שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

Lin Bai; Yaping Wu; Wenshu Dai; Qiuxiao Shi; Lei Wu; Jie Zhang; Lily Zheng

doi:10.3791/65973

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65973

⸱

9 בפברואר 2024

Lin Bai¹^,² , Yaping Wu² , Wenshu Dai¹ , Qiuxiao Shi² , Lei Wu² , Jie Zhang¹^,² , Lily Zheng³

¹Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, NHFPC, West China Hospital, Sichuan University, ²Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, ³Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.

תקציר

הגלומרולי הן יחידות בסיסיות בכליה; לפיכך, לימוד הגלומרולי הוא חיוני להבנת תפקוד הכליות והפתולוגיה. הדמיה ביולוגית מספקת מידע אינטואיטיבי; לכן, יש משמעות רבה לתייג ולהתבונן גלומרולי. עם זאת, שיטות התצפית הגלומרוליות הנמצאות בשימוש כיום דורשות פעולות מסובכות, והתוצאות עלולות לאבד פרטי תווית או מידע תלת מימדי (תלת ממדי). הקוקטיילים הצלולים והבלתי מופרעים של דימות מוחי וניתוח חישובי (CUBIC) של טכנולוגיית ניקוי רקמות נמצאים בשימוש נרחב במחקר הכליות, ומאפשרים זיהוי מדויק יותר ועומק גילוי עמוק יותר. מצאנו כי גלומרולי עכבר יכול להיות מסומן במהירות וביעילות על ידי הזרקת ורידים זנב של משקל מולקולרי בינוני FITC-Dextran ואחריו שיטת ניקוי CUBIC. ניתן לסרוק את כליה העכבר המנוקה על ידי מיקרוסקופ אור (או מיקרוסקופ קונפוקלי כאשר פורסים) כדי לקבל ערימות תמונה תלת ממדיות של כל הגלומרולי בכליה כולה. מעובד עם תוכנה מתאימה, אותות glomeruli יכול להיות דיגיטלי בקלות ולנתח עוד יותר כדי למדוד את מספר, נפח, ותדירות של glomeruli.

מבוא

מספר ונפח glomeruli חשובים מאוד לאבחון וטיפול במחלות כליות שונות 1,2,3,4,5. תקן הזהב של הערכת מספר גלומרולי הוא שילוב הדיסקטור הפיזי / שבר. עם זאת, שיטה זו דורשת ריאגנטים מיוחדים וציוד, מה שהופך אותו איטי ויקר 6,7,8,9. ביופסיה מספקת שפע של מידע, אך ברור ששיטה זו מתאימה רק להערכות גסות^10,11. טכנולוגיות הדמיה רפואית, כולל דימות תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) ורנטגן, נמצאות בשימוש נרחב גם בזיהוי גלומרולרי 12,13,14,15, אך טכנולוגיות כאלה דורשות מכשירים מגושמים. שיטות חדשות, כגון ספקטרומטר מסה¹⁶ (MALDI) או שיטת חתך עבה ודק¹⁷, שימשו גם בזיהוי גלומרולרי, אם כי הן נותרו מייגעות ומייגעות.

בעזרת טכנולוגיות שקיפות ניתן להתבונן לעומקים עמוקים יותר ולקבל מידע עשיר ושלם יותר מרקמות עבות או אפילו איברים שלמים 18,19,20,21,22,23. לכן, טכנולוגיות שקיפות היו בשימוש נרחב במחקר כליות²⁴. התצפית והזיהוי של glomeruli בכליות מנוקות מעורבים גם. עם זאת, מאמרים אלה שפורסמו התייחסו רק בקצרה לזיהוי גלומרולרי²⁵ או השתמשו בשיטות תיוג קשות להשגה כגון חיות טרנסגניות²⁶, צבעים בייצור עצמי¹³, או דגירה נוגדנים בריכוז גבוה²⁷ כדי לתייג את הגלומרולי. בנוסף, למרות שמחקרים ניתחו גלומרולי בכליות מנוקות, הניתוחים היו תמיד מוגבלים¹³ או הסתמכו על אלגוריתמי ניתוח שהוקמו על ידי המחברים עצמם²⁶.

הדגמנו בעבר דרך נוחה יותר לתייג את הגלומרולי בעכברים כליות²⁸. על ידי שימוש ב- Imaris, מצאנו כי ספירת גלומרולי, תדירות ונפח ניתן להשיג במהירות. לכן, כאן אנו מציגים קבוצה נגישה, מקיפה ופשוטה יותר של שיטות כדי לתייג ולנתח את glomeruli של כליות עכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 בוגרים (בני 6 שבועות, 25-30 גרם). כל ההליכים בוצעו בהתאם לתקנות המקומיות של רווחת בעלי חיים ואתיקה ניסויית. המחקר אושר על ידי בית החולים מערב סין של ועדת האתיקה למחקר ביו-רפואי באוניברסיטת סצ'ואן.

