מאמר שיטה

הדמיה מרובת תאים חיים לתגובות תרופתיות במודלים אורגנואידים שמקורם בחולה של סרטן

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66072

⸱

5 בינואר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Cancer Biology Graduate Program, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3The Institute of Cancer Research: and the Royal Marsden NHS Foundation Trust, 4Department of Radiation Oncology, Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Division of Molecular Medicine, Departments of Internal Medicine and Obstetrics and Gynecology, University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center, 6Agilent Technologies, 7Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה הם מערכת מודל מתוחכמת למחקר בסיסי ותרגומי. מאמר שיטות זה מפרט את השימוש בדימות תאים חיים פלואורסצנטיים מרובים להערכה קינטית בו זמנית של פנוטיפים אורגנואידים שונים.

תקציר

מודלים אורגנואידים הנגזרים ממטופל (PDO) של סרטן הם מערכת מחקר רב-תכליתית המשחזרת טוב יותר מחלות אנושיות בהשוואה לשורות תאים סרטניים. מודלים של PDO יכולים להיווצר על ידי תרבית תאי גידול של חולים בתמציות קרום מרתף חוץ-תאיות (BME) וציפוים ככיפות תלת-ממדיות. עם זאת, ריאגנטים זמינים מסחרית אשר עברו אופטימיזציה עבור בדיקות פנוטיפיות בתרבויות monolayer לעתים קרובות אינם תואמים BME. במאמר זה, אנו מתארים שיטה להצלחת מודלים של PDO ולהערכת השפעות של תרופות באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית של תאים חיים. בנוסף, אנו מיישמים צבעים פלואורסצנטיים התואמים למדידות קינטיות כדי לכמת את בריאות התא ואת האפופטוזיס בו זמנית. ניתן להתאים אישית לכידת תמונה כך שתתרחש במרווחי זמן קבועים במשך מספר ימים. משתמשים יכולים לנתח השפעות של סמים בתמונות בודדות של מישור Z או הקרנת Z של תמונות טוריות ממישורי מוקד מרובים. באמצעות מיסוך מחושבים פרמטרים ספציפיים של עניין, כגון מספר PDO, שטח ועוצמת פלואורסצנטיות. אנו מספקים נתוני הוכחת היתכנות המדגימים את ההשפעה של חומרים ציטוטוקסיים על בריאות התא, אפופטוזיס וכדאיות. ניתן להרחיב פלטפורמת הדמיה קינטית אוטומטית זו לקריאות פנוטיפיות אחרות כדי להבין השפעות טיפוליות מגוונות במודלים של סרטן PDO.

מבוא

אורגנואידים סרטניים שמקורם בחולה (PDOs) מתפתחים במהירות כמערכת מודל חזקה לחקר התפתחות סרטן ותגובות טיפוליות. PDOs הן מערכות תרבית תאים תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) המשחזרות את הפרופיל הגנומי המורכב ואת הארכיטקטורה של הגידול הראשוני 1,2. שלא כמו תרביות דו-ממדיות מסורתיות (2D) של קווי תאים סרטניים אימורטליים, PDOs לוכדים ושומרים על הטרוגניות תוך-גידולית 3,4, מה שהופך אותם לכלי רב ערך הן למחקר מכניסטי והן למחקר תרגומי. למרות ש-PDOs הופכים למערכת מודל פופולרית יותר ויותר, ריאגנטים זמינים מסחרית ושיטות ניתוח עבור אפקטים תאיים התואמים לתרביות PDO מוגבלים.

היעדר שיטות חזקות לניתוח שינויים עדינים בתגובה לטיפול מעכב תרגום קליני. מגיב בריאות התא תקן הזהב בתרביות תלת-ממד, CellTiter-Glo 3D, משתמש ברמות ATP כגורם הקובע את כדאיות התא 5,6. בעוד מגיב זה שימושי עבור בדיקות נקודות קצה, ישנם מספר אזהרות, בעיקר חוסר היכולת להשתמש בדגימות למטרות אחרות לאחר השלמת הבדיקה.

דימות תאים חיים הוא צורה מתוחכמת של מיקרוסקופ קינטי אשר, בשילוב עם ריאגנטים פלואורסצנטיים, יש לו את היכולת לכמת מגוון של קריאות בריאות התא בתוך מודלים PDO, כולל אפופטוזיס 7,8,9 וציטוטוקסיות10. ואכן, הדמיה של תאים חיים הייתה חלק בלתי נפרד מסינון בתפוקה גבוהה של תרכובות בפלטפורמות דו-ממדיות11,12. מערכות כגון Incucyte הפכו את הטכנולוגיה לזולה ולכן נגישה לקבוצות מחקר במגוון מסגרות. עם זאת, היישום של מערכות אלה לניתוח תרבויות תלת ממדיות עדיין בחיתוליו.

במאמר זה אנו מתארים שיטה להערכת תגובת תרופות במודלים של סרטן PDO באמצעות הדמיה מרובת תאים חיים (איור 1). באמצעות ניתוח של תמונות שדה בהירות, ניתן לנטר באופן קינטי שינויים בגודל PDO ובמורפולוגיה. יתר על כן, תהליכים תאיים יכולים להיות מכומתים בו זמנית לאורך זמן באמצעות ריאגנטים פלואורסצנטיים, כגון Annexin V Red Dye עבור אפופטוזיס ו Cytotox Green Dye עבור ציטוטוקסיות. השיטות המוצגות מותאמות למערכת ההדמיה Cytation 5 של תאים חיים, אך פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם על פני פלטפורמות דימות שונות של תאים חיים.

פרוטוקול

מחקרים המשתמשים בדגימות גידול אנושי נבדקו ואושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת איווה (IRB), פרוטוקול #201809807, ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים כפי שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר. הסכמה מדעת התקבלה מכל הנבדקים שהשתתפו במחקר. קריטריוני ההכללה כוללים אבחנה של סרטן וזמינות של דגימות גידול.

1. ציפוי PDO שלם בצלחת 96 בארות

  1. הכינו ריאגנטים.
    1. מחממים מראש צלחות 96 באר ב 37 ° C לילה להפשיר BME לילה ב 4 ° C.
    2. הכינו מדיה מלאה של תרבית אורגנואידים המותאמת לטיפוח סוג הסרטן המעניין. אמצעי תרבות ספציפיים המשמשים לניסויים המוצגים כאן מובאים בטבלה משלימה 1.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לשנות רכיבי מדיה עבור סוגי גידולים שונים. לדוגמה, מדיה תרבית אורגנואידים הוא בתוספת 100 ננומטר אסטרדיול עבור גידולים גינקולוגיים13. מדיה מוכנה יציבה ב 4 °C (75 °F) למשך חודש אחד. לאחסון לטווח ארוך, aliquot את המדיה לתוך צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
  2. הכינו שני aliquots נפרדים של מדיה תרבית אורגנואיד ב 4 ° C ו 37 ° C. לדוגמה, אם 60 בארות מצופות בצלחת של 96 בארות, השתמש ב- 6 מ"ל של מדיה תרבית אורגנואידים חמה ו- 150 מיקרוליטר של מדיה של תרבית אורגנואידים קרה כקרח.
  3. הכינו חיץ שטיפה אורגנואידי: יש להוסיף PBS אחד עם 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA ו-10 μM Y-27632. יש לאחסן ב-4°C
  4. קצרו PDOs בתרבית בצלחת של 24 בארות. בצעו את כל השלבים על קרח או בטמפרטורה של 4°C, אלא אם כן נאמר אחרת.
    1. שאפו מדיה מכל באר באמצעות מערכת קווי ואקום.
    2. הוסף 500 μL של חיץ שטיפת אורגנואידים קר כקרח ופיפטה עדינה 2-3x באמצעות פיפטור 1000 μL. דוגרים על הצלחת על קרח במשך 10 דקות.
    3. מעבירים את תכולת כל באר לצינור חרוטי של 50 מ"ל. כדי להבטיח שכל ה-PDOs נמצאים בהשעיה, שטפו כל באר ב-300 μL נוספים של חיץ שטיפה אורגנואידי והעבירו לצינור החרוטי של 50 מ"ל. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-350 x גרם ב-4°C
    4. שאפו את הסופרנאטנט מכדורית BME/אורגנואיד באמצעות מערכת קווי ואקום, והשאירו ~ 5 מ"ל שנותרו בצינור. הוסף 20 מ"ל של חיץ שטיפה אורגנואיד והשהה מחדש בעדינות את הגלולה באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. דוגרים על קרח במשך 10 דקות.
    5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 350 x גרם ב 4 ° C. שאפו את הסופרנאטנט עם מערכת קווי ואקום, תוך הקפדה שלא לשבש את גלולת ה-PDO.
  5. ציפוי PDO בצלחת של 96 בארות: בצעו את כל השלבים על קרח אלא אם כן צוין אחרת.
    1. השהה מחדש את גלולת ה-PDO בכמות מתאימה של תרבית אורגנואידים קרה כקרח כדי ליצור מתלה PDO. העבר את מתלה PDO לצינור מיקרוצנטריפוגה קר כקרח של 1.5 מ"ל.
      הערה: כדי לחשב את כמות מדיית התרבית האורגנואידית, קבע את מספר הבארות שיש לצפות בצלחת של 96 בארות, תוך התחשבות בכך ש- PDO מצופים בכיפה של 5 μL ביחס של 1:1 של מדיה של תרבית אורגנואידים ו- BME. לדוגמה, כאשר מצפים צלחת אחת של 96 בארות ומשתמשים רק ב-60 הבארות הפנימיות, הסכום הכולל של מתלה PDO הדרוש יהיה 300 μL: 150 μL מדיה של תרבית אורגנואידים ו-150 μL BME. עבור מודלים המציגים צמיחה אופטימלית באחוזים שונים של BME, היחס בין BME: מדיה עשוי להשתנות בשלב זה, אם כי חשוב לתקנן את היחס בכל הבדיקות עבור כל מודל ספציפי. כדי להתחשב בשגיאת צנרת, הוסף 10% אמצעי אחסון לכל רכיב.
    2. ספור את מספר PDOs.
      1. העבר 2.5 μL של תרחיף PDO לצינור מיקרוצנטריפוגה קר כקרח של 1.5 מ"ל וערבב עם 2.5 μL של BME. העבירו את תערובת 5 μL למגלשת מיקרוסקופ זכוכית נקייה. אל תכסה את המגלשה. התערובת תתמצק לכיפה.
      2. דמיינו זאת באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר במהירות של 4x. לספור את מספר PDOs בתערובת 5 μL; המטרה היא שיהיו בערך 25-50 PDOs לכל 5 μL כיפה.
        הערה: אם הצפיפות הרצויה אינה מושגת בתערובת הבדיקה, התאם את הנפח הסופי של מתלה ה-PDO על-ידי הוספת מדיה נוספת של תרבית אורגנואידים או צנטריפוגה של מתלה ה-PDO והשעיה מחדש של כדורית ה-PDO בנפח נמוך יותר של מדיית תרבית אורגנואידים קרה כקרח. ללא קשר לאופן שבו מתלי PDO משתנים בשלב זה, היחס הסופי של BME: השעיית PDO בשלב 1.5.3. צריך להיות 1:1.
    3. באמצעות פיפטור של 200 μL עם קצוות רחבים, ערבבו בזהירות מתלי PDO עם כמות שווה של BME כדי להשיג יחס של 1:1 בין מדיה של תרבית אורגנואידים ל-BME. הימנעו מבועות, אשר ישבשו את שלמות הכיפות.
    4. באמצעות פיפטור 20 μL, זרע 5 μL כיפות למרכז כל באר של צלחת 96 בארות שחוממה מראש, זורע רק את 60 הבארות הפנימיות. כדי להבטיח חלוקה שווה של PDOs, מעת לעת pipet התוכן של צינור 1.5 מ"ל עם pipettor 200 μL עם קצוות רחבים.
    5. לאחר שכל הבארות נזרעו, מניחים את המכסה על הצלחת והופכים בעדינות. דגרו על הצלחת ההפוכה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באינקובטור תרביות הרקמה כדי לאפשר לכיפות להתמצק.
      הערה: היפוך הצלחת מבטיח שכיפת המדיה של תרבית BME/אורגנואידים שומרת על המבנה התלת-ממדי כדי לספק מספיק מקום להיווצרות PDO.
    6. הופכים את הצלחת כך שהיא יושבת עם המכסה למעלה ודגרים במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

