מאמר שיטה

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

DOI:

10.3791/64584

⸱

6 באוקטובר 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות מתוארות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוסים רקומביננטיים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי להתמיר את המכרסם המקומי urothelium המאפשר ביטוי של transgenes או downregulation של תוצרי גנים אנדוגניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בנוסף ליצירת מחסום בעל התנגדות גבוהה, משערים כי השתן המצפה את אגן הכליה, השופכנים, שלפוחית השתן והשופכה הפרוקסימלית חש ומעביר מידע על סביבתו לרקמות שמתחתיו, ומקדם תפקוד והתנהגות של התרוקנות. הפרעה במחסום דרכי השתן, או בתפקוד החושי/מתמר שלו, עלולה להוביל למחלה. חקר האירועים המורכבים האלה נפגע בשל היעדר אסטרטגיות פשוטות לשינוי ביטוי גנים וחלבונים באורותל. מתוארות כאן שיטות המאפשרות לחוקרים לייצר כמויות גדולות של אדנו-וירוס בעל טיטר גבוה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי להפוך מכרסם אורותל ביעילות גבוהה, ובאופן פשוט יחסית. הן cDNA והן RNA מפריע קטן יכולים לבוא לידי ביטוי באמצעות התמרה אדנו-ויראלית, ואת ההשפעה של ביטוי טרנסגנים על תפקוד דרכי השתן ניתן להעריך 12 שעות עד כמה ימים מאוחר יותר. לשיטות אלה ישימות רחבה במחקרים של ביולוגיה נורמלית ולא תקינה של דרכי השתן באמצעות מודלים של חיות עכבר או חולדה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האורותל הוא אפיתל מיוחד המרפד את אגן הכליה, השופכנים, שלפוחית השתן והשופכה הפרוקסימלית1. הוא מורכב משלוש שכבות: שכבה של תאי מטריה ממוינים ומקוטבים מאוד, לעתים קרובות דו-גרעיניים, שפני השטח האפיקליים שלהם שטופים בשתן; שכבת תאי ביניים עם אוכלוסייה של תאים מגבירי מעבר דו-גרעיניים שיכולים ליצור תאי מטריה שטחיים בתגובה לאובדנם החריף; ושכבה אחת של תאי בסיס, תת-קבוצה שלהם מתפקדים כתאי גזע שיכולים לחדש את כל דרכי השתן בתגובה לפגיעה כרונית. תאי מטריה אחראים בעיקר ליצירת מחסום דרכי השתן בעל העמידות הגבוהה, שמרכיביו כוללים קרום אפיקלי (עשיר בכולסטרול וצרברוזידים) בעל חדירות נמוכה למים ולמומסים, וקומפלקס צמתים אפיקלי בעל עמידות גבוהה (המורכב מצמתים הדוקים, צמתים נצמדים, דסמוזומים וטבעת אקטומיוזין קשורה)1 . הן פני השטח האפיקליים של תא המטריה והן טבעת הצומת שלו מתרחבים במהלך מילוי שלפוחית השתן וחוזרים למצבם המלא מראש במהירות לאחר התרוקנות 1,2,3,4,5. בנוסף לתפקידו בתפקוד המחסום, משערים כי לאורותלים יש גם תפקודי חישה ומתמרים המאפשרים לו לחוש שינויים בסביבה החוץ-תאית (למשל, מתיחה) ולהעביר מידע זה באמצעות שחרור מתווכים (כולל ATP, אדנוזין ואצטילכולין) לרקמות הבסיסיות,כולל תהליכים עצביים תת-אורותליים 6,7,8 . עדויות עדכניות לתפקיד זה נמצאות בעכברים חסרי ביטוי דרכי השתן הן של Piezo1 והן של Piezo2, מה שגורם לשינוי בפונקציית ההתרוקנות9. בנוסף, חולדות המבטאות יתר על המידה את החלבון CLDN2 יוצר הנקבוביות בשכבת תאי המטריה מפתחות דלקת וכאב דומים לאלה שנצפו בחולים עם דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית10. משערים כי הפרעה בתפקוד החושי/מתמר או מחסום דרכי השתן עשויה לתרום למספר הפרעות בשלפוחית השתן 6,11.

