מאמר שיטה

שימור מולקולרי אוניברסלי עם מיקרוסקופ הרחבה פי 11

6.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65338

⸱

6 באוקטובר 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

במאמר זה

סיכום

מוצגת כאן גרסה חדשה של מיקרוסקופ הרחבה (ExM), Magnify, המותאמת להרחבה של עד פי 11, תוך שימור מערך מקיף של מחלקות ביומולקולות, ותואמת למגוון רחב של סוגי רקמות. הוא מאפשר לחקור את התצורה הננומטרית של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלי עקיפה.

תקציר

הדמיה ננומטרית של דגימות ביולוגיות יכולה לשפר את ההבנה של פתוגנזה של מחלות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ הרחבה (ExM) הוכח כחלופה יעילה וזולה למיקרוסקופ אופטי ברזולוציית על. עם זאת, הוא הוגבל על ידי הצורך בסוכני עיגון ספציפיים ולעתים קרובות מותאמים אישית כדי לשמור על מחלקות ביומולקולות שונות בתוך הג'ל ועל ידי קשיים בהרחבת פורמטים סטנדרטיים של דגימות קליניות, כגון רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין, במיוחד אם רוצים גורמי התפשטות גדולים יותר או אפיטופים חלבוניים משומרים. במאמר זה אנו מתארים את Magnify, שיטת ExM חדשה להרחבה חזקה עד פי 11 במגוון רחב של סוגי רקמות. על ידי שימוש במתקרולאין כעוגן כימי בין הרקמה לג'ל, Magnify שומרת על ביומולקולות מרובות, כגון חלבונים, שומנים וחומצות גרעין, בתוך הג'ל, ובכך מאפשרת הדמיה ננומטרית רחבה של רקמות על מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מתאר שיטות עבודה מומלצות כדי להבטיח הרחבת רקמות חזקה ונטולת סדקים, כמו גם טיפים לטיפול והדמיה של ג'לים מורחבים מאוד.

מבוא

מערכות ביולוגיות מפגינות הטרוגניות מבנית, החל מהגפיים והאיברים ועד לרמות החלבונים בסקאלה הננומטרית. לכן, הבנה מלאה של פעולת מערכות אלה מחייבת בחינה ויזואלית על פני קני מידה אלה. עם זאת, מגבלת העקיפה של האור גורמת לאתגרים בהדמיה של מבנים קטנים מ~200-300 ננומטר במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. בנוסף, שיטות אופטיות ברזולוציית על 1,2,3, כגון דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופ לוקליזציה מופעל אור (PALM), מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), למרות שהן חזקות, מציבות אתגרים משלהן, מכיוון שהן דורשות חומרה וריאגנטים יקרים ולעתים קרובות יש להן זמני רכישה איטיים ויכולת ירודה לצלם נפחים גדולים בתלת-ממד.

מיקרוסקופ הרחבה4 (ExM) מספק אמצעי חלופי לעקוף את גבול העקיפה של האור על ידי עיגון קוולנטי של ביומולקולות לג'ל פולימרי מתנפח במים ומשיכה פיזית שלהן זו מזו, ובכך להפוך אותן לפתרון במיקרוסקופ אופטי קונבנציונלי. מספר רב של גרסאות פרוטוקול ExM פותחו מאז הפרסום המקורי של ExM לפני פחות מעשור, ופרוטוקולים אלה מאפשרים שילוב ישיר של חלבונים 5,6,7, RNA 8,9,10, או שומנים11,12,13 לתוך רשת הג'ל על ידי שינוי העוגן הכימי או הרחבת הדגימה עוד יותר (ובכך לשפר את הרזולוציה האפקטיבית) בשלב אחד14 או בשלבים איטרטיביים מרובים15,16. עד לאחרונה, אף פרוטוקול ExM יחיד לא יכול היה לשמור על שלוש מחלקות ביומולקולות אלה עם עוגן כימי יחיד הזמין מסחרית תוך מתן ג'ל חזק מכנית שיכול להתרחב ~ פי 10 בסבב התפשטות יחיד.