2. טיפולים והוספת צבעים פלואורסצנטיים לריבוב

  1. בעוד כיפות BME מתמצקות בלוחות 96 בארות, הכינו דילולים של ריאגנטים של הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים. פרמטרים ספציפיים לריבוב Annexin V Red Dye ו- Cytotox Green Dye ניתנים כאן.
  2. הכנת ריאגנט פלואורסצנטי (יום -1): חשב את הנפח המתאים של מדיה תרבית אורגנואידית בהתבסס על מספר הבארות שיש לטפל, בהנחה שכל באר תטופל עם 100 μL של מדיה במינון צבע. יש לדלל את הצבע בתרבית אורגנואידים שחוממה מראש לריכוז הרצוי.
    הערה: כמות המדיה הכוללת הדרושה תשתנה בהתאם לניסוי. הוסף 10% לאמצעי האחסון הסופי כדי להתחשב בשגיאת צנרת. לדוגמה, כדי לטפל ב-60 הבארות הפנימיות של צלחת בת 96 בארות, הכינו 6.6 מ"ל של מדיה במינון צבע (טבלה 1).
  3. טפל בכל באר עם 100 μL של 2x מצע תרבית אורגנואידים במינון צבע. הוסף 200 μL של סטרילי 1x PBS לבארות הריקות החיצוניות של הצלחת. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה.
    הערה: PBS בבארות ההיקפיות מקטין את אידוי המדיה מהבארות הפנימיות.
  4. הוספת תרופות/חומרי טיפול (יום 0): הכינו תרופות בתרבית אורגנואידים שחוממה מראש בריכוז של פי 2 בנפח של 100 מיקרוליטר לבאר.
    הערה: DMSO יכול להיות רעיל לתאים בריכוזים גבוהים. ריכוז של 0.1% DMSO אינו עולה על הניסויים שבוצעו במחקר זה. בנוסף לתרופות, כמה ריאגנטים פלואורסצנטיים מופצים כפתרון DMSO. חשוב לקחת בחשבון את ריכוז DMSO הכולל בעת עבודה עם ריאגנטים כאלה.
  5. הוסף 100 μL של מדיה 2x מינון צבע לכל באר; הימנעו מיצירת בועות.

3. הגדרת פרמטרי הדמיה

  1. מניחים את הצלחת בציטציה 5. פתוח תוכנת Gen5. לחץ על New Task > Imager Manual Mode. בחר לכוד כעת והזן את ההגדרות הבאות: מטרה (בחר הגדלה רצויה); מסנן (בחר microplate); פורמט Microplate (בחר מספר בארות); וסוג כלי (בחר סוג לוחית). לחצו על 'השתמש במכסה ' ועל 'השתמש במהירות ספק איטית יותר'. לחץ על אישור.
    הערה: סוג כלי: היה ספציפי ככל האפשר בעת בחירת מידע על הצלחת מכיוון שהתוכנה מכויילת למרחק הספציפי מהמטרה לתחתית הצלחת עבור כל סוג צלחת ועובי הפלסטיק.
    מהירות נשא איטית יותר: בחר תיבה זו כדי למנוע הפרעה לכיפות בעת טעינה/פריקה של לוחות.
  2. צור Z-Stack שיצלם את כל כיפת BME.
    1. בחר באר מעניינת לצפייה (פאנל שמאלי, מתחת להיסטוגרמה).
    2. בחר בערוץ Bright Field (החלונית השמאלית, העליונה). לחץ על חשיפה אוטומטית והתאם הגדרות לפי הצורך.
    3. הגדר את החלק התחתון והעליון של הכרטיסיה Z-Stack: הרחב את הכרטיסיה 'מצב הדמיה ' (לוח שמאלי, אמצעי). סמן את התיבה Z-Stack . באמצעות חיצי התאמת המסלול (לוח שמאלי, אמצעי), לחץ על ההתאמה למטה עד שכל ה- PDO ייכנסו לתוקף ולאחר מכן יצאו מהמיקוד ויהיו מטושטשים. הגדר זאת כתחתית Z-Stack. חזור על הפעולה בכיוון ההפוך באמצעות חיצי התאמת המסלול כדי לקבוע את החלק העליון של מחסנית Z.
    4. כדי לוודא שהגדרות Z-Stack מתאימות לבארות מעניינות אחרות, בחר באר אחרת (לוח שמאלי, מתחת להיסטוגרמה) והצג באופן חזותי את החלק העליון והתחתון של Z-Stack.
    5. להזנה ידנית של מיקומי המוקד, לחצו על שלוש הנקודות שליד ההתאמה העדינה (החלונית השמאלית, העליונה). ייפתח חלון; הקלד בערך Z-Stack העליון (נמצא בחלונית השמאלית, במרכז, תחת מצב הדמיה). חזור על הפעולה עבור ערך Z-Stack התחתון. התאם לפי הצורך כדי ללכוד את טווח Z הרצוי על ידי חזרה על שלב 3.2.3. אם היה צורך בהתאמות, בחר באר אחרת כדי לאמת הגדרות.
  3. קבעו את הגדרות החשיפה לתעלות הפלואורסצנטיות. ההגדרות מתוארות עבור שני ערוצים פלואורסצנטיים (GFP ו- TRITC). המספר הספציפי של תעלות פלואורסצנטיות יהיה תלוי בניסוי ואילו קוביות פלואורסצנטיות יותקנו במערכת הדמיה של תאים חיים.
    הערה: אם עוצמת האות צפויה להיות גבוהה משמעותית בסוף הניסוי, על המשתמשים לשקול לבצע ניסויי בדיקה כדי לקבוע את הגדרות החשיפה האופטימליות בסוף הניסוי שניתן ליישם בעת הגדרת הפרמטרים הראשוניים.
    1. הרחיבו את הכרטיסייה 'מצב הדמיה ' (החלונית השמאלית, האמצעית) ופתחו את 'עריכת שלב הדמיה'. יופיע חלון מוקפץ.
    2. תחת ערוצים, לחץ על הבועה עבור מספר הערוצים הרצוי. הקצו ערוץ אחד לשדה בהיר וערוצים נוספים לכל ערוץ פלואורסצנטי. בדוגמה זו, ערוץ 1 = שדה בהיר; ערוץ 2 = GFP; ערוץ 3 = TRITC. באמצעות התפריטים הנפתחים צבע , בחר את ההגדרה המתאימה לכל ערוץ. סגור את חלון העריכה על-ידי לחיצה על אישור.
    3. הגדר כל ערוץ פלורסנט.
      1. העבר את הערוץ ל- GFP (לוח שמאלי, למעלה).
      2. לחץ על חשיפה אוטומטית (החלונית השמאלית, למעלה). הרחב את הכרטיסיה חשיפה (חלונית שמאלית, אמצעית) וכוונן את הגדרות החשיפה כדי למזער את אות הרקע.
      3. העתק את הגדרות החשיפה לכרטיסייה מצב תמונה לפי השלבים 3.3.3.3-3.3.6.
      4. לחץ על העתק סמל לצד התיבה ערוך שלב הדמיה . לחץ על ערוך שלב הדמיה, שיפתח חלון אחר.
      5. תחת ערוץ GFP, לחץ על סמל הלוח בשורה חשיפה כדי להוסיף את ההגדרות 'תאורה', 'זמן שילוב' ו'רווח מצלמה ' לערוץ.
      6. חזור על שלבים 3.3.3.4-3.3.3.5 עבור ערוץ TRITC. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון.
  4. הגדירו את שלבי עיבוד התמונה המקדים והקרנת Z כדי להפוך את עיבוד התמונה המקדים לאוטומטי.
    1. לחץ על סמל המצלמה (פאנל שמאלי, פינה תחתונה). ייפתח חלון חדש.
    2. תחת Add Processing Step (החלונית השמאלית, התחתונה), לחץ על Image Preprocessing. ייפתח חלון חדש.
    3. בכרטיסיה שדה בהיר , בטל את הבחירה באפשרות החל עיבוד מקדים של תמונה.
    4. לכל כרטיסייה 'ערוץ פלואורסצנטי ', ודאו שהאפשרות 'החל עיבוד מקדים של תמונה ' נבחרה. בטלו את הבחירה באפשרות 'השתמש באותן אפשרויות כמו ערוץ 1 ' ולחצו על הלחצן 'אשר'. החלון ייסגר.
    5. תחת הוסף שלב עיבוד, לחץ על Z Projection. ייפתח חלון חדש. אם תרצה, התאימו את טווח הפרוסה (לדוגמה, כדי לצמצם את טווח Z). סגור את החלון על-ידי בחירה באפשרות אישור.
  5. צור פרוטוקול.
    1. לחץ על Image Set בסרגל הכלים. בתפריט הנפתח, לחץ על צור ניסוי מתוך ערכת תמונות זו. חלון ההדמיה ייסגר וחלון ההליך ייפתח.
      הערה: הפרמטרים שנבחרו במצב Imager Manual ייטענו אוטומטית בחלון החדש, כך שניתן יהיה ליצור פרוטוקול ניסיוני.
    2. הגדרת הטמפרטורה ומעבר הצבע: לחץ/י על ״הגדר טמפרטורה״ תחת הכותרת ״פעולות״ (משמאל). ייפתח חלון חדש. בחר אינקובטור מופעל והזן ידנית את הטמפרטורה הרצויה תחת טמפרטורה. לאחר מכן, תחת הדרגתי, הזן ידנית 1. סגור את החלון על-ידי בחירה באפשרות אישור.
      הערה: יצירת שיפוע של 1°C תמנע היווצרות עיבוי על מכסה הצלחת.
    3. ייעד בארות לתמונה.
      1. לחץ פעמיים על שלב התמונה תחת תיאור. לחץ על צלחת מלאה (פינה ימנית, למעלה). פעולה זו תפתח את החלון פריסת לוחות .
      2. הדגש בארות עניין באמצעות הסמן. לחץ על אישור. אם תרצה, סמן את התיבות Autofocus Binning ו - Capture Binning . לחץ על אישור כדי לסגור את החלון.
        הערה: Binning ידרוש התאמת חשיפה, כמתואר בשלב 3.3.3.2 לעיל. עיין בסעיף דיון לקבלת תרחישים ספציפיים שבהם ניתן להשתמש בתכונה זו.
    4. הגדר מרווחי זמן עבור הדמיה קינטית.
      1. לחץ על אפשרויות תחת הכותרת אחר (משמאל). סמן את התיבה הליך קינטי לא רציף .
      2. תחת זמן כולל משוער, הזן את זמן הריצה של הניסוי (לדוגמה, 5 ימים). תחת מרווח זמן משוער, הזן את מרווח הזמן כדי לצלם את הלוח (לדוגמה, כל 6 שעות).
      3. לחץ על השהה לאחר כל ריצה כדי לאפשר זמן להעברת הצלחת לאינקובטור. סגור את החלון על-ידי בחירה באפשרות אישור.
    5. עדכן שלבים להפחתת נתונים.
      1. לחץ על אישור כדי לסגור את חלון הפרוצדורה. תיפתח כרטיסייה לעדכון שלבי הפחתת הנתונים. בחר כן. לחץ פעמיים על עיבוד מקדים של תמונה. לחץ בין הערוצים השונים כדי לאמת את ההגדרות ולחץ על אישור.
      2. לחץ פעמיים על Z Projection. לחץ בין הערוצים השונים כדי לאמת הגדרות. לחץ על אישור. לאחר מכן, לחץ שוב על אישור כדי לסגור את חלון הפחתת הנתונים.
    6. עצב את פריסת הלוחות.
      1. פתח את אשף פריסת הלוחות והקצה סוגי בארות לפי שלבים 3.6.2-3.6.3.
      2. לחץ על סמל פריסת לוחות בסרגל הכלים (פינה שמאלית, למעלה) כדי לפתוח את אשף פריסת הלוחות.
      3. סמן את התיבות לצד סוגי הבארות ששימשו בניסוי. תחת פקדי Assay, הזן את מספר סוגי הפקדים השונים באמצעות החצים. לחץ על הבא כדי לפתוח את החלון Assay Control #1 .
      4. הגדר תנאי באר של פקד assay לפי שלבים 3.6.5-3.6.8.
      5. בחלון Assay Control #1, הזן את תווית הפקד בתיבה מזהה פריסת לוחית . אם תרצה, הזן את השם המלא בתיבה הסמוכה. בחר את מספר העותקים המשוכפלים עבור תנאי הבקרה המתאים באמצעות החצים.
      6. אם אתה משתמש בריכוזים מרובים או בסדרת דילול בתוך הפקד, לחץ על הגדר דילולים/ריכוזים והשתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור את סוג. הזן ערכים לכל ריכוז/דילול בטבלה.
        הערה: ניתן להשתמש בפונקציה האוטומטית אם הריכוזים משתנים בהפרש קבוע.
      7. בחר בכרטיסיה צבע בסרגל הכלים. בחר צבע טקסט וצבע רקע רצויים לשליטה בתפריט הנפתח. לחץ על הבא.
      8. חזור על הפעולה לפי הצורך באמצעות פקדים נוספים.
      9. הגדר תנאי באר לדוגמה לפי 3.6.10-3.6.12.
      10. בדף Sample Setup , הזן את קידומת מזהה הדוגמה (לדוגמה, SPL). בחר את מספר העותקים המשוכפלים באמצעות החצים. אם אתה משתמש בדגימות עם ריכוזי טיפול משתנים, בחר ריכוזים או דילולים בתפריט הנפתח סוג . הזן דילולים/ריכוזים בטבלה והזן יחידות בתיבה יחידה .
      11. בחר שדות זיהוי בסרגל הכלים. הזן את שמות הקטגוריות הרצויים (לדוגמה, מזהה מדגם, תרופה) בטבלה.
      12. בחר בכרטיסיה צבע בסרגל הכלים. בחר צבע שונה לכל קבוצת טיפול/דגימה. לחץ על סיום. פעולה זו תפתח את הדף פריסת לוחות.
        הערה: המספרים בצד שמאל תואמים למספרי המדגם השונים.
      13. הקצה מזהים לדוגמה לפי שלבים 3.6.14-3.6.16.
      14. בחר SPL1 מהפאנל השמאלי. השתמש בסמן כדי לבחור בארות.
        הערה: ניתן לכוונן כלי בחירה אוטומטית בתיבת ההקצאה הטורית. ניתן להגדיר מראש את מספר העותקים המשוכפלים והכיוון של הפריסה.
      15. חזור על הפעולה עם דוגמאות אחרות כדי להשלים את פריסת הלוחות. לאחר שביעות רצון, לחץ על אישור.
      16. בסרגל הכלים קובץ , בחר מזהים לדוגמה. מלא עמודות מזהה לדוגמה עם המידע המתאים עבור כל דגימה (לדוגמה, סוג תרופה). לחץ על אישור.
    7. שמור את הפרוטוקול.
      1. בסרגל הכלים, לחץ על File > Save Protocol as. בחר את המיקום לשמירת הקובץ. הזן שם קובץ. לחץ על שמור כדי לסגור את החלון.
      2. לחץ על File > Exit בסרגל הכלים. כרטיסייה תיפתח כדי לשמור שינויים במצב Imager ידני. בחר לא.
      3. תיפתח כרטיסייה לשמירת שינויים בניסוי 1. בחר לא. תיפתח כרטיסייה לעדכון הגדרת הפרוטוקול. בחר עדכן. סגור את התוכנה.
  6. ייבא את הפרוטוקול לתוך BioSpa OnDemand וסיים את הגדרת הניסוי.
    1. פתח את תוכנת BioSpa OnDemand (תוכנת תזמון).
    2. בחר חריץ זמין בתוכנה.
    3. הסר את הצלחת ממערכת ההדמיה של תאים חיים. לחץ על פתח מגירה כדי לגשת לחריץ המתאים בתוכנת התזמון והכנס את הצלחת. לחץ על סגור מגירה.
      הערה: ניתן לבצע שלב זה בכל שלב לאחר יצירת הפרוטוקול בשלב 3.5.7 לעיל. עם זאת, הצלחת חייבת להיות ב- Cytation 5 כדי לבצע ריצת תזמון בשלב 3.6.4.3 להלן.
    4. ייבא את הפרוטוקול.
      1. תחת הכרטיסיה פרטי הליך , בחר משתמש בתפריט הנפתח. לצד חריץ הפרוטוקול , לחץ על בחר > הוסף ערך חדש.
      2. לצד חריץ הפרוטוקול, לחץ על בחר. פעולה זו תפתח חלון חדש כדי לנווט לפרוטוקול הרצוי בארכיטקטורת הקבצים. לחץ על פתח כדי לייבא את הפרוטוקול לתוכנת התזמון.
      3. הזן את משך הזמן הדרוש לתמונת הצלחת. לחץ על אישור כדי לסגור את החלון Gen5 Protocol List .
        הערה: שלב זה חשוב במיוחד בעת הפעלת מספר ניסויים בו זמנית. כדי לקבוע את הזמן הדרוש לתמונה, לחץ על בצע הפעלת תזמון כעת. לחץ על אישור.
    5. קבעו מרווחי הדמיה ותזמנו את הניסוי.
      1. תחת מרווח, הזן את מרווח הזמן להדמיה שצוין בשלב 3.5.4.
      2. תחת אפשרויות שעת התחלה, בחר כאשר זמין. תחת משך, בחר קבוע או רציף.
        הערה: ניתן לקבוע זמן התחלה ספציפי במקום להפעיל את הפרוטוקול בזמן הזמין הבא. בחירה באפשרות משך קבוע תגדיר נקודת קצה ספציפית לניסוי ותחייב את המשתמש להקצות מסגרת זמן לניסוי. משך רציף יאפשר לניסוי לפעול ללא נקודת קצה וניתן לסיים אותו רק על ידי משתמש שיפסיק את הניסוי.
      3. לחץ על לוח זמנים/כלי. פעולה זו תפתח את רצף אימות הלוחות. כרטיסייה תיפתח עם זמן הקריאה הראשונה המוצע. לחץ על כן כדי לקבל לוח זמנים זה.