הבנה טובה יותר של הביולוגיה של השתן במצבים נורמליים ובמצבי מחלה תלויה בזמינותם של כלים שיאפשרו לחוקרים להפחית בקלות את ביטוי הגנים האנדוגניים או לאפשר ביטוי של טרנסגנים ברקמה הטבעית. בעוד שגישה אחת להפחתת ויסות ביטוי גנים היא יצירת עכברי נוקאאוט מותנים של דרכי השתן, גישה זו תלויה בזמינות של עכברים עם אללים פלוקסדיים, היא אינטנסיבית ויכולה להימשך חודשים עד שנים כדי להשלים12. באופן לא מפתיע, אם כן, חוקרים פיתחו טכניקות להדביק או להתמיר את האורותל, מה שיכול להוביל לתוצאות בטווח זמן קצר יותר. שיטות שפורסמו לטרנספקציה כוללות שימוש בשומנים קטיוניים13, אוליגודאוקסינוקלאוטידים אנטי-סנס 14, או חומצות גרעין אנטיסנס הקשורות לחלבון HIV TAT החודר לפפטיד 11-mer15. עם זאת, המוקד של פרוטוקול זה הוא על השימוש בטרנסדוקציה בתיווך אדנובירל, מתודולוגיה נחקרת היטב היעילה בהעברת גנים למגוון רחב של תאים, נבדקה בניסויים קליניים רבים, ולאחרונה שימשה להעברת cDNA המקודד את חלבון הקפסיד COVID-19 למקבלי גרסה אחת של חיסון COVID-1916, 17. לתיאור מעמיק יותר של מחזור החיים של אדנווירוס, וקטורים אדנו-ויראליים ויישומים קליניים של אדנווירוסים, הקורא מופנה להפניה17.

אבן דרך חשובה בשימוש באדנו-וירוסים להעברת האורותל, הייתה דו"ח של Ramesh et al. שהראה טיפולים מקדימים קצרים עם דטרגנטים, כולל N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) שיפור דרמטי בהתמרה של האורותליום על ידי אדנווירוס המקודד β-גלקטוזידאז18. באמצעות מחקר הוכחת עיקרון זה כמדריך, התמרה בתיווך אדנובירל של האורותליום שימשה כעת לביטוי מגוון חלבונים, כולל GTPases ממשפחת ראב, גורמי חילוף גואנין-נוקלאוטידים, שברי מנוע מיוזין, קלאודינים הקשורים לצומת הדוק יוצרי נקבוביות, ו- ADAM17 10,19,20,21,22 . אותה גישה הותאמה לבטא רנ"א מפריע קטן (siRNA), שהשפעותיו ניצלו על ידי ביטוי משותף של גרסאות עמידות ל-siRNA של הטרנסגן22. הפרוטוקול המתואר כאן כולל שיטות כלליות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוס מרוכז מאוד, דרישה לטכניקות אלה, כמו גם התאמות של השיטות של Ramesh et al.18 כדי לבטא טרנסגנים באורותליום ביעילות גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים הכוללים ייצור של אדנווירוסים, הדורשים אישור BSL2, בוצעו תחת אישור של משרדי הבריאות והבטיחות הסביבתית באוניברסיטת פיטסבורג והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית. כל הניסויים בבעלי חיים שבוצעו, כולל התמרה אדנו-ויראלית (הדורשת אישור ABSL2), נעשו בהתאם להנחיות/תקנות הרלוונטיות של מדיניות שירותי בריאות הציבור בנושא טיפול אנושי ושימוש בחיות מעבדה וחוק רווחת בעלי חיים, ובאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג. כפפות, הגנה על העיניים ולבוש מתאים נלבשים לכל ההליכים המערבים וירוסים רקומביננטיים. יש להשליך כל פסולת נוזלית או מוצקה כמתואר להלן. יש להתייחס למצע של בעלי החיים לאחר ההתמרה ולכל פגר של בעלי חיים כתוצאה מכך, כחומרים מסוכנים ביולוגית ולסלק אותם בהתאם למדיניות המוסדית.

1. הכנת מניות אדנווירוס טיטר גבוה

הערה: התמרה יעילה של שלפוחיות מכרסמים תלויה בשימוש במלאי נגיפיים מטוהרים ומרוכזים, בדרך כלל 1 x 107 עד 1 x 108 חלקיקים נגיפיים זיהומיים (IVP) לכל μL. חלק זה של הפרוטוקול מתמקד ביצירת מלאי אדנו-וירוס בעל טיטר גבוה מתכשירי וירוסים קיימים. כל השלבים צריכים להתבצע במכסה מנוע של תרבית תאים באמצעות ריאגנטים וכלים סטריליים. בעוד הזנים הזמינים של אדנו-וירוס המשמשים כיום פגומים בשכפול, רוב המוסדות דורשים אישור להשתמש באדנו-וירוסים ובדנ"א רקומביננטי. זה כולל לעתים קרובות ייעוד של חדר תרביות תאים כמתקן מאושר BSL2 לייצור והגברת אדנווירוסים. כמה שיקולים כלליים כוללים שימוש במסכות, הגנה על העיניים, כפפות ולבוש מתאים בכל שלבי הייצור והטיהור של הנגיף. בעת ביצוע צנטריפוגה, מומלץ להשתמש במכסי בטיחות אם צינורות הצנטריפוגות חסרים מכסים הדוקים. כל החומרים החד-פעמיים, כולל פקקי בטיחות, בקבוקים ורוטורים שעלולים להיות מזוהמים, מטופלים בתמיסה אנטי-ויראלית (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן נשטפים במים או באתנול 70%. פסולת נוזלית מטופלת על ידי הוספת אקונומיקה לריכוז סופי של 10% (v/v). סילוק פסולת נוזלית זו יהיה תלוי במדיניות מוסדית. פסולת מוצקה מושלכת בדרך כלל לפסולת מסוכנת ביולוגית.