כאן, אנו מציגים את Magnify17, תוספת עדכנית לארסנל ExM המשתמשת במתקרולאין כעוגן ביומולקולה. מתקרוליין יוצר קשרים קוולנטיים עם רקמה כמו זו של פרפורמלדהיד, מה שמבטיח שניתן לשמור על סוגים מרובים של ביומולקולות בתוך רשת הג'ל ללא צורך בסוכני עיגון ספציפיים או מותאמים אישית. בנוסף, טכניקה זו יכולה להרחיב ספקטרום רחב של רקמות עד פי 11, כולל דגימות מאתגרות לשמצה כגון דגימות קליניות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE). שיטות קודמות להרחבת דגימות קשיחות מכניות כאלה דרשו עיכול פרוטאז קשה, מה שהפך את סימון הנוגדנים של חלבונים מעניינים לבלתי אפשרי לאחר הרחבת הדגימה. לעומת זאת, שיטה זו משיגה הרחבה של דגימות קליניות מסוג FFPE באמצעות תמיסת דנטורינג חם, ובכך משמרת אפיטופים של חלבונים שלמים בתוך הג'ל, שניתן לכוון אליהם לצורך הדמיה לאחר הרחבה (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים המערבים בעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קרנגי מלון. דגימות רקמה אנושית הושגו באופן מסחרי.

1. הכנת ריאגנטים מלאי ופתרונות

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של הריאגנטים שבהם נעשה שימוש.

  1. הכינו את פתרונות מלאי הג'לינג. אלה ישולבו מיד לפני שלב הג'ל.
    1. הכן את תמיסת מלאי המונומרים (4 גרם/100 מ"ל N,N- חומצה דימתילאקרילאמיד [DMAA], 50 גרם/100 מ"ל נתרן אקרילט [SA], 66.7 גרם/100 מ"ל אקרילאמיד [AA], 0.10 גרם/100 מ"ל N,N′-מתילן ביסקרילאמיד [Bis], 33 גרם/100 מ"ל נתרן כלורי [NaCl], 1x מלח חוצץ פוספט; PBS) באמצעות הרכיבים המפורטים בטבלה 1. להמיס או לדלל את כל תמיסות המלאי במים. ניתן לאחסן את תמיסת מלאי המונומר ב -4 מעלות צלזיוס למשך 3 חודשים לפחות.
    2. הכינו את תמיסות המלאי הבאות בנפרד במים: 0.5% (w/w) 4-Hydroxy-TEMPO (4HT), המעכב ג'לציה במהלך דיפוזיה מונומרית לתוך הרקמות, ו-10% (w/w) tetramethylethylenediamine (TEMED), המאיץ את הייצור הרדיקלי ביוזמת אמוניום פרסולפט (APS) ומוכן ב-10% (w/w).
      הערה: ניתן לחלק את פתרונות המלאי ל- 1-2 מ"ל aliquots ולאחסן ב 4 °C למשך עד 3 חודשים; עם זאת, APS נעשה מיד לפני הכנת פתרון gelling.
  2. הכינו את מאגר ההומוגניזציה (1% w/v S.D.S., 8 M אוריאה, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, בטמפרטורת החדר [R.T.]) על ידי שילוב של 1 גרם SDS, 48.048 גרם אוריאה, 5 מ"ל של EDTA (0.5M, pH 8), 20 מ"ל של 10x PBS, 25 מ"ל של Tris (2 M) ו-0.75 גרם גליצין. יש להוסיף מים לקבלת נפח כולל של 100 מ"ל. ניתן להגדיל או להקטין את הפתרון לפי הצורך וניתן לאחסן אותו ב- R.T.

2. הכנת רקמות לשקופיות רקמה קלינית מאוחסנות וטריות שהוכנו לאחרונה

הערה: שלבי עיבוד הרקמה משתנים בהתאם לאופן הכנת הדגימות.

