כאן, אנו מציגים פרוטוקול המציע חלופות איסוף דם מהירות, קלות ואמינות עבור מודל החולדות. אנו מתארים שלוש שיטות שונות לדגימת דם בהתאם להקשר: ניקוב וריד הזנב בהרדמה או בעל חיים בהכרה, וניקור ורידים בפין הגבי בהרדמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
וריד זנב שונה וניקוב ורידים פין לדגימת דם במודל החולדה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
דגימות דם נדרשות ברוב הניסויים בבעלי חיים כדי להעריך פרמטרים המטולוגיים שונים. מאמר זה מציג שני הליכים לאיסוף דם בחולדות: ניקוב וריד הזנב הצידי וניקוב וריד הפין הגבי, המציעים יתרונות משמעותיים על פני טכניקות אחרות שתוארו קודם לכן. מחקר זה מראה כי שני הליכים אלה מאפשרים דגימה מהירה (מתחת ל -10 דקות) ומניבים נפחי דם מספיקים עבור רוב הבדיקות (202 μL ± 67.7 μL). ניקוב וריד הפין הגבי חייב להיעשות תחת הרדמה, ואילו ניקוב וריד הזנב הצידי יכול להיעשות על בעל חיים מודע ומאופק.
החלפה בין שתי הטכניקות הללו, אם כן, מאפשרת שאיבת דם בכל מצב. בעוד שתמיד מומלץ למפעיל להיעזר במהלך הליך כדי להבטיח את רווחת בעלי החיים, טכניקות אלה דורשות מפעיל אחד בלבד, בניגוד לרוב שיטות דגימת הדם הדורשות שניים. יתר על כן, בעוד ששיטות אלה שתוארו קודם לכן (למשל, מקל ג'וגולרי, שאיבת דם של ורידים תת-קלאביים) דורשות הכשרה מוקדמת מקיפה כדי למנוע נזק או מוות של החיה, ניקוב וריד הפין הגבי הם לעתים רחוקות קטלניים. מכל הסיבות הללו, ובהתאם להקשר (למשל, עבור מחקרים הכוללים חולדות זכרים, במהלך התקופה הטרום ניתוחית או מיד לאחר הניתוח, עבור בעלי חיים עם ורידי זנב דקים), ניתן להשתמש בשתי הטכניקות לסירוגין כדי לאפשר שאיבת דם חוזרת.
מבוא
דגימת דם נחוצה לרוב המחקרים בבעלי חיים, הן in vivo והן in vitro. בחולדות, מכיוון שתדירות וכמות דגימת הדם יכולות להיות משמעותיות, כדאי שיהיו חלופות שונות לאיסוף. שיטות שונות תוארו במחקרים קודמים.
הטכניקות הנפוצות ביותר הן ניקוב ורידים בזנב ושאיבת דם של ורידים ספנוסיים. דגימת ורידי זנב מתאימה לכל זני החולדות. עם הכשרה נכונה, ההליך פשוט לביצוע וגורם מצוקה מינימלית לבעל החיים1. באופן דומה, שאיבת הדם של הווריד הספנוס, בתנאי שהיא נעשית כראוי, היא גם שיטת איסוף מהירה ופשוטה. אף אחת מהשיטות אינה דורשת הרדמה, ושתיהן מאפשרות שאיבה חוזרת ונשנית של כמויות קטנות של דם. עם זאת, ניקוב הווריד הספנוס מניב בדרך כלל נפח דם נמוך יותר1 ודורש נוכחות של שני אנשים כדי להשאיר גפה אחורית אחת חשופה לנקב2.
אם יש צורך לאסוף כמויות גדולות של דם מחיה אחת, ניתן להשתמש בניקוב לב או נקב של הווריד קאווה (ניתן לשאוב עד 10 מ"ל דם מחולדה של 150 גרם עם נקב לב2). טכניקות אלה דורשות הרדמה והן הליכים סופניים. יש להרדים את בעל החיים לאחר כל אחת משתי הטכניקות הללו2. מקל הצוואר הוא חלופה שניתן להשתמש בה אם יש צורך לאסוף כמויות גדולות של דם במחקר שעדיין לא הגיע לנקודת הסיום שלו. עם זאת, טכניקה זו דורשת גם מיומנויות טכניות משמעותיות כדי למנוע נזק לחיה; לפיכך, השימוש בו צריך להיות מוגבל3.