  1. תאי HEK293T בתרבית
    1. הפשירו בקבוקון קפוא של תאי HEK293T באמבט מים בטמפרטורה של 37°C והשתמשו בפיפטה של 5 מ"ל כדי להעביר את התאים לצלחת תרבית תאים בקוטר 15 ס"מ. בעזרת פיפטה של 25 מ"ל, הוסיפו לצלחת באיטיות 20 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco המכיל 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי ואנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין (DMEM-FBS-PS). לדגור על התאים באינקובטור תרביות תאים של 37 מעלות צלזיוס המוגז עם 5% (v/v)CO2 עד שהם מגיעים למפגש של 80%-90% (~2 x 107 תאים).
    2. בעזרת פיפטת זכוכית המחוברת למקור ואקום, שואפים את התווך ולאחר מכן שוטפים את התאים על ידי העברת 20 מ"ל PBS סטרילי (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4, 136.9 mM NaCl ו- 8.9 mM Na2HPO4) לצלחת באמצעות פיפטה של 25 מ"ל. שאפו את ה-PBS המשומש, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה של 5 מ"ל כדי להעביר 3 מ"ל של תמיסת פרוטאינאז חמה (37 מעלות צלזיוס) לצלחת, תוך דגירה על המנה באינקובטור תרבית התאים עד שהתאים מתנתקים (~3-4 דקות).
      הערה: ניתן להעריך את יעילות הפרוטאוליזה בצורה הטובה ביותר על ידי הטייה איטית של הצלחת קדימה ואחורה בחיפוש אחר שחרור תאים מכל חלקי הצלחת לתוך הנוזל הנע. תאי HEK293T רגישים לטיפול ממושך בפרוטאינאז וימותו אם יישארו יותר מכמה דקות בתמיסת פרוטאינאז.
    3. השתמש פיפטה 10 מ"ל להעביר 7 מ"ל של DMEM-FBS-PS לצלחת של תאים מנותקים, ולאחר מכן להשתמש באותה פיפטה כדי לשאוף את התאים ואת המדיום. מעבירים את התאים המרחפים לצינור חרוטי של 50 מ"ל, ולאחר מכן מטילים את התאים על ידי צנטריפוגה של המתלה בצנטריפוגה קלינית במהירות נמוכה של 200 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטת זכוכית המחוברת למקור ואקום. השתמש פיפטה 25 מ"ל כדי להשעות מחדש את גלולת התא ב 15 מ"ל של DMEM-FBS-PS.
    4. הוסף 1 מ"ל של תרחיף התא לכל אחת מחמש עשרה צלחות 15 ס"מ המכילות 19 מ"ל של DMEM-FBS-PS.
    5. לגדל את התאים באינקובטור תרבית רקמה עד שהם מגיעים למפגש של 85%-90% (~3-4 ימים).
  2. הכן פתרון וירוס מדולל
    1. הוסף ~ 1.5 x 10 9 עד 3 x 109 IVP של מלאי וירוסים קיים (5-10 IVP / תא) לצינור חרוטי 50 מ"ל מלא 45 מ"ל DMEM חסר FBS או אנטיביוטיקה.
      הערה: ניתן להשתמש בריכוז נמוך יותר של הנגיף (1-5 IVP / תא); עם זאת, ייקח זמן רב יותר לייצור וירוסים.
  3. להדביק את התאים בתרבית עם הנגיף.
    1. בעזרת פיפטה מזכוכית המחוברת למקור ואקום, שואפים את התווך מהתאים הכמעט מתמזגים בשלב 1.1.5.
    2. השתמש פיפטה 25 מ"ל כדי להעביר 3.0 מ"ל של תמיסת וירוס מדולל (מוכן בשלב 1.2.1) לכל צלחת תרבית תאים. לאחר מכן, השתמש פיפטה 10 מ"ל כדי להוסיף 7.0 מ"ל של מדיום DMEM (חסר FBS או אנטיביוטיקה) לכל מנה. יש לדגור במשך 60 דקות באינקובטור של תרביות תאים, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל DMEM המכיל 20% (v/v) FBS ו-2x PS לכל מנה.
      הערה: שימוש באחת מ-15 הצלחות כצלחת בקרה (שבה לא מוסיפים וירוס) מקל על זיהוי עיגול תאים ומוות בתאים נגועים בשלב הבא.
    3. דוגרים על התאים באינקובטור תרביות התאים במשך 2-4 ימים עד שרובם מתחילים להתעגל למעלה ו->60% מהתאים התנתקו.
      הערה: אם משתמשים בטיטר תחתון של הנגיף, ייתכן שיחלוף עד שבוע עד שיתרחש מוות תאי. אם מוות תאי אינו מתרחש בתוך שבוע, סביר להניח שיהיה צורך לחזור על התהליך באמצעות טיטר גבוה יותר של הנגיף.
  4. לשחזר וירוס מ lysates התא