  1. עבור דגימות קליניות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE), בצע את השלבים הבאים.
    1. הניחו את הדגימות בסדרה רציפה של תמיסות (ניתן להשתמש בצנצנת זכוכית מכתימה או בצינור חרוטי 50 מ"ל): קסילן, 95% אתנול, 70% אתנול ו-50% אתנול, ולאחר מכן מים שעברו דה-יוניזציה כפולה. השתמש בכל פתרון פעמיים במשך 3 דקות לפחות בכל פעם. השתמש במלקחיים כדי למקם את השקופית במיכל, והוסף 15 מ"ל של התמיסה המתאימה (מספיק כדי לכסות את הדגימה). הניחו את הצינור החרוטי הסגור אופקית על שייקר בטמפרטורת החדר.
  2. עבור דוגמאות מוכתמות ומותקנות על שקופיות קבועות, בצע את השלבים הבאים.
    1. הניחו את המגלשה לזמן קצר בקסילן, והסירו בזהירות את הכיסויים באמצעות כלי מתאים, כגון סכין גילוח. אם הכיסוי נשאר תקוע, החזירו את המגלשות בקסילן לטמפרטורת החדר עד שהכיסוי יתרופף.
    2. לאחר מכן, עבד את הדגימות כדגימות FFPE (שלב 2.1.1).
      הערה: עבור שקופיות מוכתמות בהמטוקסילין ובאאוזין (H&E), כתם המטוקסילין והאאוסין אובד במהלך תהליך ההתפשטות.
  3. עבור שקופיות רקמה קפואה לא קבועות בתמיסת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), קבע את הרקמות באצטון ב -20 ° C למשך 10 דקות לפני שטיפת הדגימות עם תמיסת PBS 1x שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.
  4. עבור שקופיות רקמה קלינית קפואות שתוקנו בעבר, יש להמיס את ה-OCT על ידי דגירה של המגלשות למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף בתמיסת PBS אחת שלוש פעמים למשך 5 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.

3. הכנת רקמות למוח עכבר קבוע paraformaldehyde

  1. עקוב אחר פרוטוקול זה עבור מקטעי מוח עכבר בעובי 30-50 מיקרומטר.
    הערה: ניתן למצוא הצלחה עם חלקים גדולים יותר, אך ייתכן שיידרשו זמנים ארוכים יותר עבור דיפוזיה והומוגניזציה של תמיסת מונומרים.
  2. אם המקטעים אינם מאוחסנים כעת בתמיסת PBS 1x (לדוגמה, בגליצרול 30% [v/v] ובתמיסת אתילן גליקול 30% [v/v] ב-1x PBS), יש לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם בטמפרטורת החדר ב-1x PBS בצלחת של 6 עד 24 בארות.
  3. השג שקופית מיקרוסקופ זכוכית לא מצופה. אם צד אחד של מגלשת הזכוכית מצופה, השתמשו במברשת צבע רטובה כדי לבדוק את הצד הלא מצופה (לעתים קרובות, התווית של הצד המצופה תהיה עשויה זכוכית טחונה ותהיה פחות אטומה כאשר היא רטובה).
  4. השתמש במברשת צבע כדי להרטיב את השקופית הלא מצופה. הסר את רקמת המוח של העכבר מצלחת הבאר בעזרת המכחול, והנח אותה בזהירות על המגלשה, תוך שימוש בתנועת גלגול כדי להבטיח שהרקמה שטוחה. אפשר PBS עודף להישאר על הרקמה עד שכל החלקים מותקנים.
    הערה: בעוד שניתן להשתמש במגלשת זכוכית בודדת עבור קטעי רקמות מרובים, כאשר יותר קטעי רקמה מרופדים בבת אחת (אפילו בשקופיות נפרדות), יש לנקוט בזהירות רבה יותר כדי להבטיח שהם לא יתייבשו לחלוטין.
  5. באמצעות מטלית נייר מעבדה, הסר את רוב ה- PBS העודפים מהשקופית. השאירו טבעת נוזלית קטנה סביב כל חלק רקמה, אך השאירו את שאר המגלשה יבשה ברובה. נוזל שנותר זה יכסה את הרקמה בזמן הכנת תמיסת מונומר הג'ל.

4. גלינג

הערה: פרוטוקול זה מתאים לכל סוגי הרקמות שהוכנו לשימוש בטכניקה זו.