4. ניתוח תמונות בתוכנת Gen5 (איור 2)

  1. מודול ניתוח תמונה פתוחה.
    1. פתח את דור 5. במנהל המשימות, בחר ניסויים > פתוח. בחר את הניסוי כדי לפתוח את הקובץ. לחץ על Plate > View בסרגל הכלים.
    2. שנה את התפריט הנפתח נתונים ל - Z Projection. לחץ פעמיים על באר של עניין. בחר נתח > ברצוני להגדיר שלב חדש להפחתת נתוני ניתוח תמונות. לחץ על אישור.
  2. אנליזה תאית
    1. מסיכה ראשית
      1. תחת הגדרות ניתוח, בחר סוג: ערוץ ניתוח וזיהוי תאים: ZProj[Tsf[שדה בהיר]] (לוח שמאלי, מרכז).
      2. לחץ על אפשרויות. פעולה זו תפתח את הדף מסיכה וספירה ראשיות . בתיבה סף , סמן את אוטומטי ולחץ על החל. לחצו על התיבה 'סימון עצמים ' (החלונית הימנית, התחתונה) כדי להציג עצמים בתוך הסף המיועד. התאם לפי הצורך כדי לכלול אובייקטים מעניינים.
        הערה: הגדרות הסף מבוססות על עוצמת הפיקסלים. לדוגמה, אם הסף מוגדר על 5000, פיקסלים בעוצמה גדולה מ- 5000 ייכללו בניתוח.
      3. תחת בחירת אובייקט, הגדר את גודל האובייקט המינימלי והמרבי (μm). התאימו לפי הצורך כדי לא לכלול פסולת תאית/תאים בודדים.
        הערה: גודל PDO עשוי להשתנות באופן משמעותי בין דגמים וסוגים שונים. השתמש בכלי המדידה בתוכנת Gen5 כדי לקבוע את ערכי הסף המינימליים והמרביים של גודל PDO עבור כל דגם. משתמשים יכולים לבחור סף גודל PDO מינימלי קטן יותר ביחס לערך שסופק על ידי כלי המדידה על מנת למנוע אי הכללה של מקטעי PDO בנקודות זמן מאוחרות יותר לאחר הטיפול התרופתי.
      4. להגבלת הניתוח לאזור מסוים בבאר, בטלו את הבחירה באפשרות 'נתח את כל התמונה ' ולחצו על 'הכנס'. בחלון תקע תמונה , השתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור צורת תקע . התאם את פרמטרי הגודל והמיקום לפי הצורך כדי להתאים לאזור העניין.
        הערה: חשוב להגדיל את מספר ה-PDO בתוך התקע ובמקביל לא לכלול אזורים נטולי PDO כדי למזער את הרקע. הקצה גודל תקע שילכוד באופן עקבי את רוב האובייקטים המעניינים בעותקים משוכפלים. יצירת תקע שאינו כולל גם את שולי הכיפה חשובה מכיוון שהיא אינה כוללת עצמים שעלולים להיראות מעוותים עקב שבירת האור מהעקמומיות הקיצונית של הכיפה סביב הקצוות. ניתן גם לבטל את הבחירה באפשרות 'כלול אובייקטים בקצה הראשי ' כדי ללכוד רק רכיבי PDO שלמים בתוך התקע.
    2. ניתוח תת-אוכלוסייה. דוגמה להגדרת תת-אוכלוסייה מובאת באיור 3.
      1. לחצו על 'מדדים מחושבים' בסרגל הכלים 'ניתוח סלולרי '. לחץ על בחר או צור מדדי עניין ברמת האובייקט (פינה שמאלית, למטה). תחת מדדי אובייקטים זמינים , בחר מדדים בעלי עניין (לדוגמה, מעגליות) ולחץ על הלחצן הוסף . לחץ על אישור.
        הערה: המורפולוגיה והצפיפות של כל מודל PDO יקבעו את המדדים הטובים ביותר להבחנה בין תת-האוכלוסייה.
      2. לחצו על Subpopulation Analysis בסרגל הכלים Cellular Analysis . לחץ על הוסף כדי ליצור תת-אוכלוסייה חדשה. ייפתח חלון מוקפץ.
      3. אם תרצה, הזן שם עבור אוכלוסיית המשנה. תחת מדדי אובייקטים, בחר מדד מעניין ולחץ על הוסף תנאי. בחלון Edit Condition , הזן פרמטרים למדד האובייקט שנבחר. חזור על הפעולה עם מדדים נוספים לפי הצורך.
        הערה: ניתן לכוונן פרמטרים באופן ידני או להגדיר אותם באמצעות כלי האיתור. לדוגמה, כדי לא לכלול לכלוך, משתמשים יכולים להוסיף שטח כמדד אובייקט ולבחור עצמים קטנים מ- 800. מעגליות כמדד אובייקט נמצאת בשימוש שגרתי, וכל אובייקט עם מעגליות גדולה מ- 0.2-0.5 נכלל, בהתאם לדגם.
      4. בטבלה בתחתית החלון, בדוק את התוצאות הרצויות להצגה. לחץ על אישור > החל.
      5. כדי להציג את האובייקטים בתוך אוכלוסיית המשנה, השתמש בתפריט הנפתח פרטי אובייקט (חלונית ימנית, מרכז) כדי לבחור את אוכלוסיית המשנה. אובייקטים הנופלים בתוך הפרמטרים יודגשו בתמונה.
        הערה: כדי לשנות את צבעי הסימון של המסיכה הראשית ותת-האוכלוסייה, לחץ על הגדרות (לוח ימני, למטה).
      6. כדי להתאים פרמטרים של תת-אוכלוסייה, פתח מחדש את החלון ניתוח תת-אוכלוסייה מסרגל הכלים ניתוח תאים . בחר את אוכלוסיית המשנה ולחץ על ערוך. לחץ על הוסף שלב.
        הערה: פעולה זו תחיל את אותו ניתוח על כל הבארות בתוך הניסוי בכל נקודות הזמן. בתפריט הנפתח בדף מטריצה, ניתן לבחור מדדים שונים לצפייה אישית.