1. תיוג גלומרולי והכנת רקמות

תיוג גלומרולי
1. יש להמיס את FITC-דקסטרן (10 מ"ג) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ביחס של 1:1 (1 מ"ג: 1 מ"ל) להכנת תמיסת הבדיקה העובדת.
  הערה: ניתן לאחסן את פתרון העבודה ב- 4 °C למשך חודש אחד.
2. הנח את העכבר C57 בקיבוע ורידים זנב עכבר. להרטיב את הגזה עם מים חמים, לעטוף את הגזה סביב החלק האמצעי של זנב העכבר, ולחמם את הזנב במשך 1 דקות.
3. נגב את זנב העכבר עם אתנול 75% עד שרידי הזנב השמאלי והימני גלויים.
4. צייר 100 μL של פתרון הבדיקה עובד עם מזרק אינסולין 1 מ"ל להזריק לאט את הפתרון לתוך וריד זנב העכבר.
5. לאחר ההזרקה, תן לתמיסת הבדיקה להסתובב במשך 30 דקות. אפשרו לעכברים לנוע בחופשיות בכלובים שלהם.
6. לאחר השגת זרימת דם מספקת, להרדים עמוקות את העכברים על ידי הזרקה intraperitoneal של נתרן pentobarbital (1%, 60-80 מיקרוגרם / ק"ג).
דגימת כליות וקיבוע
1. קבע את העכברים המורדמים לצלחת האנטומית במצב שכיבה. אבטחו את כפותיהם בעזרת סרט רפואי.
2. לאחר הכנת העור, להרדים את העכברים עם מינון קטלני של נתרן pentobarbital (1%, 10 מ"ג / ק"ג).
3. בצע חתך בטן בקו האמצע כדי לחשוף את חלל הבטן.
4. לחשוף את הכליות ולהסיר אותם עם אזמל ומספריים במכסה האדים. הסר את מעטפת הכליה בעדינות.
5. לאסוף את הכליות ולקבע אותם 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 °C (75 °F) במשך הלילה.
6. שטפו את הדגימות עם PBS שלוש פעמים שעה כל אחת עם ניעור בטמפרטורת החדר (RT).
7. הכינו את הכליה למיקרוסקופ.
  1. פורסים את הכליה למיקרוסקופ קונפוקלי: חותכים את הכליה לפרוסות בעובי 1 מ"מ באמצעות מטריצת המוח (1 מ"מ פלדה, 40-75 גרם) כדי לתקנן את עובי הפרוסה. מעבירים את הפרוסות ל-4% PFA וממשיכים בקיבוע ב-4°C למשך הלילה.
  2. כליה שלמה למיקרוסקופ יריעות אור: לתקן את הכליות ב 4% PFA ב 4 ° C במשך 48 שעות.

2. סליקה

הכנת מגיב
1. הכינו מגיב CUBIC-L על ידי ערבוב 10% (wt/wt) N-butyldiethanolamine, 10% (wt/wt) Triton X-100 ו-80% ddH₂O.
2. הכן מגיב CUBIC-R על ידי ערבוב 45% (wt/wt) אנטיפירין, 30% (wt/wt) ניקוטינאמיד, 0.5% (vol/vol) N-butyldiethanolamine ו-24.5% ddH₂O. ודא שלתמיסה יש pH של 9.6-9.8 ומדד שבירה (RI) של 1.522.
  הערה: CUBIC-L משמש להסרת שומנים, ו- CUBIC-R משמש להתאמת אינדקס שבירה.
הליך סליקה
1. לאסוף את דגימות הכליה בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל ולאחר מכן לנקות אותם CUBIC-L עם רעד ב 60 סל"ד ב 37 ° C. יש להחליף את CUBIC-L כל 4 שעות (לפרוסות כליה) או כל 24 שעות (לכליה שלמה) עד להשגת שקיפות אופטית משביעת רצון.
  הערה: תהליך זה לוקח יום אחד עבור פרוסות כליה ו 5 ימים עבור כליה שלמה.
2. שטפו את הדגימות שלוש פעמים ב-PBS בניעור עדין ב-RT במשך שעה כל אחת.
3. יש למרוח CUBIC-R על הדגימות, תוך ניעור הדגימות בטמפרטורה של 37°C, 60 סל"ד למשך 6 שעות.
4. התבונן ישירות בדגימות שסולקו או אחסן אותן בצינורות שחורים מלאים ב- CUBIC-R ב- RT למשך שבוע אחד.

