הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וזיהוי תאי נישה לימבליים

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65618

⸱

27 באוקטובר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Institute of Medicine Nursing, Hubei University of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי הנישה הלימבליים האנושיים.

תקציר

כאן אנו מדווחים על הליך סטנדרטי לבידוד וזיהוי של תאי נישה לימבליים (LNCs). רקמת לימבוס שהתקבלה מבנק עיניים שימשה לבידוד LNCs. הרקמה חולקה ל -12 חתיכות בתנאים אספטיים ועוכלה במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית התא באמצעות collagenase A כדי להשיג אשכולות תאים עם LNCs ותאי אב אפיתל לימבלי. אשכולות התאים עוכלו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C תוך שימוש ב-0.25% טריפסין-EDTA כדי להשיג תאים בודדים, ולאחר מכן גודלו בתרבית במדיום תאי גזע עובריים מהונדסים (MESCM) על משטח פלסטיק מצופה ב-5% מטריג'ל. תאים הועברו במפגש של 70%, ו- LNCs זוהו באמצעות immunofluorescence, PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) וציטומטריית זרימה. LNCs ראשוניים בודדו ועברו יותר מ -12 פעמים. פעילות ההתפשטות של LNCs מ-P4 ל-P6 הייתה הגבוהה ביותר. LNCs ביטאו סמנים גבוהים יותר של תאי גזע מאשר BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR ו- PDGFRβ). יתר על כן, התוצאות הראו כי P4 LNCs ביטאו באופן אחיד VIM, CD90, CD105 ו- PDGFRβ, אך לא Pan-CK, שיכול לשמש כסמן לזיהוי LNCs. ניתוח ציטומטרי זרימה הראה כי כ- 95%, 97%, 92% ו- 11% מה- LNCs ביטאו CD73, CD90, CD105 ו- SCF בהתאמה, בעוד שהם היו 68%, 99%, 20% ו- 3% ב- BMMSC. התהליך הסטנדרטי לבידוד וזיהוי LNC יכול לספק בסיס מעבדה אמין לשימוש נרחב ב- LNCs.

מבוא

השכיחות של מחסור בתאי גזע אפיתל בקרנית (CESD), המכונה גם מחסור בתאי גזע לימבליים (LSCD)1, והתחדשות אפיתל הקרנית (CES) הופכים דחופים יותר ויותר בגלל זיהום ופציעה בקרנית. אם לא מטופלים כראוי, CESD יכול להוביל לעיוורון הדורש השתלת קרנית. כתוצאה מכך, התחדשות CES הופכת משמעותית יותר. קיימת קבוצה של תאים תומכים הנקראים תאי נישה לימבליים (LNCs) המספקים תמיכה חיונית לתפקוד CES. תאי גזע סטרומה לימבליים בודדו לראשונה על ידי Polisetty et al.2 וזוהו על ידי Xie et al.3 כ- LNCs אשר ממוקמים באפיתל הלימבלי, subjacent וסטרומה של הלימבוס. LNCs הם תאי הגזע התומכים העיקריים של שפת הקרנית, ועם הפונקציה של MSC הנגזר ממח עצם (BMMSCs), וניתן לגרום להם להתפתח לתאי אפיתל בקרנית ולתאי סטרומה בקרנית, וכו '.3,4,5,6,7. מחקרים קודמים הראו כי תכונות תאי הגזע של LNCs הן פרימיטיביות יותר מאשר BMMSCs8, אשר כבר בשימוש נרחב במרפאה. LNCs עשויים אפילו להפוך את האפשרות המעשית הבאה לאחר MSC, במיוחד לטיפול CESD. כתאים תומכים חשובים עבור CES, LNCs הם גם תאי גזע הנגזרים מהמבנה "הנישתי" של הלימבוס. LNCs עשויים למלא תפקיד מפתח בהתמיינות של תאי אפיתל קרנית בוגרים (MCEC) ל- CES9. עם זאת, מחקרים על LNCs עדיין אינם מספיקים יחסית, ואין הסכמה על המינוח, הבידוד, הטיהור, הזיהוי והמאפיינים של LNCs. כמה חוקרים קראו לתאי גזע סטרומה שמקורם בביופסיה לימבלית 10, תאי גזע מזנכימליים לימבליים 11, תאי גזע פיברובלסטים לימבליים12 ותאי סטרומה מזנכימליים לימבליים13. מכיוון שמאפייני הצמיחה של LNCs לא תוארו בפירוט, ובגלל היישומים המדעיים והקליניים המבטיחים שלהם, ועשויים להיות אחד הכלים הקליניים החשובים ביותר בעתיד, יש צורך לסכם את הבידוד, הטיהור, הזיהוי והמאפיינים של LNCs.