טכניקות אחרות, כגון שאיבת הדם של הוורידים התת-קלאביים, אינן דורשות שימוש בחומרי הרדמה לפני איסוף הדם ומאפשרות דגימה חוזרת ונשנית של כמויות קטנות של דם. עם זאת, טיפול מאופק וחתך מחט מתאים נדרשים לטכניקה זו. ניתוח לא תקין עלול לגרום לכאבים בבעלי חיים ואף לתמותה, והאימון בשיטה זו עשוי להיות קפדני4.
הליכים אנקדוטליים אחרים כוללים את ניקוב האורביטלי ואת ניקוב הווריד התת-לשוני, שניהם דורשים הרדמה, ואינם מומלצים או בשימוש נרחב. למרות שמחקרים קודמים הראו איסוף דם מהיר יותר על ידי ניקוב אורביטלי מאשר על ידי ניקוב ורידים בזנב, נמצא כי ניקוב אורביטלי תחת הרדמה דיאתיל-אתר היה פחות נסבל מאשר השיטה האחרונה (בהתבסס על ציוני העירור של בעלי החיים וייצור השתן)5. יתר על כן, שיטה זו מושפעת מאוד מהמיומנות של האדם המבצע את ההליך ומבוצעת בעיקר על ידי וטרינרים מנוסים. לעומת זאת, ניקוב הוורידים התת-לשוני פחות מטריד ומומלץ לדגימת דם חוזרת6. עם זאת, טכניקה זו מציגה תופעות לוואי חמורות כגון צריכת מזון ומים מופחתת, אשר יכול להוביל למוות של החיה7.
מחקר זה מתאר שתי שיטות המשמשות במעבדה שלנו לדגימות דם חוזרות. ניקוב ורידים בזנב יכול להתבצע על בעל חיים מודע, והנזק לרקמות ותופעות הלוואי הם מינימליים. השינוי של טכניקה זו במחקר זה כולל ייצוב הזנב עם האצבע המורה והאצבע האמצעית, המאפשר למפעיל יחיד לבצע את איסוף הדם. ניקוב ורידים הפין הגבי כבר תואר עבור זריקות תוך ורידי פשוט. טכניקה זו מבוצעת בהרדמה ומאפשרת מקור דם אמין במקרה של קשיים בשיטות אחרות (למשל, בתקופה המיידית שלאחר הניתוח, עם חיה קטנה, בעת ביצוע שאיבת דם פרי-ניתוחית בהרדמה). בדומה לדגימת ורידי זנב, לפגיעה באתר הניקוב תהיה השפעה כוללת מינורית על בעל החיים בהשוואה לטכניקות שהוזכרו לעיל8. מטרת מאמר שיטות זה היא להציע לחוקרים חסרי ניסיון חלופות פשוטות ואמינות לדגימת דם בהתאם להקשר (למשל, לפרוצדורות המבוצעות בהרדמה, למחקרים הכוללים חולדות זכרים, לבעלי חיים עם ורידי זנב דקים).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליכים בוצעו על חולדות לואיס זכרים בני 3 חודשים, שכל אחת מהן שוקלת 300-400 גרם. בסך הכל נכללו 24 בעלי חיים, עם שלושה מצבי ניקוב: 12 חולדות עברו ניקוב ורידי זנב ללא הרדמה (טלוויזיה קבוצתית ללא הרדמה), ועוד 12 חולדות הורדמו כדי לעבור ניקוב ורידים בזנב (טלוויזיה קבוצתית עם הרדמה) וניקוב ורידים בפין (PV קבוצתי עם הרדמה). כל הנהלים אושרו וכובדו על פי הנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל בעלי החיים הומתו בסוף המחקר (לאחר מעקב של חודש) על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הנחיות כלליות
- בהתאם להנחיות IACUC, יש לוודא כי נפח הדם המרבי שנמשך אינו עולה על 10% מנפח הדם הכולל כל שבועיים9. לדוגמה, חולדה של 300 גרם צריך להיות נפח דם כולל של כ 19.2 מ"ל. במקרה של פרוטוקול הדורש ארבע שאיבות דם בשבוע הראשון בלבד (יום 0, יום 1, יום 3, יום 7), יש להגביל את האיסוף למקסימום של 250 מיקרוליטר דם לדגימה.