3. רכישת תמונות

הדמיה קונפוקלית
הערה: דמיינו את דגימות הכליה החתוכות במיקרוסקופ קונפוקלי (עדשות: יעד Plan Apo λ 4×/0.2 N1 או יעד Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1). צלם תמונות גדולות (לדוגמה, 6052 מיקרומטר x 6052 מיקרומטר עבור פרוסת הכליה) עם ערימות z.
1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ברצף הבא: כוח לייזר, מתג בקרה קונפוקלית, מחשב, מיקרוסקופ וחומרה קונפוקלית. לאחר הפעלת הבדיקה העצמית, הפעל את התוכנה הקונפוקלית.
2. בחר את העדשה המתאימה. הסר את הדגימה מגיב CUBIC-R, הנח אותה בצלחת הקונפוקלית וכסה אותה כדי למנוע מהמגיב CUBIC-R להתייבש.
3. הזז את הדגימה למרכז שדה הראייה וכוונן את מישור המוקד עד שהיא תהיה ממוקדת.
4. החל שחזור תלת-ממדי (שלב 3.1.4.1) ושחזור תמונה גדולה (שלבים 3.1.4.2-3.1.4.3).
  1. שחזור תלת-ממדי (קונפוקלי): החלף את מישור הזום בכיוון אחד עד שלא תהיה פלואורסצנטיות גלויה; מיקום זה מוגדר כפסגה. לאחר מכן, החלף את מישור הזום בכיוון ההפוך עד שלא תיראה פלואורסצנטיות; מיקום זה מוגדר כתחתון. לחץ על לחצן הפעל בפינה השמאלית התחתונה של תיבת הדו-שיח כדי להתחיל בסריקה.
  2. שחזור תמונה גדול (קונפוקלי): הזיזו את שדה הראייה למרכז הדגימה וקבעו את המיקום הנוכחי כמרכז. בחר שדה ראייה של 2 x 2.
  3. בממשק הרב-תכליתי ND, בחרו באוסף Z כדי לבנות מחדש תמונות גדולות ולהגדיר אפשרויות שונות בחלונית. לאחר מכן לחץ על Run butto n כדי להתחיל בסריקה.
הדמיית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM)
הערה: דמיינו את כל הכליות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהיר (עדשה: EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Medium n = 1.529) objective).
1. צירוף דוגמאות (LSFM):
  1. הדביקו את הכליה השקופה למתאם קיבוע הדגימה והמתינו עד שהכליה מחוברת היטב.
  2. משרים את הכליה בפח הדגימה ודוחפים את סל הדגימה למערכת המיקרוסקופ. סגור את הצוהר.
2. התבוננות וסריקה (LSFM):
  1. בממשק Locate יש להעביר את הדגימה לעמדת תצפית מתאימה. עבור לממשק הרכישה , הגדר את הנתיב האופטי, בחר לייזר 488 ננומטר, LBF 405/488/561/640, בלוק מסנן פיצול אופטי SBS LP 490, בחר מצלמה 2 ושנה את הצבע המדומה לירוק.
  2. מלא את ערך ההסטה Z שמאלי/ימני שהוקלט קודם לכן בתפריט המשנה 'ערוץ '. בחר את גודל התצוגה הקטן ביותר (0.36) וכוונן אותו לקבלת בהירות מרבית.
3. מצא את גבול X\Y ואת טווח Z של האיבר כולו. התאם את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה (רצוי פחות מ- 10 אלפיות השנייה) ולחץ על הפעל כדי להתחיל.
4. אם הרקמה גדולה מדי, מזג שתי תמונות או יותר עם תפירת תמונה. פתח את הקובץ שנלכד באמצעות תוכנת המיקרוסקופיה (כאן, ZEISS ZEN 3.7). בחר Processing > Method > Stitching > Method Parameter > Apply כדי להשלים את תפירת התמונה.

4. עיבוד וכימות נתונים

הערה: עבד את ערימות התמונות באמצעות תוכנת Imaris (ניתוח תמונות), תוך שימוש בפונקציה Surface כדי לתייג את הגלומרולי ולבצע ניתוח.