על פי מחקר קודם14, LNCs נמצאים בעיקר באפיתל הלימבל subjacent וסטרומה של הלימבוס. פרוטוקול זה כולל טיפול ברקמת לימבוס באמצעות collagenase A, קבלת אשכול המורכב מ- LEPC ו- LNCs, ועיכול לתאים בודדים עם 0.25% טריפסין-EDTA (TE). לאחר מכן LNCs תורבתו באופן סלקטיבי בתווך תאי גזע עובריים שונה (MESCM) כדי להיות מטוהרים. הפרוטוקול המדווח במאמר זה הוא פשוט ובעל יעילות גבוהה בהשגת LNCs אנושיים בכמויות גדולות.

ההליך המפורט של בידוד, תרבית וזיהוי LNC תועד בסרטון עבור מדענים המעוניינים במחקר LNC, וניתן לחזור עליו בנוחות בעת הצורך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

רקמת לימבוס מתורמים בגילאי 50 עד 60 שנים התקבלה מבנק העיניים של הצלב האדום, בית החולים טונג'י (ווהאן, סין). הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של טונג'י והתנהל בהתאם להצהרת הלסינקי.

1. בידוד

  1. יש להשיג רקמת לימבוס ממדיום אחסון קרנית לטווח בינוני ולפעול בתנאים אספטיים על שולחן עבודה נקי במיוחד.
  2. יש לגרד ולהסיר את הקשתית והאנדותל סביב הקרנית באמצעות להב עגול כירורגי סטרילי.
  3. חותכים רקמת לימבוס לשתים עשרה חתיכות בגודל שווה עם להב כירורגי עם 1 מ"מ שנותר משני צידי הקרנית והסקלרה.
  4. מעבירים רקמות לימבוס לצלחת תרבית בקוטר 3.5 ס"מ, מוסיפים 1 מ"ל של קולגן A (2 מ"ג/מ"ל, בתווך DF-12), כדי לטבול את כל הרקמות לעיכול.
  5. הכניסו את הצלחת לאינקובטור התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עיכלו את רקמות הלימבל במשך 18 שעות.
    הערה: הליכי מעקב מבוצעים בדרך כלל ביום השני.
  6. הכינו פלטת תרבית 5% ממברנת מרתף (מטריג'ל) מצופה 6 בארות.
    1. ציפוי 5% מטריצת קרום מרתף (מומס ב-MESCM [טבלה 1]) בתחתית הבאר.
    2. הכינו קצוות של 200 μL ו-1 מ"ל, צינור צנטריפוגלי אחד של 15 מ"ל וצלחת אחת של 6 בארות בשקית מעוקרת.
    3. הניחו את השקית המעוקרת (כולל קצוות וצינור צנטריפוגלי) וצלחת חדשה בעלת 6 בארות בסביבה של -20°C או -80°C למשך 20 דקות. הפשירו את מטריצת קרום המרתף במקרר בטמפרטורה של 4°C.
    4. הוציאו את הקצוות המקוררים מראש, הצינור הצנטריפוגלי וצלחת 6 הבארות מהסביבה -20°C או -80°C, ולאחר מכן בצעו את הפעולות הבאות על שולחן העבודה הנקי במיוחד.
    5. מעבירים 50 μL 5% ממברנת מרתף ל-1 מ"ל MESCM באמצעות קצה של 200 μL, ומערבבים אותם בעדינות ובאופן שווה.
    6. מעבירים מטריצת קרום מרתף 5% (מומסת ב-MESCM) לבאר אחת של צלחת תרבית בעלת 6 בארות באמצעות קצה 1 מ"ל מקורר מראש.
    7. נערו את צלחת 6 הבארות בעדינות ובאופקיות, הניחו את צלחת התרבית בת 6 הבארות באינקובטור התא של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה ולאחר מכן בצעו את השלב הבא.
  7. לאחר עיכול של 18 שעות, הוציאו רקמת לימבל מעוכלת מסוג Collagenase A, יישארו רק כמה אשכולות קטנים נראים לעין ורקמות סקלרליות לא מעוכלות.
    הערה: מיקרוסקופ בהגדלה גבוהה חושף אשכול המורכב מתאים רבים צפופים (כולל LNCs).
  8. השתמש בקצה פיפטה של 200 μL כדי לנתק את הצבירים מרקמות סקלרליות לא מעוכלות מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
  9. מעבירים את הצבירים לצלחת התרבית בקוטר 3.5 ס"מ וטובלים אותם ב-0.25% TE, ולאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור התא למשך 15 דקות.
  10. הוסף 1 מ"ל MESCM עם 10% סרום נוקאאוט כדי לעצור את עיכול התאים ופיפטה עדינה למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את הצבירים לתאים בודדים באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל.
  11. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגלי של 15 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות.
  12. הסר את supernatant בזהירות מבלי להפריע משקעים התא, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל MESCM כדי להשעות מחדש את התאים.
  13. פיפטה למעלה ולמטה 2-3 פעמים עד משקעים התא התחתון הוא מרחף באופן שווה MESCM באמצעות 1 מ"ל פיפטה קצה, ולקחת 20 μL תא השעיה לספירת התא.
  14. העבירו את מתלה התא לצלחת 6 בארות מצופות ממברנת מרתף 5% עם קצה פיפטה של 1 מ"ל והגדילו את נפח MESCM ל -2.5 מ"ל.
  15. נערו בעדינות את צלחת 6 הבארות אופקית כדי לפזר את התאים באופן שווה.
  16. מעבירים את התאים לאינקובטור התרבית לאחר שצולמו והוקלטו. להתבונן ולצלם את התאים מדי יום, ולשנות את המדיום כל 3-4 ימים.