  1. החילו ספייסרים משני צדי מקטע הרקמה (איור 2A) כדי למנוע דחיסת רקמות. כדי לעשות זאת, הכינו את הספייסרים על ידי חיתוך דק של חתיכות זכוכית כיסוי באמצעות עט עם קצוות יהלום, ולאחר מכן הדקו אותם למגלשה באמצעות כמויות קטנות של מים או 1x PBS, או תקנו אותם באמצעות כמות קטנה של דבק על. לאחר מכן, הניחו בעדינות את הספייסרים משני צדי הרקמה.
  2. הכינו את תמיסת הג'לינג הסופית. באופן כללי, ~ 200 μL מספיק לכל קטע רקמה, אבל נפח לא יעלה על 800 μL לכל שקופית. כל תמיסת ג'ל נוספת תגרום לזליגה.
    הערה: מתקרוליין משמש לעיגון ביומולקולות לתוך הג'ל. עם זאת, אין צורך בשלב עיגון נפרד, וניתן להוסיף מתאקרולאין ישירות לתמיסת הג'לינג הסופית.
    1. בכל קטע, שלב את הדברים הבאים לפי הסדר: 200 μL של תמיסת מונומר, 0.5 μL של 0.5% תמיסת מלאי 4HT (דילול 1:400), 0.2-0.5 μL של מתקרוליין (דילול 1:400-1:1,000 בהתאם לסוג הרקמה; באופן כללי, השתמש בדילול 1:1,000 עבור דגימות קבועות של פרפורמאלדהיד [PFA] ו- 1:400 עבור דגימות קליניות של FFPE), 2 μL של 10% תמיסת מלאי TEMED (דילול 1:100), ו-5 מיקרוליטר של 10% תמיסת מלאי A.P.S (דילול 1:40).
      הערה: יש להכין את תמיסת הג'לינג הסופית מיד לפני השימוש. כדי למנוע ג'לינג מוקדם, הוסף את פתרון APS אחרון.
  3. הסר את התמיסה העודפת מאזור הרקמה, והנח את המגלשה בצלחת פטרי. הוסיפו לדגימה, את כל תמיסת הג'ל הקרה והטרייה, ודגרו על התערובת על הרקמה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לאפשר דיפוזיה לתוך הרקמה.
  4. הניחו מחליק זכוכית שנייה ללא ציפוי בזהירות על תמיסת הרקמה והג'ל. יש להימנע מבועות אוויר (איור 2B).
    הערה: אם בועות אוויר נלכדות מעל הרקמה, ניתן להרים בזהירות את מכסה הזכוכית ולהניח אותו בחזרה למטה. בנוסף, כל תמיסת מונומר שנשפכת החוצה עשויה להיחתך לאחר פילמור ולא תגרום לבעיות ברקמה.
  5. ודא כי פילמור הושלם. פילמור זה יכול להיעשות בשתי דרכים, שכל אחת מהן מניבה תוצאות דומות. ראשית, דגרו על הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה (כגון צלחת פטרי סגורה עם מגבת נייר לחה) למשך הלילה. לחלופין, לפילמור מהיר יותר, דגרו על הדגימות באטמוספירה הלחה במשך שעתיים ב-37°C ולאחר מכן שעה אחת ב-60°C.

5. עיכול מדגם והרחבת רקמות

הערה: פרוטוקול זה מתאים לכל סוגי הרקמות.

  1. כדי להגן על העיניים, החליקו סכין גילוח בין שתי מגלשות הזכוכית של תא הג'לינג כדי להפריד ביניהן.
    הערה: מגלשות הזכוכית אמורות להיפרד בקלות רבה. אם חלקים שונים של הג'ל דבוקים לשתי המגלשות, ניתן להשתמש במברשת צבע כדי להנחות את הג'ל לזה או לזה. אם הג'ל נעשה יבש במיוחד במהלך פילמור, ניתן למרוח 1x PBS על החלק החיצוני של תא הג'ל, אך אין לטבול את הג'ל במלואו, מכיוון שהדבר יגרום לו להתרחב לפני שהרקמה הומוגנית, מה שיגרום לסדקים.
  2. חתוך את הג'ל הריק סביב הרקמה כדי למזער את הנפח. חיתוך הג'ל באופן לא סימטרי מאפשר מעקב אחר כיוון הג'ל לאחר הומוגניזציה, שכן הדגימה תהיה שקופה לחלוטין.
  3. הרימו בעדינות את הג'ל המכיל רקמות מהמגלשה בעזרת סכין גילוח, והעבירו אותו בעדינות לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל בעזרת מברשת צבע.
  4. מלאו את הצינור למעלה במאגר הומוגניזציה (טבלה 2) שחומם מראש ל-80°C.
  5. דגרו על הדגימה ברעד בטמפרטורה של 80°C למשך 8 שעות (עבור מוח עכבר קבוע PFA) או 60 שעות (רוב הדגימות הקליניות של FFPE; ראו טבלה 3).
    הערה: זמן ההומוגניזציה תלוי בסוג הרקמה ובשיטת הקיבוע. רבים מתנאים אלה כבר אומתו, אך עבור אחרים, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה.
  6. יוצקים את תכולת צינור הצנטריפוגה לבאר אחת של צלחת תרבית תאי פלסטיק בעלת 6 בארות.
  7. הסר את מאגר הדנטורציה באמצעות צינור העברה.
  8. כדי להסיר לחלוטין את SDS הנותרים מההידרוג'ל, שטפו את הדגימה בתמיסת פעילי שטח לא יוניים 1% (C12E 10) כדלקמן: לפחות שלוש פעמים במשך10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר; במשך 60 דקות ב 60 ° C; ואז עוד שלוש שטיפות במשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.
  9. יש לאחסן את הדגימה ב-1x PBS + 0.02% נתרן אזיד ב-4°C עד שיהיה צורך לבצע צביעה והדמיה לאחר ההתפשטות.
    הערה: בשלב זה, הדגימה צריכה להיות ~ פי 3-4.5 גדולה יותר בכל ממד, בהתאם לסוג הרקמה.