5. ייצוא נתונים מדור 5 לאקסל

  1. כדי להתאים אישית קובץ נתונים לייצוא, בחר בסמל Report/Export Builders בסרגל הכלים. בחלון המוקפץ, לחץ על ייצוא חדש ל- Excel.
  2. בדף Properties בחלון המוקפץ, בחר Scope > Plate and Content > Custom. לחץ על תוכן אפשרות בסרגל הכלים. לחץ על ערוך תבנית, אשר תפתח את תוכנית Excel.
  3. בתוך הגיליון האלקטרוני, בחר תוספות > טבלה > נתוני תקינות. רחף מעל הבחירות השונות כדי לראות אפשרויות ייצוא. בחר מדד עניין (לדוגמה, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
    הערה: ניתן להוסיף פריסת לוח לתבנית ניתוח הגליונות האלקטרוניים על-ידי בחירה באפשרות תוספות > פריסת סיכום פרוטוקול >.
  4. ייפתח חלון עריכה . בתיבה בארות , ייעד את הבארות לייצוא על ידי Well-ID או באר #. בחר אישור. תבנית תיטען לקובץ הגיליון האלקטרוני. סגור גיליון אלקטרוני. התבנית נשמרת באופן אוטומטי.
  5. לחץ על אישור בחלון ייצוא חדש ל- Excel וסגור את החלון בוני דוחות/ייצוא .
  6. לחץ על סמל הייצוא בסרגל הכלים Gen5. סמן את התיבה לצד קובץ הייצוא הרצוי. לחץ על אישור. Gen5 יאכלס באופן אוטומטי את תבנית הגיליון האלקטרוני ויפתח את הקובץ ב- Excel.

6. ניתוח נתונים חיצוניים

  1. פתח את קובץ הייצוא (.xlsx) ב- Excel.
  2. עבור כל באר, חלק כל ערך בודד בערך נקודת הזמן 0:00 עבור אותה באר. פעולה זו תגדיר נקודת זמן 0 שווה ל- 1, וכל ערך מעבר לכך יהיה יחסי לקריאה הראשונית.
  3. פתח קובץ חדש בתוכנת ניתוח הנתונים. בחר באפשרות פריסת XY .
    הערה: בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- GraphPad Prism (גרסה 9.5.1).
  4. תוויות קלט עבור כל קבוצת נתונים. העתק והדבק את נקודות הזמן ואת הערכים המנורמלים המתאימים עבור כל קבוצת טיפול לטבלת פריזמה. גרף עבור הנתונים יופק באופן אוטומטי וניתן למצוא אותו תחת גרפים.

תוצאות

מטרתנו הייתה להדגים את ההיתכנות של שימוש בהדמיה מרובת תאים חיים כדי להעריך תגובה טיפולית של PDO. ניסויי הוכחת היתכנות בוצעו בשני מודלים נפרדים של PDO לסרטן רירית הרחם: ONC-10817 ו-ONC-10811 (ראו איור משלים 1 ואיור משלים 2 לנתוני ONC-10811). אפופטוזיס (צביעת נספח V) וציטוטוקסיות (ספיגה ירוקה של ציטוטוקס) נוטרו באופן קינטי בתגובה לחומר המשרה אפופטוזיס, סטאורוספורין. באופן ספציפי, PDOs צופו בלוחות של 96 בארות, טופלו בצבעים אדומים של Annexin V ו-Cytotox Green, והונחו באינקובטור של 37°C למשך הלילה, כפי שמתואר באיור 1. אישרנו בשני מודלים עצמאיים של PDO שטיפול בצבעים Annexin V ו-Cytotox Green אינו רעיל (איור משלים 2). למחרת, PDOs טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של staurosporine (0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 500 nM). לאחר מכן, נקבעו פרוטוקולים בתוכנת Gen5 והניסויים נקבעו לרוץ על פני תקופה של 5 ימים, הדמיה כל 6 שעות. הנתונים נותחו באמצעות פונקציית הניתוח התאי בתוכנת Gen5 כמתואר בסעיף 4 של הפרוטוקול. המסכה הראשית הוגדרה באמצעות פונקציית הסף האוטומטי עם "פיצול עצמים נוגעים" ללא סימון ועם פרמטרי גודל של מינימום: 30 מיקרומטר ומקסימום: 1000 מיקרומטר. תת-אוכלוסיית PDO הוגדרה על ידי מעגליות > 0.25. עוצמות האובייקט הממוצע בתעלות TRITC (annexin V, apoptosis) ו-GFP (Cytotox Green, ציטוטוקסיות) בתוך תת-האוכלוסייה הייעודית של PDO יוצאו כקובץ .xlsx לניתוח נוסף. העוצמה הממוצעת של האובייקט עבור כל באר בכל נקודת זמן הן בערוצי GFP והן בערוצי TRITC נורמלה לזמן 0. נתוני פלואורסצנטיות מנורמלים הועברו לאחר מכן לקובץ פריזמה והוצגו כתרשים קו.

הטיפול בסטאורוספורין הביא לעלייה משמעותית ותלויה במינון באפופטוזיס ולירידה בבריאות התא לאורך זמן בהשוואה לשליטה ברכב, כפי שמעידה העלייה בעוצמה הממוצעת של האובייקט הן בערוצי TRITC (annexin V) והן בערוצי GFP (Cytotox) (איור 4, איור 5, וידאו משלים 1, וידאו משלים 2, וידאו משלים 3, סרטון משלים 4, סרטון משלים 5, סרטון משלים 6 וסרטון משלים 7). המינונים של 500 ננומטר, 100 ננומטר ו-10 ננומטר של סטאורוספורין הביאו כל אחד לעלייה מובהקת סטטיסטית הן באפופטוזיס והן בציטוטוקסיות לאורך זמן (איור 5A-C) וגם בסוף הניסוי (איור 5E,F). יתר על כן, סטאורוספורין עיכב ביעילות צמיחה והיווצרות של PDO בריכוזים אלה, כפי שהודגם על ידי ירידה כוללת בשטח ה-PDO הכולל, בעוד שבארות הבקרה הציגו עלייה בשטח ה-PDO הכולל (איור 4 ואיור 5D).

מכיוון שיתרון מרכזי של דימות תאים חיים הוא היכולת לתקן שונות בציפויים, ביצענו ניסוי שבו הוערכה כדאיות התא כמדד לנקודת קצה. נתוני בדיקת הוכחת היתכנות נאספו באמצעות מודל PDO שנוצר מקסנוגרפט שמקורו בחולה של סרטן הערמונית. תמונות שדה בהיר נאספו בתחילת תקופת הטיפול (יום 0), ולאחר מכן נוסף מגיב צבע כפול המודד הן את הכדאיות (כתום אקרידין, AO) והן את המוות התא (פרופידיום יודי, PI). רכיב ה-AO פולט אות פלואורסצנטי ירוק בעת קשירה לדנ"א דו-גדילי, אינדיקטור לכדאיות התא. רכיב ה-PI מכתים תאים בעלי גרעין מת, וניתן להשתמש בו כדי לכמת מוות תאי בתגובה לטיפול. כדי להסביר את השונות בציפוי PDO, פיתחנו שיטה לקבוע את מספר ה-PDO לבאר בזמן 0 על-ידי המרת תמונות שדה בהיר לתמונות ניגודיות פאזה דיגיטלית (איור משלים 3 וקובץ משלים 1).

PDO לסרטן הערמונית טופל בדאונורוביצין, חומר כימותרפי הגורם למוות תאי, במשך 7 ימים. עם השלמת הניסוי, הדגימות הוכתמו ב-AOPI כמתואר בקובץ משלים 1, ולאחר מכן בוצע ניתוח של תמונות פלואורסצנטיות בדור 5. איור 6A מציג פאנל של תמונות מבדיקת נקודת הקצה של AOPI ביום השביעי. כאשר משווים PDO שטופלו ברכב (שורה ראשונה) ל-PDOs שטופלו ב-10 מיקרומטר דאונורוביצין (שורה שתיים), נצפתה ירידה ברורה בפלואורסצנטיות ירוקה (מדד הכדאיות, עמודה שתיים) ועלייה בפלואורסצנטיות אדומה (מדד מוות תאי, עמודה שלוש). התוצאות האלה כומתו לאחר מכן באיור 6B, שם אנו מראים את מערך הקריאות שניתן להשיג באמצעות טכניקת צביעת נקודות הקצה של AOPI. התרשים השמאלי העליון מתאר את מדידת הכדאיות הנוצרת מכתם AO, מנורמל לספירת PDO שנקבעה על ידי ניתוח תמונת ניגודיות פאזה דיגיטלית של כל באר ביום 0. נתונים אלה תואמים את התוצאה החזותית מאיור 6A, לפיה ככל שריכוז דאונורוביצין עלה, הכדאיות ירדה באופן דרסטי. זה משוחזר עוד יותר בגרף הימני העליון, אשר מדגים עלייה במוות התא המסומנת על ידי עלייה פלואורסצנטיות אדומה שנרכשה עם כתם PI.