רוזן גלומרולי
1. ייבא תמונות גדולות (מיקרוסקופ קונפוקלי) או תמונות תפורות (מיקרוסקופ גיליון אור) לתוכנת ניתוח התמונות.
2. פתח את הקבצים בתוכנת ניתוח התמונות. לחץ על לחצן Surface כדי ליצור משטח חדש. עקוב אחר המדריך בחלק השמאלי התחתון של המסך.
  1. לחץ על הלחצן הבא (לחצן חץ ימינה) מבלי לסמן דבר.
  2. סמן את התיבה לפני האפשרות החלקה והזן מספר מתאים (לדוגמה, 14.5) כדי לשלוט בפרטי המשטח. בחר חיסור רקע בסף ומלא את התיבה בקוטר הממוצע המשוער של הגלומרולי. לחץ על הלחצן הבא .
  3. התאם במידת הצורך ולחץ על הלחצן הבא . בחר בטווח המתאים ולחץ על הלחצן הבא ליצירת Surface.
3. לחץ על סנן ולאחר מכן על לחצן הוסף כדי להוסיף כדוריות כדי לסנן אובייקטים שאינם כדוריים. לחץ על לחצן שכפל כדי להעתיק משטח חדש זה.
4. לחץ/י על הכפתור ״סטטיסטיקה״ ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״כולל ״; התוכנה תציג את מספר glomeruli כמספר הכולל של פני השטח.
נפח של glomeruli
1. צור משטח של glomeruli כמו לעיל.
2. לאחר השלמת המשטח, לחצו על הלחצן 'בחירה ' לבחירת אובייקטי היעד ולהצגת עוצמת הקול של כל עצם. לחץ על הלחצן שמור וייצא נתונים סטטיסטיים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
נפח הפרוסה או הכליה כולה
1. ייבא תמונות גדולות (מיקרוסקופ קונפוקלי) או תמונות תפורות (מיקרוסקופ גיליון אור) לתוכנת ניתוח התמונות.
2. פתח קבצים בתוכנת ניתוח התמונות. לחץ על לחצן Surface כדי ליצור משטח חדש. עקוב אחר המדריך בחלק השמאלי התחתון של המסך.
  1. לחץ על הלחצן הבא (לחצן חץ ימינה) מבלי לתקתק.
  2. סמן את התיבה לפני האפשרות החלקה והזן מספר מתאים (לדוגמה, 50) כדי לשלוט בפרטי המשטח. בחר עוצמה מוחלטת בסף. לחץ על הלחצן הבא .
  3. התאם את המשטח עד שיכסה את כל הרקמה ולחץ על הלחצן הבא . לחץ על הלחצן הבא כדי ליצור את Surface.
3. לחץ על הלחצן Selection כדי לבחור את פני השטח של הרקמה כולה ולהציג את עוצמת הקול של הרקמה. לחץ על לחצן שמור כדי לייצא נתונים סטטיסטיים לגיליון אלקטרוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקר זה מספק שיטה פשוטה ויעילה לתיוג וניתוח הגלומרולי בכליות עכברים.

Glomeruli (כלי דם) יכול להיות מסומן היטב על ידי הזרקת כלי דם FITC-Dextran. לאחר תהליך הניקוי הכליה נעשתה שקופה (איור 1A), וניתן היה לראות בבירור את הגלומרולי באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור (איור 1B) או מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 1C). למיקרוסקופ קונפוקלי עומק סריקה מוגבל, ולכן יש לחתוך את הכליות לפרוסות בעובי של כ-1 מ"מ. אם משתמשים במיקרוסקופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכנולוגיות ניקוי רקמות ניתן לסווג 3 או 4 קבוצות 29,30,31. ניקוי רקמות אורגני מבוסס ממס (למשל, DISCO ופגסוס), ניקוי רקמות על בסיס מימי (למשל, CUBIC), וניקוי רקמות הטבעה הידרוג'ל (למשל, CLARITY) יושמו כולם בניקוי כליות 25,26,28,32. CUBIC, כפי שהדגמנו, עובד הכי טוב כאשר glomeruli (כלי) מסומנים עם FITC-Dex...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82204951) ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2020JDRC0102).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4% PFA	Biosharp		7007171800 קיבוע דבק
502	מעדנייה	7146	לקיבוע הכליה למתאם קיבוע הדגימה
אנטיפירין	אלאדין	A110660	מגיב ניקוי
מטריצת מוח	RWD מדעי החיים	1 מ"מ 40-75	חיתוך רקמות
מיקרוסקופיה קונפוקלית	Nikon	A1plus	רכישת תמונה
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	מגיב תיוג
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית גיליון קל	גיליון אור Zeiss	7	רכישת תמונות
עכברים	Ensiweier		בוגרים C57BL/6 עכברים (גיל 6 שבועות, 25 ומעלה; 30 גרם)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	מגיב ניקוי
ניקוטינאמיד	אלאדין	N105042	מגיב ניקוי
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
מקבע ורידים זנב	JINUOTAI	JNT-FS35	תקן את העכבר להזרקת vail
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	מגיב ניקוי

מקורות

Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521(2019).
Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).
Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008(2022).
Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042(2023).
Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

סימון גלומרולים דימות כליות שקיפות רקמה בשיטת CUBIC סימון ב-FITC-Dextran מיקרוסקופיית גיליש אור (Light Sheet Microscopy)מיקרוסקופיה קונפוקלית דימוי תלת-ממדי תוכנה לניתוח תמונות כימות גלומרולים

שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר