מאמר שיטה

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה בתא בנפח קטן

DOI:

10.3791/67442

⸱

25 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מראים כי תא ה-0.5 מ"ל לרספריומטריה ברזולוציה גבוהה מציג תוצאות העולות בקנה אחד עם תא ה-2.0 מ"ל אם מיושם תיקון רקע O2 אינסטרומנטלי מתאים. זה דורש פחות דגימה, וזה יתרון למחקרים עם זמינות מוגבלת או יכולות נשימה נמוכות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירת שטפי נשימה היא מכרעת להבנת יחסי הגומלין המורכבים בין תהליכים מטבוליים. מחקרים על תאים ורקמות עם זמינות דגימה מוגבלת וקצבי נשימה נמוכים עשויים להפיק תועלת מנפחי ניסוי קטנים. בדקנו אם תא ה-0.5 מ"ל מניב תוצאות העולות בקנה אחד עם תא ה-2.0 מ"ל בריכוזי דגימה זהים המשמשים ברספירומטריה ברזולוציה גבוהה עם האורובורוס. שטף הרקע O2 היה גבוה פי 4 בתאים של 0.5 מ"ל מאשר בתאים של 2.0 מ"ל ברוויה באוויר, אך היה ניתן לשחזור, מה שאפשר תיקון רקע מדויק. מהירות הערבוב האופטימלית הייתה בין 550 סיבובים לדקה (סל"ד) ל-750 סל"ד בתא של 0.5 מ"ל. שטפי נשימה בתאים חיים, תאים חדירים ומיטוכונדריה מבודדת נמדדו במקביל בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל, תוך שימוש בפרוטוקולי טיטרציה של Substrate-Uncoupler-Inhibitor עם 14 עד 20 טיטרציות. O2 שטפים בסוגי התאים השונים היו זהים בגבולות הזיהוי. תא ה-0.5 מ"ל, הדורש קרוב פי ארבעה פחות דגימה מהתא של 2.0 מ"ל, מציע יתרון משמעותי למחקרים עם כמויות מוגבלות של דגימה או יכולות נשימה נמוכות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירת מסלולי הנשימה המיטוכונדריאלית היא המפתח לשפוך אור על המנגנונים המטבוליים העומדים בבסיס מחלות שונות, הזדקנות או תגובות ללחץ, ובכך לספק יעדים פוטנציאליים להתערבויות טיפוליות ושיפור יכולות האבחון 1,2,3. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה (HRR) מאפשרת ניתוח מפורט של בקרת מסלול וצימוד מיטוכונדריאלי בזרחון חמצוני (OXPHOS) על פני מגוון סוגי דגימות ותכשירים4. נפח תא הניסוי הוא מאפיין עיצובי בסיסי של מכשירים רספירומטריים. נפח החדר שנקבע בעבר הוא 2.0 מ"ל באורובורו. נפח זה עבר אופטימיזציה כדי לכלול שטף O2 רקע אינסטרומנטלי נמוך ולהבטיח הומוגניות של המדיום המעורבב. אלה הם בין קריטריוני האיכות העיקריים למדידה מדויקת של נשימה בתנאים נמוכי חמצן והיפראוקסיים הנדרשים לקינטיקה של חמצן מיטוכונדריאלי וסיבי שריר חדירים, בהתאמה 5,6,7,8,9. יתר על כן, מספר הכנסות מרובות חיישנים10 דורשות את החלל של תא 2.0 מ"ל (טבלה 1).

במחקר הנוכחי בדקנו את ההיתכנות של הפחתת נפח התא עבור HRR מ-2.0 מ"ל ל-0.5 מ"ל. האם ניתן ליישם ספירת תאים נמוכה יותר או כמויות רקמה נמוכות יותר בבדיקות ספירומטריות בתא קטן יותר מבלי לפגוע בדיוק? הבהרת שאלה זו חשובה לחקירת רקמות אנושיות וביופסיות נוזליות, תאים ראשוניים ותרביות תאים איטיות1. באופן דומה, הפחתה של נפח התא עשויה להועיל במחקרים של דגימות עם פעילות נשימתית נמוכה במיטוכונדריה פגומה11 ובמסלולים מיטוכונדריאלים בעלי יכולות נמוכות מטבען, כגון חמצון חומצות שומן במוח12. עם זאת, הרזולוציה עלולה להצטמצם בגודל תא נמוך עקב גידול לא פרופורציונלי של חפצים של דיפוזיה אחורית של O2 וכיול נפח לא מדויק13,14. לכן, ניתחנו את הביצועים האינסטרומנטליים של האורובורו כאשר תא הנפח הקטן (sV) מכויל בנפח ניסיוני מינימלי של 0.5 מ"ל, בהשוואה לתא הנפח הקלאסי (cV) המכויל ב-2.0 מ"ל. בפרט, ניתחנו את שטף הרקע האינסטרומנטלי O2 ומהירות הערבוב האופטימלית.

פרוטוקולי טיטרציה של מצמד-מצמד-מעכב (SUIT) משמשים להערכת קצב ומצבים נשימתיים בניתוח OXPHOS. פרוטוקולי SUIT כללו 14 עד 20 טיטרציות לכל בדיקה רספירומטרית וכללו שטפי O2 נשימתיים שנעו בין כמה pmol∙s-1∙mL-1 למאות pmol∙s-1∙mL-1. מצבי בקרת צימוד כוללים את קצב הדליפה L, כלומר, המרכיב המפזר של הנשימה, שאינו זמין לזרחן אדנוזין-5'-דיפוספט (ADP) לאדנוזין-5'-טריפוספט (ATP) ונובע מדליפת פרוטון, החלקת פרוטון, מחזור קטיון ודליפת אלקטרונים. קיבולת ה-OXPHOS P אחראית לנשימה של המיטוכונדריה כאשר העברת אלקטרונים הנמדדת כצריכת O2 (חמצון) מחוברת לסינתזת ATP (זרחון) בנוכחות ADP. יכולת העברת האלקטרונים E במצב מנותק מכומתת על ידי טיטרציות של פרוטונופור בנוכחות מצעים מיטוכונדריאלים15. צריכת החמצן השיורית Rox נקבעת לאחר הוספת מעכבי קומפלקס I ו-Complex III רוטנון ואנטימיצין A.

מדדנו את הנשימה של תאים ותכשירים מיטוכונדריאלים בתאיs V ו-cV. טסיות הדם הן שברים ציטופלזמיים של מגקריוציטים ומייצגים מקור שניתן להשיג בקלות למיטוכונדריה אנושית. לכן, טסיות הדם יושמו כמודל לתאים חיים (או חלקיקי תאים) עם ממברנות פלזמה שלמות. נשימה של תאי דם משמשת כסמן ביולוגי למחלות מיטוכונדריאליות מערכתיות ומתאמת עם הכושר הביו-אנרגטי של איברים פעילים מטבולית 16,17,18,19, אם כי לא ניתן להכליל ממצאים אלה 20,21,22. פיברובלסטים אנושיים נבחרו ליישומם כמודל תאי של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה 1,23,24,25. שלמות ממברנות הפלזמה נחוצה לכדאיות התא, אך החדירות הסלקטיבית שלה מאפשרת חילופי מולקולות בין הציטוזול למדיום שמסביב. לפיכך, פיברובלסטים עם ממברנות פלזמה חדירות כימית נחקרו כדוגמה לתאים חדורים, בהשוואה למיטוכונדריה מבודדת המשמשת להערכת תפקוד המיטוכונדריה ונדרשה להפרדת תת-אוכלוסיות מיטוכונדריאליות26,27.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור המחקר על טסיות דם אנושיות, שמונה מתנדבים סיפקו הסכמה מדעת בכתב להשתתף במחקר, שאושר על ידי הרשות השוודית לביקורת אתית (מס' 2013/181). שני קווי תאי פיברובלסטים של עור אנושי מיילודים זכרים נרכשו מ-ATCC ונעשה בהם שימוש על פי אישור אתי של משרד הבריאות של צ'כיה (פרויקט: AZV MZ CR NU22-07-00474). הליכים הקשורים לעכברים נערכו בהתאם לחוק הניסויים בבעלי חיים האוסטרי ובהתאם לאמנה האירופית להגנה על בעלי חוליות המשמשים למטרות ניסיוניות ומדעיות אחרות (Tierversuchsgesetz 2012; הוראה 2010/63/EU; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). עקרון 3Rs יושם כדי למזער את מספר חיות הניסוי.