לאחר מכן, נתוני PI שולבו עם קריאת הכדאיות (AO) כדי לחשב יחס קיימא למות (איור 6B, גרף שמאלי תחתון). יחס זה הוא גישה שימושית כדי לקבוע אם תרופה היא ציטוטסטטית או ציטוטוקסית. באופן ספציפי, תרופה ציטוטוקסית תגיע הרבה יותר קרוב ל-0 מאשר תרופה ציטוטסטטית בשל העובדה שתרופה שהיא ציטוטסטטית תעכב גדילה אך לא תגרום למוות תאי. לבסוף, ניתן לחשב במדויק את השטח של PDOs באמצעות הפלואורסצנטיות הירוקה של כתם AO, גם כאשר PDOs עשויים לעבור מוות תאי ו blebbing. הגרף הימני התחתון מתאר את שטח ה-PDO הממוצע, שחושב כסכום השטח שצוין בניתוח תת-האוכלוסייה חלקי מספר ה-PDO. ניתוח של האזור יכול לתת אינדיקציה נוספת אם הטיפול פשוט מעכב את צמיחת PDO או למעשה גורם לרגרסיה של PDO. שימו לב שהניתוח של שטח ה-PDO הממוצע בוצע באמצעות ערוץ GFP ופונקציית ניתוח תאי, בניגוד לאיור 5D, שהשתמש בתמונות השדה הבהיר כדי לחשב את שטח ה-PDO הכולל. נתונים אלה מדגישים את הגמישות של צינור הניתוח בהתאם לזמינות הנתונים ולעניין המשתמש.

לבסוף, השווינו את תקן הזהב לקריאות כדאיות, CellTiter-Glo 3D, לקריאת פלואורסצנטיות של כדאיות באמצעות AOPI (איור 6C). שים לב שהנתונים בלוח זה לא נורמלו למספר PDO זמן 0 מכיוון שנורמליזציה זו אינה מבוצעת בדרך כלל על ידי מעבדות המשתמשות בערכת CellTiter-Glo 3D. ראינו את אותה מגמה של השפעת התרופה בשני הבדיקות, כאשר הכדאיות של PDO ירדה ככל שריכוז הדאונורוביצין עלה. ההבדל החזותי היחיד בין קריאות אלה היה שניתוח CellTiter-Glo 3D הגיע ל- IC50 לפני ניתוח AOPI והגיע כמעט לחלוטין ל- 0. תוצאה זו עשויה להיות מוסברת על ידי מנגנון הפעולה של daunorubicin. דאונורוביצין הוא מעכב טופואיזומראז-II המציג שברי DNA דו-גדיליים, המובילים למעצר מחזור התא ובסופו של דבר אפופטוזיס14. במהלך מעצר מחזור התא, דלדול ATP יכול להתרחש15. בהתחשב בכך שבדיקת CellTiter-Glo 3D מבוססת על תגובת ATP-luciferase ליצירת אות לומינסנציה, אנו משערים כי הירידה החזקה יותר בכדאיות התא בריכוזים גבוהים יותר של דאונורוביצין נבעה מדלדול ATP ולא ממוות תאי מלא. כדי לתמוך ברעיון זה, התמונות באיור 6A מתארות אוכלוסייה שחיה ב-PDOs בתרבות, כפי שמסומן על-ידי פלואורסצנטיות ירוקה.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול ציפוי, הדמיה וניתוח. PDOs מצופים בצלחת של 96 בארות ומטופלים בצבעים פלואורסצנטיים ותרופות. פרמטרי הדמיה עבור הניסוי (למשל, חשיפה, Z-stack) נוצרים בתוכנת Gen5. התמונות נרכשות על ידי Cytation 5 ומעובדות בדור 5, והנתונים מיוצאים לניתוח נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סקירה כללית של תכונת ניתוח תאים. 1: תקע ייעודי: תקע מיועד לכלול תחומי עניין. 2: הגדר מסיכה ראשית: המסיכה הראשית מגדירה אובייקטים בעלי עניין בהתבסס על גודל ועוצמת פיקסלים בערוץ לבחירה. בתמונה מייצגת זו, עצמים הכלולים במסיכה הראשית מסומנים בסגול. 3: הגדרת תת-אוכלוסייה: ניתן להגדיר תת-אוכלוסייה נוספת כדי לחדד עוד יותר את האוכלוסייה הרצויה לניתוח. תת-האוכלוסייה בתמונה לדוגמה (מסומנת בצהוב) מוגדרת בהתבסס על מעגליות (>0.25) ושטח (>800). התמונות נרכשו עם מטרה 4x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: דוגמאות למיסוך תת-אוכלוסיות באמצעות התכונה 'ניתוח תאי'. תת-אוכלוסיות מוגדרות בערוץ השדה הבהיר. תת-האוכלוסייה בתמונות לדוגמה (מסומנת בצהוב) מוגדרת בהתבסס על מעגליות (>0.25) ושטח (>800). התמונות נרכשו במטרה של 4X. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: טיפול בסטאורוספורין גורם לעלייה תלוית מינון באפופטוזיס ובציטוטוקסיות. תמונות שדה בהיר (4x אובייקטיבי) עם כיסוי פלואורסצנטי GFP ו-TRITC מוצגות עבור מינונים של 500 ננומטר, 10 ננומטר ו-0.1 ננומטר של סטאורוספורין ב-3 נקודות זמן: 0 שעות, 54 שעות, 114 שעות. האות הפלואורסצנטי האדום מציין אפופטוזיס (נספח V), והאות הפלואורסצנטי הירוק מציין ציטוטוקסיות (Cytotox). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים מרובים להערכת תגובת PDO. דגם PDO ONC-10817 היה מצופה בלוחות 96 בארות והודגר עם צבעי Annexin V Red (1:400) וירוק Cytotox (200 ננומטר) למשך הלילה ב-37°C. למחרת, PDOs טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של staurosporine וצולמו כל 6 שעות במשך ~ 5 ימים. (א,ב) עלייה תלוית זמן ומינון ב (A) ציטוטוקסיות או (B) אפופטוזיס בתגובה staurosporine. הנתונים סומנו כעוצמה הממוצעת של האובייקט בערוץ GFP או TRITC. (C) השוואה של מהלך הזמן של אפופטוזיס וציטוטוקסיות בתגובה לסטאורוספורין של 100 ננומטר או 500 ננומטר. הנתונים סומנו כערכי העוצמה הממוצעת של האובייקט בערוצי GFP ו-TRITC. (D) Staurosporine מעכב צמיחה של PDOs. הנתונים שורטטו כשטח PDO הכולל הממוצע. הנתונים ב- A-D נורמלו למספר PDO בזמן 0 שעות בכל באר ושורטטו כממוצע ושגיאת התקן של הממוצע (SEM). N=5 שכפולים טכניים לכל טיפול. p < 0.0001 לעומת בקרת רכב על ידי ANOVA דו-כיוונית. (E) תמונות מייצגות של שדה בהיר, GFP ו-TRITC של PDOs שטופלו בסטאורוספורין ב-500 ננומטר לעומת רכב בסוף הניסוי (114 שעות). התמונות נרכשו עם מטרה 4x. (F) כימות ציטוטוקסיות, אפופטוזיס וכדאיות בנקודת הזמן של 114 שעות. GFP Object Mean Intensity (משמאל) ו-TRITC Object Mean Intensity (באמצע) חושבו בנקודת הזמן של 114 שעות באמצעות תוצאות מלוחות A-C. הכדאיות (מימין) הוערכה באמצעות מגיב CellTiter-Glo 3D בהתאם לפרוטוקול היצרן. ערכי הארה גולמית (RLU) נורמלו לשטח PDO כולל בזמן 0 שעות ושורטטו ככדאיות הקיפול ביחס לבקרת הרכב, שנקבעה על 1.0. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 לעומת בקרת רכב באמצעות ANOVA בכיוון אחד עם מבחן פוסט-הוק של דנט. N = 5 שכפולים טכניים לכל טיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: שימוש בדימות תאים חיים כדי לסייע בנורמליזציה של נתוני בדיקות של נקודות קצה. PDOs טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של מעכב topoisomerase-II, דאונורוביצין, במשך 7 ימים. PDOs נחשפו לתמיסת צביעה AOPI וצולמו כמתואר בקובץ משלים 1. AO = כתום אקרידין, מדד לכדאיות (ערוץ GFP); PI = propidium iodide, מדד למוות תאי (ערוץ טקסס אדום). (A) תמונות מייצגות שנרכשו באמצעות צביעת AOPI לאחר 7 ימי טיפול עם דאונורוביצין 10 מיקרומטר או בקרת רכב (0.1% DMSO). (B) קריאות שונות המשתמשות בפלואורסצנטיות AOPI כשיטת כדאיות של נקודת קצה/מוות תאי. ראו קובץ משלים 1 לתיאור מפורט של שיטות הניתוח. משמאל למעלה, ניתוח כדאיות PDO לאחר 7 ימים כפי שנקבע על ידי צביעת AO. מימין למעלה, ניתוח מוות תאי על ידי צביעת PI. הנתונים עבור צביעת AO ו- PI נורמלו למספר PDO בזמן 0 שעות ולאחר מכן לבקרת הרכב, שהוגדרה על 1.0, ושורטטו כממוצע וסטיית תקן. משמאל למטה, חישוב יחס קיימא למת באמצעות אינטגרלי האובייקט הממוצע עבור כתמי AO ו- PI. מימין למטה, אזור PDOs כפי שנקבע על ידי צביעת AO. אנליזה תאית בוצעה בערוץ GFP. (ג) השוואה בין שתי שיטות לבדיקת כדאיות PDO. לאחר ההדמיה, הכדאיות הוערכה באמצעות מגיב CellTiter-Glo 3D בהתאם לפרוטוקול היצרן. הישרדות הקיפול ביחס לבקרת הרכב תוכננה בריכוזים הולכים וגדלים של דאונורוביצין. הנתונים מייצגים את הממוצע וסטיית התקן עבור N = 6 שכפולים טכניים לכל טיפול; הנתונים לא נורמלו לזמן 0 שעות בלוח C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טיפול# של וולסנפח מדיהנספח100 מיקרומטר ציטוטוקס
דילולנפחדילולנפח
מולטיפלקס606.6 מ"ל1:40016.5 מיקרוליטר200 נאנומטר13.2 מיקרוליטר

טבלה 1: ניסוי ריבוב לדוגמה. Annexin V Red קושר פוספטידיל סרין חשוף על העלון החיצוני של קרום התא אפופטוטי. Cytotox Green משתלב בתאים עם שלמות קרום פגומה וקושר DNA.