    1. השתמש במגרד תאים כדי לגרד את החלק התחתון של כל מנה, לשחרר תאים מחוברים לתוך המדיום.
    2. באמצעות פיפטה של 25 מ"ל, אספו ואגרו את המדיום, התאים ופסולת התאים מכל צלחת תרבית תאים לצינור תרבית תאים חרוטי של 50 מ"ל.
      הערה: כדי לחסוך במשאבים, ניתן לשלב את המדיום משתי מנות לצינור אחד של 50 מ"ל.
    3. משחררים את החומר התאי באמצעות צנטריפוגה באמצעות צנטריפוגה שולחנית במהירות נמוכה: 5 דקות בטמפרטורת החדר ב-3,000 x גרם. השתמשו בפיפטת זכוכית המחוברת למכשיר ואקום כדי לשאוף את הסופרנטנט.
    4. השתמש פיפטה 10 מ"ל, בשילוב עם טריטורציה, כדי לאחד את כל החומר הכדורי שנוצר בסך הכל 7 מ"ל של 100 mM מסונן סטרילי Tris-HCl pH 7.4 המכיל 10 mM EDTA (תמיסת Tris-EDTA). מעבירים את החומר המאוגד לצינור חרוטי סטרילי של תרבית תאים בנפח 15 מ"ל ומניחים על קרח.
      הערה: בשלב זה, ניתן להקפיא את הכנת הנגיף ב -80 °C ללא הגבלת זמן.
  5. הכנת ליזטים של תאים
    1. בצע שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כדי לשבש את התאים הנותרים, ובכך לשחרר עוד יותר את חלקיקי הנגיף שנוצרו. הקפיאו את החומר המצטבר בשלב 1.4.4 על ידי טבילת הצינור בחנקן נוזלי (~30-60 שניות). הפשיר במהירות את הדגימה על ידי הצבת הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. מערבלים את הדגימה במשך 15 שניות, ולאחר מכן חוזרים על הליך ההקפאה וההפשרה המהיר פי 2 נוספים.
      הערה: ניתן להפשיר במהירות את תמיסת הנגיף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, אך נדרשת זהירות מכיוון שתנודות הטמפרטורה עלולות לגרום לצינור להיסדק, ולשחרר תמיסת וירוס לאמבט המים. כדי למנוע זאת, הניחו את הצינור המכיל את הסופרנאטנט הנגיפי לתוך צינור גדול יותר, אשר לאחר מכן מוגדר באמבט המים.
    2. השתמש פיפטה 10 מ"ל כדי להעביר את החומר התאי מופשר שלוש פעמים בהקפאה לצינור צנטריפוגה במהירות סופר. צנטריפוגה את החומר בצינור במשך 30 דקות ב 4 ° C צנטריפוגה סופר מהירה ב ~ 18,500 x גרם.
    3. לשחזר את ~ 7 מ"ל של supernatant עשיר וירוס עם פיפטה 10 מ"ל ולהעביר אותו צינור חרוטי 15 מ"ל. שמרו את הדגימה על קרח עד לשלב הבא.
      הערה: בשלב זה, שקול לשמור aliquot של supernatant ויראלי לא מטוהר כמבוא להתחיל הכנה וירוס חדש (או כגיבוי). אחסן aliquot זה ב -80 °C.
  6. בודד וטיהר את הנגיף באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות.
    1. הכן שיפוע לא רציף של CsCl בצינור אולטרה-צנטריפוגה שקוף PET בעל דופן דקה של 12 מ"ל (ראה טבלת חומרים) או שווה ערך. השתמש מזרק 3 מ"ל מצויד מחט 18 G כדי להציג בזהירות 2.5 מ"ל של 1.4 גרם / מ"ל תמיסת CsCl לתוך החלק התחתון של הצינור, ולאחר מכן להשתמש מזרק חדש / מחט כדי שכבה עם 2.5 מ"ל של 1.25 גרם / מ"ל פתרון CsCl.
      הערה: הטלת תמיסות ישירות על גבי שכבה קיימת תגרום לערבוב משמעותי ולא רצוי. במקום זאת, הניחו את החלק המשופע של המחט כנגד קצה הצינור, ואז לחצו לאט מאוד על בוכנה המזרק, והעלו את מיקום המחט כאשר התמיסה ממלאת את הצינור.
    2. טען את ~ 7 מ"ל של supernatant נגיפי על גבי שיפוע באופן דומה באמצעות מזרק 10 מ"ל. אם יש יותר מ 2-3 מ"מ של רווח בין supernatant ויראלי לבין החלק העליון של הצינור, להוסיף פתרון Tris-EDTA נוסף כדי למלא את הצינור עד רק 2-3 מ"מ של מקום נשאר.
    3. הכינו צינור איזון שהוכן באופן דומה, המכיל שכבות של CsCl, אך מחליף את תמיסת Tris-EDTA בסופרנטנט הנגיפי.
      הערה: שני הצינורות חייבים להיות בעלי משקל זהה (וצפיפויות דומות) כדי למנוע מצב עומס לא מאוזן שעלול להיות מסוכן באולטרה-צנטריפוגה.