2. זיהוי LNC

  1. צביעה אימונופלואורסצנטית
    1. עיכלו את ה-LNCs מתחתית הצלחת באמצעות 1 מ"ל 0.25% TE במשך 5 דקות באינקובטור התאים בטמפרטורה של 37°C.
    2. לסיים את העיכול על ידי הוספת 1 מ"ל MESCM (המכיל סרום נוקאאוט), צנטריפוגה את תרחיף התא ב 200 x גרם במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant בזהירות.
    3. הוסף 1 מ"ל MESCM כדי להשעות מחדש את התאים בהשעיה. הכן תרחיף תאים של 80 μL (4 × 103 תאים לכל שקופית) עבור 4 שקופיות (20 μL / שקופיות) והשתמש במערכת צנטריפוגות כדי להפקיד תאים על שקופיות מיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן.
    4. תקן תאים (הודבקו לשקופיות בשלב 3) באמצעות 4% פרפורמלדהיד למשך כ-10 דקות, ולאחר מכן חלחל תאים בשקופיות עם 0.2% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות.
    5. חסום את התאים למשך שעה אחת עם אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) לפני הדגירה עליהם עם נוגדנים ראשוניים (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) על שייקר למשך הלילה ב-4°C. לאחר הדגירה, יש להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים על ידי שטיפה (5 דקות / שטיפה, 3x) את המגלשות עם PBST (PBS + 0.1% Tween 20).
    6. לדגור על הנוגדנים המשניים המתאימים (חמור נגד עכבר IgG נוגדן משני TRITC [1:1000], חמור נגד ארנב IgG FITC [1:500], חמור נגד עכבר IgG 488 [1:300], חמור נגד ארנב IgG 594 [1:400]) במשך שעה אחת עם נוגדני IgG לא ספציפיים מתאימים IgG. הסר את הנוגדן המשני הלא קשור באמצעות PBST (5 דקות / שטיפה, 3x).
    7. מכתימים את הגרעינים ב-DAPI של 5 מיקרוגרם/מ"ל (4',6-Diamidino-2-Phenylindole ) ואוטמים את המגלשות.
    8. ביצוע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה: 400x; זמן חשיפה: 50 מילישניות).
  2. תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qPCR)
    1. קח ערכת בידוד RNA כדי לחלץ את הרנ"א הכולל בהתאם להוראות היצרן.
    2. השתמש בערכת שעתוק cDNA בעלת קיבולת גבוהה כדי לתעתק לאחור 1-2 מיקרוגרם של RNA כולל ל- cDNA.
    3. בצע את התעתיק ההפוך (42°C, 2 דקות; 50°C, 85 דקות) ואת qPCR (95°C, 5 דקות; 95°C, 10 שניות, 40 מחזורים) בתמיסה של 20-μL המכילה cDNA (100 ננוגרם), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), PCR Master Mix אוניברסלי (10 μL) ו-ddH2O (עד 20 μL).
    4. השתמש בטכניקת CT השוואתית (ΔΔCT)4,9 כדי לבחון את ביטוי הגן היחסי.