- עבור הליכים המבוצעים בהרדמה, יש לתת איזופלורן באמצעות וופורייזר מדויק כדי להרדים את החיה. יש להשרות הרדמה בתא עם מינון של 3%-5% איזופלורן למשך 5 דקות, ולשמור על שימוש במינון של 1%-3% איזופלורן דרך חרוט אף במהלך ההליך. להתאים את רמת isoflurane מבוסס על ניטור רציף של קצב הנשימה. ודא אם סדציה מספיקה על ידי צביטת בוהן לפני תחילת ההליך.
- אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה במהלך ההליך או עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
- לאחר איסוף הדם, עקוב אחר בעל החיים עד להחלמה מלאה לפני החזרתו לכלוב שלו, ואל תציג אותו לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
הערה: בהסכמה עם השירותים הווטרינריים, לא היה צורך בתרופות נגד כאבים לאחר ניקוב וריד הזנב או וריד הפין.
2. דם לשאוב מן וריד הפין
- הכנה
- הכינו את הציוד הבא: גזה סטרילית, כפפות, מגבוני אלכוהול, צינור EDTA לאיסוף דם מיקרו-נימי (כובע סגול), ומזרק אינסולין 30 גרם (30 U או 50 U).
- הוציאו את החולדה מהכלוב שלה, והכניסו אותה לתא לזירוז עם איזופלורן באמצעות וופורייזר מדויק (מינון: 3%-5%). לאחר שבעל החיים מורדם, העבירו אותו לשולחן הפרוצדורות, והשכיבו את בעל החיים על גבו כשאפו מונח בחרוט האף כדי לשמור על ההרדמה. יש לעקוב אחר קצב הנשימה, ולהתאים את רמת האיזופלורן בהתאם (מינון תחזוקה: 1%-3%). ודא כי בעל החיים הוא מסומם מספיק על ידי צביטת הבוהן לפני תחילת ההליך.
- דגימת דם
- הזיזו את הבוכנה קדימה ואחורה במזרק מספר פעמים כדי להחליק את הנסיגה. צור לחץ שלילי במזרק על ידי משיכת הבוכנה כדי להסיר כמה מיקרוליטרים.
- בעזרת היד הלא דומיננטית, הסירו את העורלה מקצה הפין, והחזיקו את העטרה בין האינדקס לאגודל, מושכים בעדינות. וריד הפין הגבי יופיע כחוט כחול שטחי. ראו איור 1 ואיור 2.
- כאשר עין המחט מצביעה כלפי מעלה, הכנס את מזרק האינסולין לווריד בזווית של 35 מעלות. ברגע שהמחט נכנסה לווריד, הדם יזרום לתוך המזרק.
- לאט למשוך את הבוכנה של המזרק בקצב איטי ויציב כדי לאסוף את הנפח הרצוי.
הערה: אין למשוך את הבוכנה מהר מדי, שכן זה יגרום לווריד להתמוטט ולעצור את זרימת הדם. - אם זרימת הדם פוחתת, סובבו את המחט מעט בכיוון השעון או נגד כיוון השעון.
- מוציאים את המזרק. טיפת דם תיווצר באתר לנקב, ששאיפתו תאפשר איסוף של עוד כמה מיקרוליטרים של דם במקרה של הליך לא סטרילי.
- אם הנקב הראשון נכשל, הכנס מחדש את המחט קרוב יותר על הווריד.
הערה: שלא כמו עבור דגימת ורידים זנב, ניקוב איטרטיבי של וריד הפין הגבי הוא בדרך כלל לא מוצלח. - הפעילו לחץ קל על אזור הניקוב כדי לעצור את הדימום, ונגבו את האזור עם מגבון אלכוהול חדש.
- החזירו את הפין למקומו הניטרלי.
- כבו את האיזופלורן ועקבו אחר החולדה עד להחלמה מלאה. החזירו את החולדה לכלוב שלה.
3. ניקוב ורידים בזנב
- הכנה
- הכינו את הציוד הבא: מחזיק ריסון פלסטיק, גזה סטרילית, כפפות, מגבוני אלכוהול, צינור EDTA לאיסוף דם מיקרו-נימי (כובע סגול), ומזרק אינסולין 28 G 1/2 (30 U או 50 U).
- הוציאו את החולדה מהכלוב שלה, ואבטחו אותה במהירות בחרוט מרסן פלסטיק. סגור את הקצה הגדול של החרוט סביב בסיס הזנב. ודא כי בעל החיים נוח וכי הנשימה היא בלתי מוגבלת לאורך כל ההליך.