6. פרופיל ביומולקולה לאחר הרחבה

  1. הכתמת נוגדנים
    הערה: זה עוקב אחר פרוטוקול צביעה טיפוסי של אימונופלואורסצנטיות (IF)/אימונוהיסטוכימיה (I.H.C.). כמויות הנוגדנים הראשוניים והמשניים המשמשים תלויות בריכוזים המוצעים על ידי היצרן או על ידי אופטימיזציה לניסוי הספציפי. ניתן להחליף מאגרים בודדים לפי שיקול דעתו של המשתמש.
    1. כאשר הדגימה נמצאת בבאר אחת של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות, שטפו את הדגימות המורחבות שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם ב-1x PBS ב-R.T., והעבירו את הנוזל עם פיפטה.
    2. בצעו שלב חסימה אופציונלי (לדוגמה, אלבומין בסרום בקר 3% / 0.1% Triton-X100 ב-1x PBS) למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C.
    3. יש לדגור עם הנוגדנים הראשוניים במאגר הצביעה (לדוגמה, 0.1% Triton-X100 1x PBS או 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L heparin) למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C. בהתאם לגודל המדגם, 0.5-2 מ"ל צריך לכסות כראוי את הג'ל.
    4. שטפו את הדגימה שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
    5. לדגור בנוגדנים המשניים המתאימים במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס במאגר הצביעה של בחירה.
    6. שטפו את הדגימה שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
  2. צביעת חלבון פאן NHS-ESTER
    1. עם הדגימה בצלחת 6 בארות, יוצקים 1-2 מ"ל של פוליאתילן גליקול (PEG 200) על הדגימה (מספיק כדי לכסות אותה במלואה).
      הערה: הרקמה צריכה להתכווץ ולחזור לגודלה המקורי לפני ההתפשטות (או קרוב אליה).
    2. כתם עם NHS-ester מצומד פלואורופור מדולל ל 13.3-80 מיקרוגרם / מ"ל במשך 3 שעות ב R.T. ב 1-2 מ"ל של חיץ צביעה (למשל, 1x PBS, 2x S.S.C., או 100 mM תמיסת סודיום ביקרבונט).
    3. שטפו את הדגימה שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
  3. צביעת שומנים
    הערה: צביעת שומנים לאחר הרחבה אינה יעילה בדגימות קליניות של FFPE, מכיוון שהשומנים אובדים במהלך תהליך הקיבוע.
    1. שטפו את הדגימה שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
    2. יש למרוח צבע ליפופילי קונבנציונלי (DiO, DiI או DiD) מדולל פי 200 ב-2 מ"ל של 0.1% TritonX-100/1x PBS למשך 72-96 שעות בטמפרטורת החדר.
    3. יש לשטוף לפחות שלוש פעמים עם PBS אחד
  4. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH)
    1. הניחו דגימות ג'ל הומוגניות במאגר הכלאה שחומם מראש ל-60°C למשך 30 דקות.
    2. הכינו את חיץ ההכלאה עבור FISH: ערבבו 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM נתרן ציטראט, pH 7.0), 10% (v/v) דקסטרן סולפט, 20% (v/v) אתילן פחמתי, ו-0.1% (v/v) טווין20.
    3. לדגור על דגימות הג'ל עם חיץ הכלאה המכיל 10 pM (לכל אוליגו) של בדיקות FISH כנגד גן המטרה (לפחות 20 בדיקות לכל 10 kb) ב 45 ° C במשך הלילה.
    4. יש לכבס עם חיץ כביסה מחמיר (2x S.S.C. ו-0.1% Tween20) פעמיים למשך 15 דקות בכל פעם בטמפרטורה של 45°C.
    5. יש לכבס עם חיץ כביסה מחמיר פעמיים נוספות למשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורה של 37°C.
    6. לבסוף, שטפו עם PBS 1x לפחות שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.
    7. הדגימות מוכנות להדמיה או אחסון ב-1x PBS + 0.02% נתרן אזיד ב-4°C.