איור משלים 1: הדמיה מרובת תאים חיים של ONC-10811. PDOs צופו בלוחות של 96 בארות והודגרו בצבעי Annexin V Red (1:400), ו-Cytotox Green (200 nM) למשך הלילה ב-37°C. למחרת, PDOs טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של staurosporine וצולמו כל 6 שעות במשך 5 ימים. (A) עלייה תלוית זמן ומינון בציטוטוקסיות בתגובה לסטאורוספורין. הנתונים סומנו כעוצמה הממוצעת של האובייקט בערוץ GFP. (B) מנה-תגובה של staurosporine ב 114 שעות. הנתונים סומנו כערכי העוצמה הממוצעת של האובייקט בערוץ GFP בנקודת הזמן של 114 שעות. (C) עלייה תלוית זמן ומינון באפופטוזיס בתגובה לסטאורוספורין. הנתונים סומנו כעוצמה הממוצעת של האובייקט בערוץ TRITC. (D) מנה-תגובה של staurosporine ב 114 שעות. הנתונים סומנו כערכי העוצמה הממוצעת של האובייקט בערוץ TRITC בנקודת הזמן של 114 שעות. הנתונים ב- A ו- C נורמלו למספר PDO בזמן 0 שעות ברמת הבאר. N = 5 שכפולים טכניים לכל טיפול בכל דגם. p < 0.0001 לעומת בקרת רכב על ידי ANOVA דו-כיוונית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 2: טיפול ב-Annexin V וב-Cytotox אינו מפריע לכדאיות ה-PDO. PDOs צופו בלוחות של 96 בארות והודגרו בצבעי Annexin V Red (1:400) ו-Cytotox Green (200 ננומטר) למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C. לאחר הדגירה של 24 שעות, הוערכה הכדאיות באמצעות בדיקת CellTiter-Glo 3D בהתאם לפרוטוקול היצרן. (A) כדאיות ב-PDO שטופלו בצבע ולא טופלו בנקודת הזמן של 24 שעות. מוצגים ערכי יחידת האור היחסית (RLU) והערכים המנורמלים לאזור סכום PDO. באופן ספציפי, CellTiter-Glo3D RLU עבור כל באר היה מנורמל לסיכום של אזור PDO עבור באר זו בזמן ציפוי (כלומר, מיד לאחר הוספת צבע). שטח ה-PDO הכולל נקבע באמצעות חישוב "שטח סכום אובייקט" באנליזה תאית. N = 10. (B) כדאיות ב-PDO שטופלו בצבע ולא טופלו בנקודת הזמן של 114 שעות. מוצגים ערכי זוהר גולמיים וערכים המנורמלים לאזור PDO הכולל. CellTiter-Glo3D RLU עבור כל באר נורמל לסיכום אזור PDO ב 24 שעות לאחר ציפוי, אשר מתאים לזמן 0 שעות בניסויי הדמיה קינטית. N = 5. המובהקות ב-A וב-B הוערכה באמצעות מבחן t לא מזווג; ערכי p מפורטים בגרפים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: ניתוח ללא תוויות של PDO באמצעות ניגודיות פאזה דיגיטלית. איור זה מכיל תמונות מייצגות (אובייקטיביות פי 2.5) המתארות ניתוח ללא תוויות כמתואר בקובץ המשלים 1: הגדרת פרמטרי הדמיה עבור ניתוח מישור מוקד יחיד של שדה ראייה (Bright Field/Digital Phase Contrast Images) וניתוח תמונת ניגודיות פאזה דיגיטלית בתוכנת Gen5. (A) תמונת שדה בהירה לדוגמה של מודל PDXO של סרטן הערמונית במישור מוקד יחיד. (B) תמונת השדה הבהיר ב-A הומרה לתמונת ניגודיות פאזה דיגיטלית. עצמים כהים בתמונת השדה הבהיר נראים בהירים בתמונת ניגודיות הפאזה הדיגיטלית ולהפך. (C) דוגמה למסיכת PDO באמצעות תמונת הניגודיות Digital Phase. שים לב כי הקצוות של אובייקטים מעניינים להיות הרבה יותר מוגדר לעומת תמונות שדה בהיר. בתמונה מייצגת זו, עצמים במסיכה הראשית מסומנים בצהוב. תת-האוכלוסייה ב- (C) (מסומנת בוורוד) מוגדרת בהתבסס על מעגליות (>0.3), שטח (>1000), Mean[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500, ו- Peak[Dig.Ph.Con] > 12500. הפרמטרים ששימשו באיור מייצג זה הוחלו על נתונים באיור 6 כדי לנרמל את ספירת התאים ביום 0. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: מודלים של PDO עשויים להיות שונים במורפולוגיה שלהם ובעקביות הציפוי שלהם. פאנל עליון: דוגמאות לפיזור דיפרנציאלי של PDOs בכיפות BME. לוח תחתון: תמונות מייצגות של PDO דיסקוסיבי לעומת עגול. כל התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ EVOS. הגדלות נרשמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: תמונות לדוגמה המשתמשות באנליזה תאית לעומת סטטיסטיקת תמונות לכימות פלואורסצנטיות. באמצעות ניתוח תאי, משתמשים יכולים להגדיר אוכלוסיות ספציפיות בתוך תמונה ולמדוד פלואורסצנטיות באזורים אלה. ניתן להשתמש בסטטיסטיקת תמונה גם כדי למדוד פלואורסצנטיות בתמונה על-ידי הגדרת סף לאי-הכללת אותות רקע. עיין בדיון על מגבלות השימוש בסטטיסטיקת תמונות. התמונות הן בהגדלה של פי 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: רכיבי מדיה של תרבית אורגנואידים. שים לב כי ריאגנטים עברו אופטימיזציה לטיפוח PDO סרטן גינקולוגי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים 1: וידאו קיטועי זמן של טיפול staurosporine 500 ננומטר עם תמונות שנרכשו כל 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים 2: וידאו קיטועי זמן של טיפול staurosporine 100 ננומטר עם תמונות שנרכשו כל 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים 3: וידאו קיטועי זמן של טיפול staurosporine 10 ננומטר עם תמונות שנרכשו כל 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים 4: וידאו קיטועי זמן של טיפול 1 ננומטר staurosporine עם תמונות שנרכשו כל 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים 5: וידאו קיטועי זמן של טיפול staurosporine 0.1 ננומטר עם תמונות שנרכשו כל 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים 6: וידאו קיטועי זמן של טיפול staurosporine 0.01 ננומטר עם תמונות שנרכשו כל 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרטון משלים 7: סרטון קיטועי זמן של הרכב (0.06% DMSO) עם תמונות שנרכשו כל 6 שעות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: פרוטוקולים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

תרביות PDO הופכות לפופולריות יותר ויותר במערכת מודל במבחנה בשל יכולתן לשקף תגובות והתנהגויות תאיות2. התקדמות משמעותית נעשתה ביצירת PDO, בתרבות ובטכניקות הרחבה, אך שיטות לניתוח תגובות טיפוליות התמהמהו. ערכות כדאיות תלת-ממדיות הזמינות באופן מסחרי הן מבחני נקודות קצה ליטיים, מחמיצים נתוני תגובה קינטית בעלי ערך פוטנציאלי ומגבילים את הניתוחים הבאים בשיטות אחרות8. מחקרים חדשים מיישמים דימות תאים חיים כדי להעריך תגובות לתרופות במודלים של PDO. כאן, אנו מציגים שיטה להערכת תגובות טיפוליות של PDO לאורך זמן באמצעות הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים מרובים. ריבוב צבעים פלואורסצנטיים מאפשר לכמת תגובות תאיות שונות בו זמנית. בנוסף לאפופטוזיס וציטוטוקסיות, אנו צופים כי ניתן להרחיב גישה זו במחקרים עתידיים כדי לבחון השפעות פנוטיפיות אחרות ב- PDOs.

הפרוטוקול המוצג כאן נועד לקבל תמונות קינטיות של שדה בהיר ופלואורסצנטי של PDOs המצופים ככיפות בלוח של 96 בארות. השלבים העיקריים כוללים 1) ציפוי, 2) טיפול בצבע ובתרופה, 3) הגדרת פרמטרים של הדמיה, 4) עיבוד מקדים וניתוח תמונה בהשלמת רכישת תמונה קינטית, ו-5) ייצוא נתונים לניתוח בתוכנות סטטיסטיות אחרות (איור 1). PDO שלמים מצופים בלוח של 96 בארות ככיפות BME של 5 μL המורכבות מיחס מוגדר מראש של BME ומדיה תרבותית אורגנואידית (בדרך כלל 1:1). הפרוטוקול המוצג כאן משתמש ב- UltiMatrix כ- BME בשל שונות מינימלית בין אצווה לאצווה ותכונות אופטיות מעולות להדמיה. ייתכן שיהיה צורך בשינויים עבור קצירת PDOs שגודלו בתרבית ב-BME אחרים, כגון Matrigel, כמו גם עבור מודלים שהם גושים וקשים לניתוק (ראו דוגמאות איור משלים 4). לאחר מכן, צבעים פלואורסצנטיים מתווספים למדיה של תרבית אורגנואידים בזמן הציפוי (יום -1) בריכוז של פי 2 בנפח של 100 μL ומודגרים למשך הלילה כדי לקבוע מוות תאי בסיסי. למחרת (יום 0), תרופות או טיפולים אחרים מתווספים לתרבית אורגנואיד בריכוז של פי 2 בנפח של 100 מיקרוליטר, ולאחר מכן מתווספים לכל באר לקבלת נפח סופי של 200 מיקרוליטר. הנפח הסופי של 200 μL מפחית את אפקט המניסקוס עם הדמיה. תמונות קינטיות נרכשות באמצעות קורא לוחות Cytation 5 בשיתוף עם חממת השולחן BioSpa. חממת BioSpa מאפשרת דגירה של לוחות ניסוי בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס וסביבת 5% CO2 . ניתן לאחסן עד 8 צלחות בביוספא ובכך ניתן לבצע 8 ניסויים בו זמנית. פרמטרי הדמיה עבור כל לוחית מוגדרים בתוכנת Gen5 באמצעות "מצב Imager Manual" ונשמרים כפרוטוקול. לאחר מכן נטען הפרוטוקול לתוכנת התזמון (BioSpa OnDemand). תוכנת BioSpa OnDemand הופכת את זרימת העבודה לאוטומטית עבור רכישת תמונה קינטית, כולל העברה פיזית של הצלחת מחממת BioSpa לתוך Cytation 5 ומכתיבה איזה פרוטוקול להריץ בדור 5 לאיסוף נתונים. התמונות מנותחות באמצעות פונקציית הניתוח התאי בתוכנת Gen5 (איור 2). אנו מתארים שיטות ספציפיות לניתוח תחזיות Z של תמונות שדה פלואורסצנטי ובהיר. שיטות ספציפיות לניתוח מישורי Z בודדים ו/או תמונות שדה בהיר בלבד מסופקות בקובץ משלים 1. לבסוף, משתמשים יכולים להגדיר תכונות נתונים ספציפיות, כגון אזור PDO, מספר ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת, לייצוא כגיליון אלקטרוני של Excel לניתוח סטטיסטי עוקב של השפעות סמים.