- טובלים את הזנב במים חמים (37°C) למשך כדקה כדי להרחיב את הווריד. יבש את הזנב עם מגבת נייר. הניחו את בעל החיים (בריסון שלו) עם הפנים כלפי מטה, כשהזנב שוכב על כרית חימום.
- בחר את וריד הזנב הימני או השמאלי (קו כחול) לדגימה על ידי סיבוב החיה כולה לכל צד (זה מונע את פיתול הזנב). השתמש בשליש הסופי של הזנב לניקוב כלי דם מכיוון שכלי הדם הופכים שטחיים יותר באזור זה. העורק הוא גחוני, ושני הוורידים הם לרוחב10.
- נגבו את הזנב במגבוני אתנול 70% באתר הניקוב.
- הניחו את הזנב על קצה כרית החימום כדי ליצור זווית בשליש הסופי של הזנב. זה מביא את הווריד אל פני השטח ויוצר יותר מקום ללקיחת הדגימה.
- דגימת דם
- הזיזו את הבוכנה קדימה ואחורה במזרק מספר פעמים כדי להחליק את הנסיגה. צור לחץ שלילי במזרק על ידי משיכת הבוכנה כדי להסיר כמה מיקרוליטרים.
- בעזרת האצבע המורה והאצבע האמצעית הלא דומיננטית, אבטחו את הזנב שטוח על כרית החימום. הניחו את האצבע האמצעית בסמיכות ואת האצבע המורה באופן דיסטלי, כאשר אתר הניקוב נמצא בין שתי אצבעות אלה. הפעל לחץ רב יותר על האצבע האמצעית מאשר על המורה כדי לאבטח את הזנב, תוך הסתרת כלי הדם רק בסמיכות ומאפשר לדם להצטבר. ראו איור 1 ואיור 3.
- כאשר עין המחט מופנית כלפי מעלה, החליקו את מזרק האינסולין כנגד האצבע המורה עד להחדרו לווריד (כך נוצרת זווית של 35 מעלות בין המחט לזנב). ברגע שהמחט נכנסה לווריד, הדם יזרום לתוך המזרק. בשלב זה, שחררו את הלחץ על האצבע המורה והאצבע האמצעית כדי להבטיח שזרימת הדם אינה חסומה.
- לאט למשוך את הבוכנה של מזרק בקצב קבוע כדי לאסוף את נפח הרצוי.
הערה: אין למשוך את הבוכנה מהר מדי; זה יגרום לווריד להתמוטט ולעצור את זרימת הדם. - אם זרימת הדם פוחתת, סובבו מעט את המחט לשני הכיוונים.
- מוציאים את המזרק מהזנב. טיפת דם תיווצר באתר הניקוב של הזנב. השאיפה של דם זה מאפשרת איסוף של עוד כמה מיקרוליטרים של דם במקרה של הליך לא סטרילי.
- אם הנקב הראשון נכשל, הכנס מחדש את המחט קרוב יותר על הווריד.
הערה: הווריד הופך עמוק יותר ויותר ככל שהוא מתקרב לבסיס הזנב. אם אין זרימת דם במזרק, הגדילו את הזווית בין המזרק לזנב, או סובבו את המחט. - הפעילו לחץ על אזור הניקוב כדי לעצור את הדימום, ונגבו את האזור עם מגבון אלכוהול חדש. הוציאו את החולדה מחרוט הפלסטיק, והחזירו אותה לכלוב שלה.
- ניקוב ורידים בזנב בהרדמה
- בצע את שלב 2.1.1 ואת שלב 2.1.2 לגרימת ושמירה על הרדמה.
- לבצע שלבים 3.1.3-3.2.7 לאיסוף דם; ראו איור 1.
- בצע את שלב 2.2.10 להתאוששות בעלי חיים.
איור 1: סכמות של שיטות הניקוב השונות בפרוטוקול זה. (A) ניקוב וריד זנב שונה בבעל חיים מודע ומאופק; (B) ניקוב וריד זנב שונה וניקוב ורידים בפין תחת הרדמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הצלחה הוגדרה כשאיבת דם המניבה לפחות 100 מיקרוליטר דם בפחות מ-10 דקות (מזמן הניקוב ועד סוף איסוף הדם), וכשל הוגדר כשאב דם המניב פחות מ-100 מיקרוליטר דם או לוקח יותר מ-10 דקות לשלוף את נפח הדם הנדרש. הותר מקסימום של 250 מיקרוליטר דם לדגימה. הניתוחים הסטטיסטיים נערכו באמצעות מבחן ANOVA חד-כיווני להשוואות מרובות ומבחן chi-squared. הנתונים הוצגו כערך ממוצע ± סטיית תקן, ו-p < 0.05 שימש כסף לקביעת מובהקות סטטיסטית.