  5. הרחבת רקמות מלאה והדמיית פלואורסצנטיות
    הערה: מקדם ההתפשטות שניתן להשיג עם הגדלה משתנה בהתאם לסוג הרקמה ולשיטת ההתפשטות (סיכום מלא ניתן למצוא בטבלה 3). עם זאת, כהערכה כללית, מדגם מגדיל יתרחב פי 3-4.5 ב-1x PBS, פי 5-7 ב-PBS מדולל ל-1:50 ב-ddH 2 O, ופי 8-11 ב-ddH2O. גורם ההתפשטות האופטימלי לדימות תלוי בצרכים של כל ניסוי. גורם ההתפשטות ניתן לכוונון גבוה, כך שניתן להרחיב ולכווץ דגימה בודדת פעמים רבות לצורך הדמיה בקני מידה שונים.
    1. העבר את הדגימות המורחבות פי 4 ב- PBS ללוח הדמיה בעל תחתית זכוכית של 6 בארות באמצעות מברשת צבע. הזיזו כל דגימה מורחבת עוד יותר על ידי חיתוכה לחתיכות קטנות יותר או הניחו אותה בעדינות בתוך צלחת הדמיה גדולה עם תחתית זכוכית עם חתיכת פלסטיק גמישה דקה.
    2. בצע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי, מיקרוסקופ קונפוקלי או מערכת הדמיה אחרת לפי בחירתך. הסרת עודפי נוזלים סביב הג'ל עם מטלית מעבדה מנייר עשויה למנוע תזוזת ג'ל במהלך ההדמיה. ניתן גם לשתק את הג'לים על ידי מריחת 0.1% פולי-L-ליזין על משטח הזכוכית לפני ההדמיה.
      הערה: היישום של פולי-L-ליזין יהפוך את הג'ל ללא תנועה לחלוטין במגע. מסיבה זו, יש להקפיד כי הג'ל מוחל על הזכוכית ללא קיפול או מתיחה. בנוסף, אין לאפשר לג'ל להתייבש לחלוטין על זכוכית מצופה פולי-L-ליזין, מכיוון שהדבר עלול להקשות על הסרתו, ואין לכווץ את הג'ל ב-PBS כשהוא עדיין מחובר לזכוכית עם פולי-ל-ליזין, מכיוון שהדבר עלול לגרום לג'ל או נזק לרקמות.
    3. לאחר ההדמיה, כווצו את הדגימות ב- 1x PBS עם לפחות שלוש שטיפות למשך 10 דקות בכל פעם, מכיוון שלא מומלץ לאחסן את הדגימות לטווח ארוך ב- ddH2O עקב השפלה של אות הפלואורסצנטיות. בפרט, דגימות מורחבות לחלוטין מוכתמות בצבעים ליפופיליים יש לצלם קרוב ככל האפשר לזמן ההתפשטות כדי למנוע דיסוציאציה של הצבע במים.
    4. אחסן את הדגימות ב 1x PBS + 0.02% נתרן אזיד ב 4 ° C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אם הפרוטוקול הושלם בהצלחה (איור 1), הדגימה תיראה ברורה ושטוחה לאחר דנטורציה של חום; כל קיפול או קמטים מעידים על הומוגניזציה חלקית. דגימה שהורחבה בהצלחה תהיה גדולה פי 3-4.5 מאשר לפני ההתרחבות ב-PBS 1x וגדולה פי 8-11 כאשר תורחב במלואה ב-ddH2O. איור 3 מציג תמונות לדוגמה לפני ואחרי ההתפשטות של דגימת כליה אנושית FFPE בעובי 5 מיקרומטר שעובדה באמצעות פרוטוקול זה והורחבה בהצלחה פי 8. הרקמה הוכתמה תחילה בנוגדנים עבור ACTN4 יחד עם DAPI כדי להמחיש את הדנ"א הגרעי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול Magnify17, גרסת ExM שיכולה לשמור על ביומולקולות מרובות עם עוגן כימי יחיד ולהרחיב דגימות קליניות מאתגרות של FFPE עד פי 11 עם דנטורציה של חום. השינויים העיקריים בפרוטוקול זה המבדילים אותו מפרוטוקולי ExM אחרים כוללים שימוש בג'ל מנוסח מחדש שנשאר חזק מכנית גם כאשר הוא מורחב במלואו, כמו גם השימוש במתקרוליין כעוגן ביומולקולה. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם כדלקמן: 1) הרכב תמיסת הג'ל הסופית; 2) עיתוי שלבי הגלציה; 3) הגדרת תא הגלציה; 4) הפרמטרים להומוגניזציה של המדגם; ו-5...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים על האינטרסים הפיננסיים המתחרים הבאים: Y.Z., A.K., Z.C. ו- B.R.G. המציאו מספר המצאות הקשורות ל- Magnify ו- ExM.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קרנגי מלון וקרן הצדקה D.S.F. (Y.Z. ו- X.R.), המכונים הלאומיים לבריאות (N.I.H.) פרס הבמאי החדשן החדש DP2 OD025926-01, וקרן קאופמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-הידרוקסי-TEMPO (4HT)מעכב176141 סיגמא אולדריץ'
