 מ"ג שנחזתה על ידי מודל הרגרסיה (איור 2). שנית, בשיטת גילוי UV, ריבוע ה-R בין תקני הלובסטטין לבין ממד הפסים על לוחית ה-TLC היה 0.97, ותפוקת הדגימה שנחזתה על-ידי מודל הרגרסיה הייתה 0.53 מ"ג (איור 3). יש לציין ששולי הרצועה היו מטושטשים, ונצפו פסים בעוצמת אות נמוכה יחסית (איור 3A). שלישית, בשיטת תאורת ה-LED הכחולה, ריבוע ה-R בין תקני לובסטטין לממד הפסים בלוח ה-TLC היה 0.98, ותפוקת הדגימה הייתה 0.54 מ"ג שנחזתה על-ידי מודל הרגרסיה (איור 4). התפוקה החזויה באמצעות תאורת ה-LED הכחולה הייתה קרובה יותר לשיטת הביו-אסאי (שנקבעה כבקרה). הממד של הלהקה היה פרופורציונלי לכמות הלובסטטין, והפסים הברורים התקבלו בשיטת התאורה הכחולה-LED. בנוסף, שעות העבודה של שיטות התאורה bioassay, UV-detected ו- blue-LED היו בערך 24 שעות, 2 שעות, ו 1 שעות, בהתאמה; (הערה: שעת עבודה פירושה הזמן הכולל שהושקע בבדיקת התשואה של lovastatin).

איור 1: זרימת העבודה של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: שיטת הבדיקה הביולוגית. (A) ביו-אסאי של לובסטטין נגד נוירוספורה קראסה (דגירה במשך 24 שעות ב-30 מעלות צלזיוס). בסוף הניסוי צולמו לוחות האגר בקוטר 90 מ"מ תחת אור נראה. (B) הריכוזים של שישה תקני לובסטטין היו: מס' 1 (1 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (0.75 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (0.5 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (0.25 מ"ג/מ"ל). מדגם מס' 5 דולל ל-0.25× (1:4). מדגם מס' 6 דולל ל-0.5× (1:2). ממד אזור העיכוב (מ"מ2) נמדד על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על ממד אזור העיכוב של התקנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: צלחת כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC) שנחשפה לאור UV. (A) ה-n-הקסאן:אתיל אצטט (2:3 v/v) שימש כשלב הנייד בניתוח TLC, ולוחית ה-TLC נחשפה לאור UV (365 ננומטר) לאחר השרייה במפתח (10% H2SO4). (B) הריכוזים של שישה תקני לובסטטין היו: מס' 1 (1 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (0.75 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (0.5 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (0.25 מ"ג/מ"ל). מדגם מס' 5 דולל ל-0.25× (1:4). מדגם מס' 6 דולל ל-0.5× (1:2). ממד אזור העיכוב (מ"מ2) נמדד על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על הממד של הפסים הסטנדרטיים של לובסטטין על לוח TLC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: צלחת כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC) שנסרקה על-ידי מאיר ה-LED הכחול. (A) n-הקסאן:אתיל אצטט (2:3 v/v) שימש כשלב הנייד בניתוח TLC, ולוחית ה-TLC נסרקה על-ידי מאיר ה-LED הכחול. (B) הריכוזים של שישה תקני לובסטטין היו: מס' 1 (1 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (0.75 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (0.5 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (0.25 מ"ג/מ"ל). מדגם מס' 5 דולל ל-0.25× (1:4). מדגם מס' 6 דולל ל-0.5× (1:2). ממד אזור העיכוב (מ"מ2) נמדד על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על הממד של הפסים הסטנדרטיים של לובסטטין על לוח TLC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: השוואה בין שלוש שיטות האיתור ששימשו במחקר זה.

לוח 2: השוואה בין שיטות קודמות לבין המחקר הנוכחי.

איור משלים 1: צלחת הכרומטוגרמה בעלת השכבה הדקה (TLC) עם אמפיצילין נסרקה בשיטת תאורת ה-LED הכחולה. (A) אתיל אצטט:מתנול (9:13 v/v) שימש כשלב הנייד בניתוח TLC, ולוחית ה-TLC נסרקה על ידי תאורת ה-LED הכחולה. (B) הריכוז של ארבעה תקני אמפיצילין היה: מס' 1 (100 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (75 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (50 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (25 מ"ג/מ"ל). ממדי הפסים נמדדו על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על הממד של הפסים הסטנדרטיים של אמפיצילין על לוח TLC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: צלחת כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC) עם אפרמיצין שנסרקה בשיטת תאורת ה-LED הכחולה. (A) מתנול: מים (6:5 v/v) שימשו כשלב הנייד בניתוח TLC ולוחית ה- TLC נסרקה על ידי תאורת ה- LED הכחולה. (B) הריכוז של ארבעה תקני אפרמיצין היה: מס' 1 (50 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (40 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (30 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (20 מ"ג/מ"ל). ממדי הפסים נמדדו על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על הממד של הפסים הסטנדרטיים של אפרמיצין על לוח TLC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.