  7. בודדו את הנגיף באמצעות אולטרה-צנטריפוגה קצבית-אזורית.
    1. טען את שיפועי הצבע שנוצרו בשלבים 1.6.2-1.6.3 לתוך דליים של רוטור SW41 או שווה ערך. הברג במכסי דלי, הכנס את הרוטור לאולטרה-צנטריפוגה (מקוררת מראש ל -4 מעלות צלזיוס), וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב~ 150,000 x גרם.
    2. במהלך הצנטריפוגה, אזן את העמודה המתוארת בשלב 1.9.1 להלן.
  8. שחזור חלקיקי וירוס מבודדים
    1. בסוף שלב הצנטריפוגה, נתקו בזהירות את הדליים מהרוטור, ובמכסה מנוע של תרבית תאים, הסירו את מכסי הדלי, ואז הסירו את הצינורות והניחו אותם במתלה.
    2. אספו את החומר הפסים, העשיר בחלקיקי וירוסים, שצף בממשק שבין תמיסת CsCl של 1.25 גרם/מ"ל ו-1.4 גרם/מ"ל. מחזיקים את הצינור המכיל את השיפוע מעל החצי התחתון של צלחת תרבית תאים (אשר יתפוס את כל החומרים שנשפכו), להשתמש 1 אינץ '18 G מחט מחובר מזרק 3 מ"ל כדי לנקב בזהירות את הצינור, ממש מתחת וירוס פסים. לאט לשאוף את הנגיף, אשר בדרך כלל התאושש ~ 1 מ"ל.
    3. הסר את המחט מהצינור, מה שיגרום לחומר שנותר בשיפוע לזרום החוצה מהצינור לחצי התחתון של צלחת תרבית התאים (יש להתייחס לכל נוזל כפסולת מסוכנת).
    4. מעבירים את תמיסת הנגיף במזרק לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי על קרח.
      הערה: בעת שחזור הנגיף בשלב זה, מקם את המחט כך שלומן המחט פונה כלפי מעלה כאשר המחט נפתחת כמה מ"מ מתחת לרצועה העשירה בנגיף. הימנעו מזיהום על-ידי הרצועה הדקה של וירוס שהורכב בצורה לא נכונה, שלפעמים נצפית 2-3 מ"מ מעל הנגיף הפסים (ראו חץ שחור דק באיור 1A).
  9. הסר CsCl מהדגימה על ידי סינון ג'ל.
    1. יש לאזן עמוד PD-10 (ארוז מראש עם Sephadex G-25M), מהודק למעמד תמיכה, עם 50 מ"ל של PBS מסונן סטרילי 0.2 מיקרומטר המכיל 10% (v/v) גליצרול.
      הערה: שלב שיווי המשקל הראשוני אורך 2-3 שעות והוא הכרחי כדי להבטיח שטיפה מלאה של חומרים משמרים המשמשים את היצרן לייצוב העמודה.
    2. אפשר לתמיסת השטיפה לסגת מתחת לפריט (דיסק מגן של חומר לבן בחלק העליון של מדיום העמודה), ולאחר מכן העבר בזהירות את תמיסת הווירוסים המטוהרים שנאספה בשלב 1.8 לראש העמודה. אפשר לתמיסה העשירה בווירוסים לסגת מתחת לפריט, ולאחר מכן התחל למלא את העמודה עם PBS-גליצרול.
      הערה: פונקציה אחת של frit היא למנוע מהעמודה להתייבש. כתוצאה מכך, עיכובים קצרים נסבלים לפני הוספת יותר eluant לעמודה.
    3. לאסוף את eluate ב 12 צינורות microcentrifuge סטריליים, 0.5 מ"ל לכל שבר.
  10. לקבוע את התשואה הנגיפית.
    1. קבע את שיא שברי הווירוסים באמצעות ספקטרופוטומטריה. הכינו דילול של 1:100 מכל שבר ב-PBS ומדדו את OD260 בספקטרופוטומטר, תוך שימוש בדילול של 1:100 של חיץ בלבד כריק. חלקיקי הנגיף צריכים להיפלט בנפח הריק, החל מחלק 6 בערך. אחסן את השברים המכילים את קריאות OD260 הגבוהות ביותר.
    2. בצע דילול של 1:100 של השברים הנגיפיים המצטברים ומדוד מחדש את OD260. חשב את הריכוז הסופי של חלקיקי הנגיף ואת מספר ה- IVP בשברים המאוגמים באמצעות הנוסחה הבאה: חלקיקי וירוס לכל מ"ל = OD260 × 100 (זה מתקן עבור גורם דילול) × 1012. הערכה כללית היא כי 1% מחלקיקי הנגיף הם IVP, וכך: IVP/mL = OD 260 × 100 × 10 10 או IVP/μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. Aliquot את שברי הנגיף המאוחדים (המכילים 5 x 10,7 עד 1 x 10,8 IVP) לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות או cryovials. אחסן את הדגימות ב -80 ° C.

2. התמרה של שלפוחית השתן מכרסם

הערה: אם טכניקה זו חדשה, מומלץ להגביל את מספר בעלי החיים המומרים בו זמנית ל 2-4. ניתן להשיג זאת על ידי קביעת זמני ההתחלה של כל בעל חיים, במיוחד במהלך הטיפול בחומרי ניקוי בשלב 2.2, ולאחר מכן דגירה של הנגיף בשלב 2.3. חוקרים מנוסים יכולים להמיר עד שישה בעלי חיים בכל פעם.

  1. צנתור שלפוחית השתן
    1. הרדימו נקבות עכברי C57Bl/6J (בדרך כלל בנות 8-10 שבועות, ~20-25 גרם) או נקבות חולדות Sprague Dawley (בדרך כלל בנות 2-3 חודשים, ~250 גרם) באמצעות וופורייזר עם חרוט אף מחובר. כיילו את הוופורייזר לייצור איזופלורן 3.0% (v/v), 97% (v/v) O 2 לעכברים או 4.0% (v/v) איזופלורן, 96% (v/v) O2 לחולדות. ודא כי בעלי החיים מורדמים על ידי וידוא שהם אינם מגיבים צביטת הבוהן (בדרך כלל לאחר 1-2 דקות).
    2. שמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים על ידי הנחת החיות על כרית מחוממת. עקוב אחר בעל החיים לאורך כל פרוטוקול ההעברה כדי לוודא שבעלי החיים מורדמים ואינם חווים כאב במהלך הליך זה.
    3. הפחיתו את האיזופלורן ל-1.5% (v/v) בעכברים או ל-2.0% (v/v) לחולדות והחזיקו את בעלי החיים תחת הרדמה למשך הפרוטוקול.
    4. כדי למנוע החדרת אוויר לשלפוחית השתן, מלא את חלק הצנתר הפלסטי של צנתר IV (ראה טבלת חומרים) ואת הרכזת המשויכת ל- PBS סטרילי באמצעות פיפטת העברה.
    5. כאשר בעל החיים במצב שכיבה, מקלונים את הבשר החיצוני עם 70% אלכוהול, ומכניסים את הצנתר הסטרילי לתוך הבשר החיצוני, ואז את השופכה, ולאחר מכן לתוך שלפוחית השתן.
      1. כדי לבצע משימה זו, השתמש במלקחיים עדינים כדי לתפוס בעדינות את הרקמה היוצרת את הבשר החיצוני ולהאריך אותו אנכית, הרחק מהחיה. בעזרת היד השנייה, מחדירים בזהירות את הצנתר אנכית כ-3-4 מ"מ לתוך השופכה (תלולית בשר ממש מעל פתח הנרתיק). לאחר מכן, בגלל כיפוף בשופכה, מורידים את הצנתר, המוחדר לבשר החיצוני, לכיוון זנב החיה, מה שמקל על כניסתו לחלק של השופכה שעובר מתחת לעצם הערווה, ובסופו של דבר לתוך שלפוחית השתן
        . הערה: במיוחד במקרה של העכבר, הצנתר עשוי להיות ארוך מדי, ולא יותר מ 1.0-1.1 ס"מ ממנו צריך להיות מוכנס לתוך החיה. אחרת, ייגרם נזק לרירית שלפוחית השתן. כדי למנוע זאת, סמן את הצנתר ~ 1 ס"מ מתחת לקצהו, ולאחר מכן אל תכניס את הצנתר מעבר לסימון זה.
    6. יש לאפשר לשתן בשלפוחית השתן לדלוף החוצה. הסירו שאריות שתן על ידי ביצוע התמרון של Credé: לעסות וללחוץ בעדינות על בליטת שלפוחית השתן באזור הבטן התחתונה.
  2. הפוך את האורותליום פתוח להתמרה על ידי טיפול בו עם תמיסת דטרגנט.
    1. שטפו את העכבר או שלפוחית השתן של החולדה על ידי חיבור מזרק סטרילי בנפח 1 מ"ל מלא PBS לרכזת הצנתר. הזריקו 100 מיקרוליטר PBS סטרילי לשלפוחית השתן של העכבר (או 450 מיקרוליטר במקרה של שלפוחית השתן של החולדה). יש לנתק את המזרק מהתאמת הצנתר ולאפשר ל-PBS להתנקז. במידת הצורך, בצעו תמרון Crede לסילוק עודפי נוזל שלפוחית השתן.