צלחת תחתון זכוכית 6 בארות (#1.5 כיסוי)CellvisP06-1.5H-N
אקרילאמידסיגמא אולדריץ'A8887רכיב מונומר ג'ל
אמוניום פרסולפט (APS) Sigma AldrichA3678Initiatior
DAPI (1 מ"ג/מ"ל)Thermo Scientific62248
דקאתילן גליקול מונו דודציל אתר (C12E10)Sigma AldrichP9769יהלום פעילי שטח לא יוניים
מס' 88 CMGeneral Tools31116
אתנולPharmco111000200
אתנולPharmco
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית
(EDTA) 0.5 M		VWRBDH7830-1רכיב חיץ הומוגניזציה
מלקחיים
גליציןסיגמא אולדריץ'G8898רכיב מאגר הומוגניזציה
הפריןסיגמא אולדריץ'H3393
מתקרוליןסיגמא אולדריץ'133035סוכן עיגון
מיקרו כיסוי זכוכית #1 (24x60 מ"מ)VWR48393 106
מיקרו כיסוי זכוכית #1.5 (24x60 מ"מ)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)		Sigma AldrichT9281Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis)Sigma AldrichM7279רכיב מונומר ג'ל
N,N-dimethylacrylamide (DMAA)Sigma Aldrich274135רכיב מונומר ג'ל
Nunclon 4-Well x 5 מ"ל MultiDish Cell Culture DishDish Thermo Fisher
6-Well Cell Culture DishThermo Fisher140675
Nunc™ 15 מ"ל  תרמו פישר339651
Nunc™ 50 מ"ל  חרוטיתרמו פישר339653
שייקר
מברשת
pH מטר
פוספט חוצץ מלח (PBS), 10x תמיסהFischer ScientificBP399-1
פוליאתילן גליקול  200סיגמא אולדריץ'P-3015
פרוטאינאז K ( כיתה ביולוגיה מולקולרית)Thermo ScientificEO0491
סכין גילוחפישר Scientifc12640
צינורות מיקרוצנטריפוגה Safelock 1.5 מ"לתרמו פישר3457
צינורות מיקרוצנטריפוגה Safelock 2.0 מ"לתרמו פישר3459
נתרן אקרילט (SA)AK ScientificR624רכיב
נתרן אזידסיגמא אולדריץ'S2002
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ'S6191
נתרן ציטראט טריבסיק דיהידראטסיגמא אולדריץ'C8532-1KG
נתרן דודציל סולפט (SDS)סיגמא אולדריץ'L3771רכיב מאגר חיץ הומוגניזציה
Tris BaseFischer ScientificBP152-1מאגר הומוגניזציה רכיב
Triton X-100Sigma AldrichT8787
UreaSigma AldrichU5378רכיב חוצץ הומוגניזציה
XylenesSigma Aldrich214736
20x SSCThermo ScientificAM9763
Tween20Sigma AldrichP1379
פולי-L-ליזין סיגמא אולדריץ'P8920
סכין 111000200 167063-Nunclon חרוטי אורביטליצבעמונומר ג'ל

מקורות

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  9. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165(2016).
  10. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847(2018).
  11. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
  12. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
  13. White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
  14. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).
  15. Chang, J. -B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  16. Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
  17. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
  18. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  19. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MagnifyFISH

מאמרים קשורים