בהתחשב בכך שמודלים של PDO הם מערכת מודל חדשה יחסית לחקירת השפעות סמים, שיטות להתאים לתנאי התרבית, ובמיוחד הגידול ב- BME, עדיין מתפתחות16. רוב המחקרים המעריכים תגובת PDO לטיפול תרופתי מסתמכים על מבחני נקודות קצה מבוססות ATP כתחליף לבריאות התא (CellTiter-Glo 3D). שיטה זו דורשת ליזה של תאים, ובכך מונעת ניתוחים עוקבים במורד הזרם. בדיקות חלופיות של נקודות קצה, כגון צביעה פלואורסצנטית, הדמיה של נקודת זמן בודדת ומעקב מורפולוגי, סיפקו מדדים אחרים לאפיון התגובה לתרופות תוך מתן אפשרות לשימוש בדגימות למטרות נוספות. לדוגמה, פרוטוקולי קיבוע נקודות קצה בתוך לוחות יושמו עבור ניתוח תפוקה גבוהה של השפעות סמים17,18. יתרון של שיטה זו הוא שהיא עוקפת את העיבוד הנרחב הנדרש באימונוהיסטוכימיה טיפוסית ובהדמיה אימונופלואורסצנטית19 והיא שימושית במיוחד כאשר הדגימה מוגבלת, כמו במקרה של מודלים של PDO. זה גם מקובל הדמיה ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ קונפוקלי. בדיקת נקודת קצה נוספת שאינה דורשת ליזה של תאים היא הדמיה של תאים חיים עם ריאגנטים כגון פרופידיום יודיד או תפוז אקרידין. הניתוח ההשוואתי שלנו של CellTiter-Glo 3D ו-AOPI, שהאחרון שבהם אינו דורש ליזה של תאים, להערכת כדאיות התא ומוות (איור 6C), מדגיש את היתרונות של שימוש בצבעי הדמיה של תאים חיים במודלים של PDO. שיטה זו יושמה על ידי מספר קבוצות, כולל שלנו, כדי להעריך השפעות פנוטיפיות בסיום ניסוי 18,19,20. עם זאת, רכישת נתונים קינטיים באמצעות קיבוע באר או שיטות דימות תאים חיים בנקודת קצה דורשת דגימה משמעותית. הערכה מורפולוגית נטולת תוויות של PDOs לאורך זמן מתגברת בחלקה על מגבלה זו וניתן להעריך אותה באמצעות מגוון רחב של שיטות הדמיה 8,10,17,18, אך שינויים במורפולוגיה עשויים שלא לייצג את ספקטרום ההשפעות האפשריות של תרופות כגון אפופטוזיס ושינויים בכדאיות התא. הבחנו בשונות משמעותית ממודל למודל בשינויים מורפולוגיים בתגובה לתרופות. לדוגמה, חלק מה-PDOs יגדלו בשטח בזמן שהם עוברים אפופטוזיס, בעוד שמודלים אחרים עשויים להתכווץ. הערכות מורפולוגיות קינטיות הוכפלו עם מבחני נקודות קצה פלואורסצנטיות קבועות או חיות במספר מוגבל של מחקרים18,20. השיטות המוצגות כאן הן בין הראשונות לריבוב צבעים פלואורסצנטיים שונים כדי להעריך בו זמנית השפעות תאיות מרובות במערכת בעלת תפוקה גבוהה.

אחד השיפורים הגדולים ביותר שמספקת הדמיה קינטית של תאים חיים הוא שהיא מתגברת על מגבלות מרכזיות הקשורות לבדיקות נקודות קצה. לדוגמה, ציפוי מספר שווה של PDOs לכל באר הוא קשה מבחינה טכנית מכיוון שרוב מוני התאים האוטומטיים מגודרים עבור עצמים קטנים מ- 60 מיקרומטר. הדמיה של תאים חיים מאפשרת נורמליזציה למספר PDO או לאזור בזמן 0 שעות בכל באר, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי להתאים את השונות בציפוי בין בארות. בדיקת נקודת הקצה של תקן הזהב עבור PDO היא ערכת CellTiter-Glo 3D, המודדת ATP כתחליף לכדאיות התא. השתמשנו בהרחבה בבדיקה זו במחקרים שלנו על PDOsשל סרטן גינקולוגי וסרטן הערמונית 13,21,22,23,24. בנוסף לדרישה לליזה של תאים עבור מדדי ATP, תרופות ושיטות טיפוליות אחרות יכולות לשנות את רמות ה- ATP, מה שעלול לספק הערכה לא מדויקת של התגובה הטיפולית. שימוש בצבעי הדמיה של תאים חיים מאפשר לכמת טווח רחב יותר של תגובות תאיות ספציפיות, כגון אפופטוזיס וציטוטוקסיות. חשוב לציין, ריאגנטים אלה אינם מפריעים לקיום התא או גורמים נזק לדנ"א, כמו במקרה של פרופידיום יודיד; זה מאפשר הערכה חוזרת ונשנית של תגובת PDO לאורך זמן. אמנם לא חקרנו את השימוש בתפוז אקרידין (AO) לאמצעים קינטיים, אך מנגנון הפעולה של AO לא אמור למנוע יישום כזה בעתיד.

גידולים מורכבים ממספר אוכלוסיות תאים נפרדות עם פרופילים גנומיים ומורפולוגיה שונים. בשל ההטרוגניות המורכבת של מודלי PDO, תגובות PDO בודדות עשויות להשתנות, ומעקב אחר תגובות אלה מאתגר. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה להערכת מדדי תגובה מרובים של PDO על בסיס טוב. עם זאת, שיקולים טכניים מסוימים עדיין חלים על דימות תאים חיים. מספר הבארות של צלחת בת 24 בארות הדרושות לזרע צלחת של 96 בארות יהיה תלוי בצפיפות ובקצב הצמיחה של כל מודל PDO. מאחר שקיבוץ יכול לבלבל ניתוח תמונה (איור משלים 4), ייתכן שמודלים של PDO יזדקקו לשלבי עיבוד נוספים לפני הציפוי. במידת הצורך, ניתן לגזור באופן מכני PDOs במהלך העיבוד באמצעות פיפטינג נמרץ עם קצה p200 משעמם לא רחב. ניתן להשתמש גם בעיכול אנזימטי באמצעות TrypLE Express לפני הציפוי כדי לקדם דיסוציאציה של PDO והפחתת גושים. מניסיוננו, ציינו כי אורך הדגירה של TrypLE משתנה מאוד בהתאם לדגם. לכן, הדגירה של TrypLE צריכה להיות מותאמת לכל דגם, במיוחד אם החוקרים רוצים להשיג תרחיפים של תא בודד. זמן ההחלמה לפני תחילת הטיפול עשוי להיות נחוץ עבור מודלים PDO רגישים במיוחד לעיכול אנזימטי.

אנו מציגים שיטות עבור ריאגנטים ספציפיים לדימות תאים חיים. מגבלה בתחולתן הרחבה של השיטות המוצגות כאן היא מיעוט ריאגנטים התואמים BME. עבור צבעים/ריאגנטים אחרים שעדיין לא עברו אופטימיזציה לשימוש במחשבי PDO, ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות נוסף כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי ולמזער את השפעות הממס. בהתאם לקריאה המעניינת (למשל, אפופטוזיס או ציטוטוקסיות), יש להשתמש בתרכובת הידועה כגורמת למוות תאי, כגון staurosporine או daunorubicin13 כדי למטב את תנאי המגיב. שיקול נוסף הוא הזמן האופטימלי לשילוב צבע בכיפת BME. בניסויים שלנו, אנו מבצעים דגירה של לילה לפני הטיפול כדי לאפשר ספיגה מלאה של הצבע לתוך הכיפות, כמו גם לקבוע את בריאות התא הבסיסי. מכיוון שעוצמת האות תגדל עם הזמן, החוקרים צריכים לבצע מחקרי פיילוט עם הצבעים כדי לקבוע את זמן החשיפה האידיאלי בסוף הניסוי כדי למנוע תמונות בחשיפת יתר. לבסוף, ריאגנטים לא צריכים להפריע לתהליכים סלולריים. לדוגמה, צבעים שמתערבבים בדנ"א אינם תואמים לדימות קינטית. עם זאת, ניתן להשתמש בדימות תאים חיים לנורמליזציה של נתונים במבחני נקודות קצה. ואכן, אנו מציגים שיטה משלימה לכימות כדאיות התא ובת קיימא: יחס תאים מתים באמצעות AOPI. בניסוי הזה, האות הפלואורסצנטי מנורמל למספר PDO עבור כל באר, כפי שנקבע על-ידי הדמיה של תאים חיים ביום 0 (יום הטיפול, איור 6).

מגבלה נוספת של נייר שיטות זה היא ההסתמכות על צנרת ידנית לניסויים, מה שיכול להוביל לשונות גדולה יותר בשכפולים טכניים. שיפורים נוספים ביכולת שחזור הנתונים יכולים להיות מושגים על ידי הוספת אוטומציה לשלבים אחרים של תהליך הניסוי, כגון שימוש במטפל אוטומטי בנוזלים לציפוי וניפוק תרופות, כפי שהודגם על ידי אחרים 8,10. עם זאת, תוספת זו מחייבת השקעה נוספת בתשתית מחקרית שייתכן שלא תהיה זמינה לכל החוקרים. בהתחשב בהטרוגניות באזור PDO עבור כל דגם, נרמול התוצאות למספר ה- PDO הראשוני או לאזור בזמן 0 שעות הוא עדיין גישה שימושית עם זריעה אוטומטית.

יתרון מרכזי של Cytation 5 על פני פלטפורמות הדמיה אחרות של תאים חיים הוא היכולת להתאים אישית תכונות תמונה וניתוח. עם זאת, לתוכנת Cytation 5/Gen5 יש עקומת למידה תלולה והיא מניחה שלמשתמשים יש ידע בסיסי בהדמיה. אחת המטרות של מאמר שיטות זה היא לספק הוראות שלב אחר שלב כדי להפחית את המחסום עבור חוקרים אחרים לשלב טכניקות מתוחכמות של דימות תאים חיים בתוכניות המחקר PDO שלהם. בעוד שלבי הניתוח הספציפיים המוצגים כאן הם עבור מערכת אחת, משתמשים יכולים ליישם את עקרונות הריבוב על פלטפורמות אחרות, מתוך הבנה כי ניתוח במורד הזרם עשוי לדרוש שימוש בתוכנות צד שלישי, כגון NIH ImageJ.

יש לבחור מדדי ניתוח בהתבסס הן על מטרות הניסוי והן על תנאי הציפוי. לדוגמה, אם הניסוי מתבצע באמצעות צבע פלואורסצנטי כדי לכמת מוות תאי, עוצמת הפלואורסצנטיות היא קריאה יעילה. מדד הפלואורסצנטיות היעיל ביותר (סה"כ פלואורסצנטיות לעומת עוצמה ממוצעת של אובייקט) יהיה תלוי בתנאי הציפוי (איור משלים 4). אם PDOs מפוזרים באופן שווה ויש להם מורפולוגיה מעגלית ומלוכדת יותר, ניתן לקבוע פלואורסצנטיות בתת-אוכלוסיית PDO מוגדרת. הפונקציה הספציפית בתוכנת Gen5 היא אנליזה תאית, והפלט הוא Object Mean Intensity. עם זאת, אם מודל PDO הוא גושי או בעל מורפולוגיה דיסקופסיבית, אנו ממליצים לכמת את האות הפלואורסצנטי ברמת התמונה; ניתן למצוא פונקציה זו תחת סטטיסטיקת תמונה, והפלט הוא עוצמת פלואורסצנטיות כוללת. בעוד ששיטה זו שימושית לצפייה בשינויים ברמת הבאר הבודדת, מדד זה אינו ספציפי עבור אובייקטים מעניינים ועלול להשתנות בטעות אם ה- PDOs יזוזו מחוץ לתקע המיועד במהלך הניסוי. בתרחישים שבהם יש פסולת משמעותית או תאים בודדים מתים, השימוש באנליזה התאית מוצע כדי לשלול כל אות פלואורסצנטי שאינו קשור באופן ספציפי ל- PDO. דוגמה לתוצאות דיפרנציאליות באמצעות אנליזה תאית לעומת סטטיסטיקה של תמונות מוצגת בתרשים משלים 5.

כדי לקבוע את הסף המיטבי עבור הפונקציה Image Statistics, ניתן להשתמש בכלי קו. בעזרת הכלי קו, משתמשים יכולים לקבוע את טווח עוצמת הפלואורסצנטיות בתמונה. אנו קובעים את הסף התחתון כערך של 25% מעוצמת השיא בתמונה. כדי להציג את האזורים הפלואורסצנטיים הכלולים בסף המיועד, סמן את התיבה "חריגי סף". ייתכן שיהיה צורך בכוונון עדין נוסף של ערך הסף התחתון.