    2. להחדיר 100 μL של 0.1% (w/v) N-דודציל-β-D-מלטוזיד (DDM) (מומס ב-PBS ו-0.2 מיקרומטר מסונן-מעוקר) לשלפוחית העכבר באמצעות מזרק סטרילי של 1 מ"ל. שמור את ה- DDM בשלפוחית השתן למשך 10 דקות על ידי השארת המזרק במקומו. בחולדות, נפח DDM גדל ל 450 μL.
    3. הסר את ה- DDM משלפוחית השתן על ידי ניתוק המזרק ולאפשר לו להתנקז החוצה. בצע את התמרון של Crede במידת הצורך.
  3. הכניסו את הנגיף לשלפוחית השתן.
    1. חבר מזרק סטרילי 1 מ"ל לרכזת הצנתר והחדיר 0.5 x 107 עד 1 x 108 IVP של אדנווירוס (מוכן בשלב 1), מדולל ב 100 μL של PBS סטרילי עבור עכברים או 450 μL עבור חולדות, לתוך שלפוחית השתן. השאירו את המזרק מחובר לקטטר כדי למנוע מתמיסת הנגיף לברוח.
    2. לאחר 30 דקות, נתקו את המזרק ואפשרו לתמיסת הנגיף לפנות את שלפוחית השתן אל פד חד פעמי. יש להכתים כל תמיסת וירוס שארית עם מגבון סופג, ולהשליך את הפד ולנגב בפסולת מסוכנת ביולוגית.
      הערה: גליצרול הוא ציטוטוקסי. לפיכך, הנפח המרבי של תמיסת וירוס המוחדרת לעכברים מוגבל ל -5 μL (אשר כאשר מדולל ל -100 μL של PBS יגרום לריכוז גליצרול סופי של ~0.5% [v/v]). בנוסף, ניתן לשפר את יעילות ההולכה על ידי הגדלת מספר ההפריה החוץ גופית המוחדרת ועל ידי הארכת הדגירה של הנגיף ל -45 דקות.
    3. שלב אופציונלי: ניתן לשטוף את שלפוחית השתן עם PBS כמתואר בשלב 2.2.1 לעיל; עם זאת, זה לא נדרש.
  4. אפשרו לבעל החיים להתאושש.
    1. להפסיק את זרימת האיזופלורן ולאפשר לבעל החיים להתאושש ולהיות נייד לחלוטין לפני החזרתו לכלוב שלו, במיוחד אם החיות שוכנות בקבוצה.
      הערה: מכיוון שהתמרה של הנגיף כשלעצמה אינה גורמת לתסמינים או כאבים בדרכי השתן התחתונות הניתנים לצפייה, בדרך כלל אין צורך בטיפול לאחר הניתוח. עם זאת, אם הטרנסגן המקודד רעיל, ייתכן שיהיה צורך במשככי כאבים או אנטיביוטיקה לאחר ההליך כנדרש על ידי המוסד.
  5. לנתח את ההשפעות של ביטוי טרנסגנים 12-72 שעות לאחר הטיפול באמצעות שיטות כגון mRNA in situ hybridization, כתם מערבי, או immunofluorescence 9,10,23 (ראה את התוצאות המייצגות).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת וירוסים
דוגמה לטיהור וירוסים על-ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות מוצגת באיור 1A. הפס הוורוד בהיר, שנמצא בממשק של החומר התאי הטעון ושכבת CsCl של 1.25 גרם/מ"ל, מורכב בעיקר מתאים משובשים והפסולת שלהם (ראו חץ מגנטה באיור 1A). צבעו הוורדרד שואב מהכמות הקטנה של מדיום התרבות שמועבר משלב 1.5 בפרוטוקול. חלקיקי הנגיף המעניינים, שמופיעים כפס לבן חלבי, נמצאים בממשק של תמיסות CsCl במשקל 1.25 גרם/מ"ל ו-1.40 גרם/מ"ל CsCl (ראו חץ צהוב