השוואת שיעורי ההצלחה הראתה תוצאות דומות עבור ניקוב ורידים בזנב בחולדות מוד...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניקוב וריד הזנב הוא שיטה יעילה להשגת דם מחולדה מודעת. עם זאת, כאשר בעל חיים נמצא תחת הרדמה, ההשפעה של isoflurane יכול להוביל התכווצויות כלי ולהפוך לנקב ורידים זנב לא מתאים11. כפי שמוצג במחקר זה, חלופה במצב זה היא לאסוף דם מווריד הפין, אשר מוצלח יותר ומניב נפח גדול משמעותית של דם בפחות זמן. חשוב לזכור כי במקרה של כישלון בשיטה זו בניסיון הראשון, הניסיונות הבאים עשויים שלא להצליח. לעומת זאת, ניקוב ורידים בזנב מאפשר מספר נקבים עוקבים במקרה של קושי בניסיון הראשון (ישנם שני ורידים, וניתן לנסות ניקוב גבו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים להצהיר.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי Shriners Children's Boston (B. E. U., K.U., C.L.C). L.C. ממומנת על ידי "La Bourse des Gueules Cassées", "La Bourse Année Recherche" ו-"La Bourse de l'Amicale des Anciens Internes des Hôpitaux de Paris". י.ב. ממומן על ידי "La Bourse des Gueules Cassées". Y.B. ו- I.F.v.R ממומנים על ידי בתי החולים לילדים (מזהה המלגות הוא #84308-BOS-22 #84302-BOS-21 בהתאמה). חומר זה מבוסס בחלקו על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מס '. EEC 1941543. תמיכה חלקית ממכוני הבריאות הלאומיים של ארה"ב (R01EB028782, R56AI171958 ו-R01DK114506) זוכה להכרת תודה. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.5 מ"ל | 28 גרם ו-frac12; מזרקי אינסולין | BD | 329424 | לניקוב וריד הזנב |
| 0.5 מ"ל | 30 גרם x 5/16 מזרקי אינסולין | BD | 320468 | לניקוב וריד הפין |
| 250 L צינורות איסוף דם Microtainer עם K2EDTA | BD | 365974 | |
| ספוגי גזה | Curity | 6939 | |
| Isoflurane Auto-Flow מכונת הרדמה | מערכות | EZ-190F | לניקוב ורידים בפין |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 1403-704-06 | לניקוב וריד הפין |
| Nosecone | למכשירי דיוק בעולם | EZ-112 | לניקוב וריד הפין |
| חרוט מכרסם ריסון | מכשיר הרווארד | ST2 52-95-86 | לניקוב וריד הזנב |
| שולחן ניתוח מחומם לבעלי חיים קטנים (מתכוונן) | Peco Services Ltd | 69023 | |
| רפידות הכנה לאלכוהול Webcol | Simply Medical | 5110 |
מקורות
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766(2015).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), 266(2007).
- Luzzi, M., et al. Collecting blood from rodents: A discussion by the Laboratory Animal Refinement and Enrichment Forum. Animal Technology and Welfare. 4 (2), 99-102 (2005).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439(2022).
- Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: Comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory Animals. 35 (2), 131-139 (2001).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
- Nightingale, C. H., Mouravieff, M. Reliable and simple method of intravenous injection into the laboratory rat. Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 860-861 (1973).
- Blood collection: The rat. IACUC Guideline. UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. , Available from: https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/guidelines%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Staszyk, C., Bohnet, W., Gasse, H., Hackbarth, H. Blood vessels of the rat tail: A histological re-examination with respect to blood vessel puncture methods. Laboratory Animals. 37 (2), 121-125 (2003).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR Journal. 52 (3), e21-e31 (2011).
- Hernaningsih, Y., Akualing, J. S. The effects of hemolysis on plasma prothrombin time and activated partial thromboplastin time tests using photo-optical method. Medicine. 96 (38), 7976(2017).
- Powles-Glover, N., Kirk, S., Jardine, L., Clubb, S., Stewart, J. Assessment of haematological and clinical pathology effects of blood microsampling in suckling and weaned juvenile rats. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 69 (3), 425-433 (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