3. אפיון LNC

  1. ספירת תאים (המוציטומטר)
    1. עיכלו את ה-LNCs מתחתית הצלחת באמצעות 0.25% TE במשך 5 דקות באינקובטור התאים של 37°C.
    2. לסיים את העיכול על ידי הוספת 1 מ"ל MESCM (המכיל סרום נוקאאוט), צנטריפוגה את תרחיף התא ב 200 x גרם במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant בזהירות.
    3. הוסף 1 מ"ל MESCM כדי להשעות מחדש את התאים, ולאחר מכן לקחת 10 μL השעיית תאים בצינור צנטריפוגה 0.5 מ"ל. הוסף נפח שווה של 0.4% תמיסת צביעה כחולה טריפאן.
    4. מניחים 10 μL תרחיף תאים מוכתמים על אזור הספירה של ההמוציטומטר ומכסים אותו עם כיסוי לספירה.
      הערה: מספר התאים בחמשת האזורים הריבועיים האמצעיים מוגדר כ- "A"; מספר התא ב- 1 מ"ל מחושב כ- 5A × 104 × 2.
  2. בדיקת סמני LNC ו-BMMSC עם ציטומטריית זרימה15
    1. זהה את הביטוי של SCF, CD73, CD90 ו- CD105 ב- LNCs וב- BMMSCs באמצעות ציטומטריית זרימה 15 (2-4 ×10 6 אירועים לדגימה, התקבלו 2,000 תאים מכל אחת מהדגימות, בסך הכל 550,000 תאים שהיו מגודרים בו זמנית).
    2. יש לאסוף ולהכתים את התאים בטמפרטורה של 20-30°C למשך 15 דקות במאגר חוסם (3% BSA ו-0.05% Tween-20 ב-PBS) באמצעות נוגדנים מסומנים מראש (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] ו-CD105 [1:50]) בהתאם להוראות הערכה.
    3. בצע ניתוח מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות ציטומטר זרימה. במחקר זה נעשה שימוש בתוכנת FACS Diva ובתוכנת FlowJo. עבור כל דגימה, תעד 10,000 אירועים ושער ונתח תאים חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

צמיחה של LNC
ה-LNCs בודדו בהצלחה על-פי שיטת העיכול של עיכול collagenase A (2 מ"ג/מ"ל) של רקמת שפה קורנאוסקלרלית, כפי שתואר לעיל (איור 1). בהתאם למחקר3 שדווח בעבר, לאחר עיכול collagenase A, צבירים דמויי זחלים הודגמו תחת המיקרוסקופ (איור 2). חלקם של תאי הציר גדל בהדרגה עם מעבר התא. תאים בצורת ציר יכלו לגדול על לוחות מטריצת קרום מרתף מצופים 5%, בניגוד למקביליהם המעובדים על פלסטיק ללא מטריצת קרום מרתףמצופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שקיפות הקרנית נשמרת בדרך כלל על ידי סידור ופיזור קבוע של סיבים קטנים (בקוטר 25-30 ננומטר) בסטרומה של הקרנית, שהוא חיוני לחדות ראייה תקינה16. ישנם 253 מיליון אנשים לקויי ראייה ברחבי העולם, מתוכם 36 מיליון עיוורים17. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחשיב עיוורון קרנית כאחד הסיכונים החמורים ביותר לראייה האנושית, ומהווה 5.1% מכלל העיוורון בעולם16. פגם אפיתל הקרנית עם CES רגיל יכול לרפא במהירות מבלי להשאיר צלקת18. ההערכה היא כי יותר מ -...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לאף אחד מהמחברים אין גילויים כספיים רלוונטיים.