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד ראמש ועמיתיו התמקדו בפיתוח אסטרטגיות לשימוש בהתמרה אדנו-ויראלית בטיפול בסרטן שלפוחית השתן 18, דיווחים עדכניים יותר הדגימו את התועלת של טכניקות אלה בחקר ביולוגיה / פיזיולוגיה של דרכי השתן ופתופיזיולוגיה תקינה 10,18,19,20,21 . המאפיינים החשובים של גישה זו כוללים: (i) בשלמות דופן שלפוחית השתן של המכרסם, רק האורטליום מומר 10,19,20,21,2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרס פרויקט פיילוט באמצעות P30DK079307 (ל- M.G.D.), מענק NIH R01DK119183 (ל- G.A. ו- M.D.C.), מענק NIH R01DK129473 (ל- G.A.), פרס פיתוח קריירה של האגודה האמריקאית לאורולוגיה ומענק קרן וינטרס (ל- N.M.), על ידי פיזיולוגיה של התא וליבות הדמיית כליות של אורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307), ועל ידי S10OD028596 (ל-G.A.), שמימנה את רכישת המערכת הקונפוקלית ששימשה ללכידת חלק מהתמונות המוצגות בכתב יד זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 מ"ל פיפטהקורנינג קוסטאר (Millipore Sigma)CLS4488פיפטה סטרילית, סרולוגית, עטופה בנפרד
12 מ"ל צינור אולטרה צנטריפוגה 12 מ"לThermoFisher06-752PET צינור אולטרה צנטריפוגה דק
דופן 15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיפלקון (קורנינג)352097מחט סטרילית
18 גרם BD 30519618 גרם x 1.5 במחט
20 מ"ל פיפטהקורנינג קוסטאר (Millipore Sigma)CLS4489פיפטה סטרילית, סרולוגית, עטופה בנפרד
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיפלקון (קורנינג)352098
פיפטה סטרילית 5 מ"לקורנינג קוסטאר (Millipore Sigma)CLS4487פיפטה סטרילית, סרולוגית, עטופה בנפרד
Cavicideהנרי Schein6400012תמיסה אנטי ויראלית
צלחת תרבית תאים - 15 ס"מפלקון (קורנינג)353025סטרילי, מטופל בתרבית רקמות  (צלחת 150 מ"מ x 25 מ"מ)
מגרד תאיםSarstedt893.1832אורך ידית 24 ס"מ, אורך להב 1.7 ס"מ
CsClMillipore SigmaC-4306ביולוגיה מולקולרית כיתה ≥ 98%
תרבית DMEM בינונית (גלוקוז גבוה)Gibco (ThermoFisher)11965092עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז + L-גלוטמין + פנול אדום
EDTAMillipore SigmaEDSBioiultra grade ≥ 99%
סרום בקר עוברי Hyclone (Cytiva)SH30070.03מוגדר בסרום
פיפטה זכוכיתפישר סיינטיפיק13-678-20A5.75 בפיפטה מזכוכית, גליצרול חיטוי
Millipore SigmaG-5516ביולוגיה מולקולרית בדרגה ≥ 99%
תאי HEK293ATCCCRL-3216HEK293T הם גרסה של תאי HEK293 המבטאים את SV40 T-antigen
Isofluraneצנתר Covetrus29405
IV - עכברSmith Medical Jelco306324 G x 3/4 בבטיחות צנתר IV 
צנתר IVחולדה Smith Medical Jelco306022 G x 1 בבטיחות צנתר IV רדיופאק
KClMillipore SigmaP-9541ביולוגיה מולקולרית בדרגה ≥ 99%
KH2PO4Millipore SigmaP5655דרגת תרבית תאים  ≥ 99%
Na2HPO4& bull; 7 H2OMillipore Sigma431478  ≥ 99.99%
NaClMillipore SigmaS3014ביולוגיה מולקולרית בדרגה ≥ 99%
N-דודציל-&בטא;-D-מלטוזיד Millipore SigmaD4641  ≥ 98%
חרוט אף למספר בעלי חייםמסחריות בעיצובכוללות אחת מעמודת Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 GE Healthcare17-085-01עמודים ארוזים מראש מלאים באנטיביוטיקה של Sephadex G-25M
פניצילין/סטרפטומיצין (100x)Gibco (ThermoFisher)15070063תמיסה מרוכזת פי 100
ספקטרופוטומטרEppendorf מעמד ומהדק ביופוטומטר
פישר סיינטיפיק14-679Q ו-05-769-8FQזמין מספקים רבים
יחידת סינון סטריליתפישר סיינטיפיק (נלג'ן)09-740-65B0.2 ומיקרו; m יחידת מסנן זרימה מהירה (150 מ"ל)
יחידת מסנן סטרילית 0.2 ומיקרו; מ (מזרק)פישר סיינטיפיק SLGV004SLMillipore Sigma Milex 0.22 ומיקרו; m יחידת פילטר המתחברת למזרק
צנטריפוגה סופר מהירהEppendorf 5810Rעם רוטור זווית קבועה Eppendorf F34-6-38 (12,000 סל"ד)
מזרק (1 מ"ל)BD 309628מזרק 1 מ"ל קצה Luer-lok - מזרק סטרילי
(3 מ"ל)BD 309656קצה החלקה של מזרק 3 מ"ל - סטרילי
צנטריפוגה שולחנית (מהירות נמוכה)Eppendorf 5702עם רוטור דלי מתנדנד
פיפטות העברהפישר סיינטיפיק13-711-9AMפוליאתילן 3.4 מ"ל פיפטה העברה
Tris-baseMillipore Sigma648310-Mכיתה ביולוגיה מולקולרית 
תמיסת פרוטאז נבחרת TrypLEGibco (ThermoFisher)12604013אנזים אקספרס TrypLE (1x), ללא פנול
אדום אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטראופטימה L-80 XPעם רוטור בקמן SW41 (41,000 סל"ד)
וופורייזר שירותי הרדמה כללית, בע"מTec 3Isoflurane
Vaporizer מערבל מערבולתVWR10153-838מערבל מערבולת אנלוגי
רדיופאק - אפשרויות אישי מערבולת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463(2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804(2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888(2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western BlotmRNA in situClaudin 2

מאמרים קשורים