אתגר משמעותי בדימות תאים חיים הוא אחסון כמות הנתונים העצומה שנוצרת בכל ניסוי. זה רלוונטי במיוחד במקרה של תרבויות PDO, שבהן Z-Stacks משמשים לתמונה על פני מספר מישורי מוקד וליצירת הקרנת Z. קיימות מספר שיטות להתגבר על בעיה זו. ראשית, ודא קיבולת אחסון נאותה. התקנו שלושה כוננים קשיחים במצב מוצק עם סך של 17 TB. אפשרויות אחרות כוללות העברת קבצים ניסיוניים לכוננים קשיחים חיצוניים או לאחסון ברשת. לא מומלץ לכתוב קבצים ישירות לאחסון מבוסס ענן. כדי לנתח נתונים שאוחסנו בכונן חיצוני, פשוט העבר את הניסוי ואת קבצי התמונה למחשב המצויד בתוכנת Gen5 (הערה: העברת קבצים גדולים עשויה להימשך פרקי זמן ממושכים). לפני הניתוח, יש לקשר מחדש את התמונות לניסוי. פתח את קובץ הניסוי, לחץ על פרוטוקול בסרגל הכלים ובחר אפשרויות פרוטוקול. לחץ על Image Save Options ולחץ על Select new image folder. אתר את קובץ התמונה ולחץ על בחר תיקייה כדי לקשר מחדש.

בהתאם למטרות הניסוי, הוא עשוי להתאים גם לשימוש בתכונת הבינינג בתוך דור 5. Binning מקטין את גודל הקובץ על-ידי הקטנת מספר הפיקסלים, מה שמוביל לרזולוציית תמונה נמוכה יותר (ראה שלב 3.5.3.2). לכן, איגוד אינו מומלץ אם נדרשות תמונות ברזולוציה גבוהה. בעת שימוש בתכונת Binning, יהיה צורך להתאים את הגדרות החשיפה. לאחר יצירת קובץ הניסוי, לחץ פעמיים על החלק תמונה ולחץ על סמל המיקרוסקופ כדי לפתוח מחדש את מצב Imager Manual. השתמש בפונקציית החשיפה האוטומטית או כוונן ידנית את החשיפה לפי הצורך.

לסיכום, אנו מציגים שיטות להערכת אפופטוזיס ובריאות התא של PDOs בתגובה לחומרים ציטוטוקסיים. מחקרים עתידיים נחוצים כדי לייעל שיטות ולפתח אסטרטגיות ניתוח נוספות עבור הדמיה קינטית של PDOs, כגון פנוטיפים אחרים והשפעות של תרופות שהן ציטוטסטטיות ולא ציטוטוקסיות. מחסום עיקרי הוא הזמינות המסחרית של צבעים וריאגנטים התואמים ל- BME. יש עדיין עבודה נוספת הדרושה כדי להבין טוב יותר כיצד הדמיה קינטית של תאים חיים יכולה להיות מנוצלת במלואה כדי לחלץ את מירב הנתונים ממודלים אלה.

גילויים

KWT היא בעלים משותפת של Immortagen Inc. CJD היא עובדת של Agilent. JSdB כיהנה בוועדות מייעצות וקיבלה עמלות מאמג'ן, אסטרה זנקה, אסטלס, באייר, Bioxcel Therapeutics, בורינגר אינגלהיים, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo ו-Vertex Pharmaceuticals; הוא עובד של המכון לחקר הסרטן (ICR), אשר קיבלו מימון או תמיכה אחרת לעבודת המחקר שלו מ AZ, אסטלס, באייר, Cellcentric, Daiichi, Genentech, Genmab, GSK, Janssen, Merck Serono, MSD, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Pfizer, ו Vertex, ואשר יש לו עניין מסחרי abiraterone, עיכוב PARP בתיקון DNA סרטן פגום, ומעכבי מסלול PI3K/AKT (ללא הכנסה אישית); הוכרז כממציא, ללא אינטרס כספי לפטנט 8 822 438, שהוגש על ידי Janssen המכסה את השימוש באבירטרון אצטט עם סטרואידים; היה CI/PI של ניסויים קליניים רבים בחסות התעשייה; והוא חוקר בכיר במכון הלאומי לחקר הבריאות (NIHR). לאף מחבר אחר אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה ל-Tissue Procurement Core ולד"ר קריסטן קולמן מאוניברסיטת איווה על אספקת דגימות גידול למטופלים ולד"ר סופיה גברילוביץ 'במחלקה למיילדות וגינקולוגיה על הסיוע ביצירת מודל PDO. אנו מודים גם לד"ר ואלרי סלווטיקו (Agilent, ארה"ב) על ניתוח ביקורתי של כתב היד. אנו מכירים במקורות המימון הבאים: NIH/NCI CA263783 ו- DOD CDMRP CA220729P1 ל- KWT; חקר הסרטן בבריטניה, סרטן הערמונית בריטניה, הקרן לסרטן הערמונית והמועצה למחקר רפואי ל- JSdB. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון או ניתוח של ניסויים או בהחלטה לפרסם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרוצנטרפוגה 1.5 מ"לDot Scientific Inc1008113
צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"לSarstedt62.554.100
554 NM LED קובייתAgilent1225012
צלחת 96 בארותקורנינג קוסטאר3596מחומם מראש ל 37 מעלות; צלחת C
96 בארותAgilent204626-100מחוממת מראש ל -37 מעלות; C
A83-01Tocris2939הריכוז הסופי הוא 500 ננומטר (רכיב של מדיית תרבית אורגנואידים)
DMEM/F-12Gibco12634-010מתקדם רכיב של מדיית תרבית אורגנואידים
תוסף B27Gibco17504044הריכוז הסופי הוא פי 1 (מרכיב של מדיית תרבית אורגנואידים)
BioTek BioSpa 8 חממה אוטומטיתAgilentBIOSPAG-SNחממת שולחן; תוכנת תזמון BioSpa OnDemand משתפת פעולה עם Gen5 כדי להעביר לוחות בין ה-BioSpa ל-Cytation 5 להדמיה (פרוטוקול זה משתמש בגרסה 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderAgilent CYT5PW-SNPlate Reader; תוכנת Gen5 משמשת למכשיר זה (פרוטוקול זה משתמש בגרסה 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane ExtractR& D SystemsBME001-10
Daunorubicin HClSigma-AldrichS3035משוחזר ב-DMSO
דימתיל סולפוקסידSigma-AldrichD2438
EDTA (0.5 מ')Thermo FisherAM9260G
ForskolinTocris1099הריכוז הסופי הוא 10 ומיקרו; M (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
GlutamaxGibco35050-061הריכוז הסופי הוא 1x (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
HEPESGibco15630-080הריכוז הסופי הוא 10 מ"מ (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
EGF אנושי, חלבון רקומביננטי ללא בעלי חייםGibcoAF-100-15-1MGהריכוז הסופי הוא 0.5 ננוגרם/מ"ל (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
חלבון רקומביננטי FGF-10 אנושיGibco100-26-1MGהריכוז הסופי הוא 10 ננוגרם/מ"ל (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
R-Spondin 1 חלבון רקומביננטיאנושי Gibco120-38-5UGהריכוז הסופי הוא 250 ננוגרם/מ"ל (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
Hydrocortisone Stock SolutionStemCell Technologies7926הריכוז הסופי הוא 500 ננוגרם/מ"ל (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
קוביית מסנן הדמיה- GFPAgilent1225101
קוביית מסנן הדמיה- TRITCAgilent1225125
הדמיה LED GFP/CFPAgilent1225001
Incucyte Annexin V Red DyeSartorius4641משוחזר במדיה של תרבית אורגנואידית
Incucyte Cytotox Green DyeSartorius4633תמיסת DMSO
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250הריכוז הסופי הוא 1.25 מ"מ (מרכיב במצע תרבית אורגנואידים)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining SolutionFisher-Scientific13366169הוסף נפח 1:50
ניקוטינאמידסיגמא-אולדריץ'N0636הריכוז הסופי הוא 10 מ"מ (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
NogginR& D Systems6057-NGהריכוז הסופי הוא 100 ננוגרם/מ"ל (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140122הריכוז הסופי הוא 10 יחידות/מ"ל (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
פוספט חוצץ מלח (1x)Gibco14190-144
PrimocinInvivoGenant-pm-05הריכוז הסופי הוא 100 ומיקרו; גרם/מ"ל (מרכיב של מצע תרבית אורגנואיד)
הרגולין אנושי רקומביננטי ובטא;-1Pepro Tech100-03הריכוז הסופי הוא 37.5 ננוגרם/מ"ל (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידית)
תמיסת סטאורוספורין מ-Streptomyces sp.Sigma-AldrichS6942
TrypLE ExpressLife Technologies12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7Sigma-Aldrich688000הריכוז הסופי הוא 5 ומיקרו; M (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)
ובטא;-אסטרדיולסיגמא-אולדריץ'E2758הריכוז הסופי הוא 100 ננומטר (מרכיב של מצע תרבית אורגנואידים)

מקורות

  1. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  2. Lohmussaar, K., Boretto, M., Clevers, H. Human-derived model systems in gynecological cancer research. Trends Cancer. 6 (12), 1031-1043 (2020).
  3. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  4. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Rep. 31 (11), 107762(2020).
  5. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Curr Pharm Biotechnol. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  6. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  7. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer cell death analyzed by live cell imaging of spheroids. Sci Rep. 12 (1), 1488(2022).
  8. Deben, C., et al. OrBITS: label-free and time-lapse monitoring of patient derived organoids for advanced drug screening. Cell Oncol (Dordr). 46 (2), 299-314 (2023).
  9. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues). Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).
  10. Le Compte, M., et al. Multiparametric tumor organoid drug screening using widefield live-cell imaging for bulk and single-organoid analysis. J Vis Exp. 190, 64434(2022).
  11. Hanson, K. M., Finkelstein, J. N. An accessible and high-throughput strategy of continuously monitoring apoptosis by fluorescent detection of caspase activation. Anal Biochem. 564-565, 96-101 (2019).
  12. Isherwood, B., et al. Live cell in vitro and in vivo imaging applications: accelerating drug discovery. Pharmaceutics. 3 (2), 141-170 (2011).
  13. Bi, J., et al. Successful patient-derived organoid culture of gynecologic cancers for disease modeling and drug sensitivity testing. Cancers (Basel). 13 (12), 2901(2021).
  14. Binaschi, M., Zunino, F., Capranico, G. Mechanism of action of DNA topoisomerase inhibitors. Stem Cells. 13 (4), 369-379 (1995).
  15. Park, Y. Y., Ahn, J. H., Cho, M. G., Lee, J. H. ATP depletion during mitotic arrest induces mitotic slippage and APC/C(Cdh1)-dependent cyclin B1 degradation. Exp Mol Med. 50 (4), 1-14 (2018).
  16. Lukonin, I., Zinner, M., Liberali, P. Organoids in image-based phenotypic chemical screens. Exp Mol Med. 53 (10), 1495-1502 (2021).
  17. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  18. Ramm, S., et al. High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids. Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).
  19. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  20. Van Hemelryk, A., et al. Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids. Cells. 12 (10), 1377(2023).
  21. Bi, J., et al. Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy. Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).
  22. Bi, J., et al. Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer). Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).
  23. Guo, C., et al. B7-H3 as a Therapeutic target in advanced prostate cancer. Eur Urol. 83 (3), 224-238 (2023).
  24. Gil, V., et al. HER3 is an actionable target in advanced prostate cancer. Cancer Res. 81 (24), 6207-6218 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Z StackCellular Phenotyping

מאמרים קשורים