תודות

תודה לוויי וואנג, לינג-ג'ואן שו ורונג ליו על ההדרכה בעבודה זו, יונגיאו טאן, בי-הווי ג'ין, צ'ון-שיו יו ולי גוויגאנג על אספקת חלק מהחומר, גואניו סו על כתיבת כתב היד, שיאו ג'ואו, יי-הונג שיונג והואטאו שיה על תיקון כתב היד, וגוויגאנג לי על הדרכתו המלאה. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82070936, 81470606, 81570819), פרויקט מחקר מדעי לבריאות ותכנון המשפחה במחוז חוביי (מס '. WJ2017M073), עשרת פרויקטי המחקר הרפואי התרגומי המובילים מבית החולים טונג'י (No.2016ZHYX20), פרויקט הכשרה של חלוצים רפואיים צעירים בעיר ווהאן (No.2015whzqnyxggrc10), תוכנית גיוס כישרונות גלובלית (G2022154028L), פרויקט ועדת הבריאות הלאומית של מחוז חוביי בשנת 2022 (WJ2021ZH0005), ופרויקט בניית נושא של מחלקת הכספים של חוביי בשנת 2022 (42000022815T000000102)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדולThermoFisherD13065μ גרם/מ"ל
אמפוטריצין BסיגמאV9009191.25 μ g/mL
Anti-CD73Abcamab2021221:50
אלבומין סרום בקרMERCKA1933-CD105
Proteintech67075-1-IG1:200
CD105Abcamab1140521:50
CD90Proteintech66766-1-IG1:100
CD90Abcamab3077361:50
חממת תאיםשנחאי LishenK1119K4644HF90 (HT)
מערכת צנטריפוגותStatSpin StatSpin CytoFuge12-קולגנאז
ARoche101035780012 מ"ג/מ"ל
Zeiss LSM700-Culture-Plate
virya350035635 מ"מ
DME/F-12 1:1 (1x) CytivaSH30023.0190%
חמור נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משניThermoFisherA160161:1000
חמור נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משניThermoFisher315681:1000
FACS Diva sofwareBD BiosciencesTreeStar-Flow
Cytometer BDBiosciencesBecton Dickinson LSRII-
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסcx31 
GentamicinSigmaG191450 μ g/mL
HemocytometerMERCKZ359629Bright-Line
ערכת שעתוק cDNA בקיבולת גבוההThermoFisher4374966
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך  UOPDSZ2000X
ITS (אינסולין, טרנספרין, נתרן סלניט)SigmaI31465 μ גרם/מ"ל אינסולין, 5 μ גרם/מ"ל טרנספרין, 5 ננוגרם/מ"ל נתרן סלניט
KnockOut SR החלפת סרום ל-ESCs/iPSCsgibco10828-02810%
MatrigelBioCoat
356234-Pan-CKAbcamab77531:1000
ParaformaldehydeNoninBioNBS01354.00%
ParaformaldehydeMKBioMM-15054%
PDGFR ובטא;AbclonalA14441:100
מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמתיישומי ביוסיסטמסשלב ראשון פלוס-רקומביננטי
אנושי FGF-בסיסיPeprotech100-18B4 ng/mL
גורם מעכב לוקמיה אנושית (Lif)Peprotech300-0510 ng/mL
RNeasy Mini RNA בידוד ערכתQiagen74104-
SCFBiossbs-0545R1:100
SCFAbcamab526031:50
סטריאומיקרוסקופZEISSSteREO Discovery. V8
להב עגול כירורגי סטריליCareforde29500גודל 10
TaqMan Gene Expression Assay Assay MixApplied Biosystems4448489
Triton X-100MERCKX1000.20%
Trypan blueThermoFisher152500610.40%
Trypsin-EDTAGenviewGP31080.25%
Tween 20MERCKP9416-ספסל
נקי במיוחדLaiTeLT20200705SW-CJ-IFDG
אוניברסלי PCR מאסטר מיקסיישומי ביו-סיסטמס4304437
Vim Abcamab925471:100
מיקרוסקופ קונפוקלי

מקורות

  1. Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. The diagnosis of limbal stem cell deficiency. Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).
  2. Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).
  3. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).
  4. Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).
  5. Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).
  6. Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).
  7. Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).
  8. Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).
  9. Zhu, H., et al. Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).
  10. Basu, S., et al. Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring. Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).
  11. Acar, U., et al. Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).
  12. Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells. Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).
  13. Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells. Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).
  14. Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation. Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).
  15. Li, G., et al. Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model. Scientific Reports. 8, 6566(2018).
  16. Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. Regenerative therapy for the cornea. Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).
  17. Pineda, R. World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease. , Springer, Cham. 299-305 (2020).
  18. Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  19. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  20. Tan, Y., et al. Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration. Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).
  21. Aghamirsalim, M., et al. 3D printed hydrogels for ocular wound healing. Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).
  22. Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies. Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).
  23. Rohaina, C. M., et al. Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane. Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).
  24. O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency. Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).
  25. Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells. Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).
  26. Zeppieri, M., et al. Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice. Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).
  27. Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells. Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).
  28. Hayashi, R., et al. Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells. Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).
  29. Guo, P., et al. Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).
  30. Wang, W., et al. Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).
  31. González, S., Deng, S. X. Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture. Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).
  32. Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes. FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).
  33. Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. Stem cells in the limbal stroma. Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).
  34. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  35. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: Growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

LNCTrypsin EDTAqPCR
בידוד וזיהוי תאי נישה לימבליים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.