1. כיול עוצמת הקול

  1. הרכיבו את תאי הנפח הקטן (sV) או את תאי הנפח הקלאסי (cV) על האורובורוס (איור 1A,B; טבלה 1).
  2. הפעל את ה-Oroboros והתחבר ל-DatLab.
  3. יבש את התאים.
  4. פיפטה 0.54 מ"ל של H2O לתוך sV (0.50 מ"ל נפח ניסיוני אפקטיבי בתוספת 0.04 מ"ל נפח מת נימי) או 2.07 מ"ל של H2O לתוך cV (2.00 מ"ל נפח אפקטיבי בתוספת 0.07 מ"ל נפח מת נימי).
    הערה: כדי למנוע אובדן נוזלים בין החלק העליון של גליל הזכוכית למחזיק תא הפוליאוקסימתילן (POM), הכנס את קצה הפיפטה עמוק מספיק כדי לגעת בדופן תא הזכוכית.
  5. הפעל את הבוחשים.
  6. לפני סגירת החדר, יש להרטיב את טבעות ה- O של הפקקים תוך שמירה על הנימים שלהם יבשים. שחרר את טבעות כיול הנפח והכנס את הפקקים כלפי מטה עד שהנוזל ממלא את נימי הפקק ומופיעה טיפה קטנה בשקע בקצה העליון של הנימים (טבלה 1).
  7. הדק את טבעות כיול הנפח כדי לתקן את מיקומן כך שהנפח המכויל יתקבל בהחדרות רצופות של הפקקים.

2. הגדרה כללית של אורובורוס

  1. הפעל את תוכנת DatLab .
  2. הגדר את טמפרטורת הניסוי (37 מעלות צלזיוס) ואת מהירות סיבוב הערבוב ב-550 סל"ד (9.2 הרץ או סיבובים לשנייה) בתא sV או 750 סל"ד (12.5 הרץ) בתא cV. הגדר את מרווח דגימת הנתונים ל-2 שניות עם החלקה מעל 80 שניות (40 נקודות נתונים) בבדיקות רקע אינסטרומנטליות O2 או 40 שניות (20 נקודות נתונים) עבור רספירומטריה.
    הערה: מוטות המערבל המגנטיים (AlNiCo מצופים בפוליווינילידן דיפלואוריד [PVDF]; טבלה 1) נסערים על ידי שדה מגנטי מסתובב פועם עם עוצמת שדה של 3.5 mT ברמת המערבל בתא.
  3. בצע כיול אוויר28 ב-MiR05 או באותו מדיום דגירה ששימש בניסויים הבאים.
  4. בצע אפס כיול חמצן מדי פעם אך לעולם לא מיד לפני תחילת הניסויים.
    1. הכן תמיסת מלאי Na-dithionite טרייה על ידי המסת אבקת O2-Zero במאגר פוספט של 50 מ"מ (pH 8.0) לריכוז של 2.5 מ"מ או 10 מ"מ עבור תאי sV או cV , בהתאמה.
    2. טיטראט Na-dithionite בעודף כדי להשיג את האות הגולמי R0 או זרם אפס [μA] בריכוז O2 0 μM14,28.

3. מבחן רקע אינסטרומנטלי O2

  1. לשכהS V
    1. לאחר כיול האוויר, סגור את החדר. עקוב אחר אות החמצן במשך כ-60 דקות עד שריכוז ה-O2 יורד מריווי האוויר לכ-150 מיקרומטר. הגדר ארבעה סימנים J°1 עד J°4 בתרשים 'O2 שיפוע שלילי'.
      הערה: בצע בדיקת רקע אינסטרומנטלית זו של O2 מדי יום לפני תחילת הניסוי.
    2. אופציונלי: עם מזרק המילטון, טיטראט נ-דיתיוניט מוכן לפי שלב 2.4.1 כדי להגיע לריכוז O2 של 100 מיקרומטר (איור 1C).
      הערה: בפרוטוקול אחר, נאט-דיתיוניט מועבר לתוך התא באמצעות מיקרו-משאבת הזרקת טיטרציה (TIP2k; איור משלים 1 ואיור משלים 2) להשוואה עם שיטה סטנדרטית לקביעת הרקע האינסטרומנטלי O2 שטף28.
  2. לשכהג' ה'
    1. לאחר כיול האוויר, סגור את החדר, המתן לייצוב שיפוע O2 וקבע את הסימון J°1 על החלקה 'שיפוע O2 neg.'28. בעזרת מזרק המילטון, טיטראט Na-dithionite שהוכן לפי שלב 2.4.1. בשלבים של 0.7 מיקרוליטר כדי להתאים למשטר החמצן של החדר sV ולהוריד את ריכוז ה-O2 ל-150 מיקרומטר.
    2. הוסיפו שלב טיטרציה נוסף של Na-dithionite (כ-7 מיקרוליטר) כדי להוריד את ריכוז ה-O2 ל-100 מיקרומטר (איור 1D).
  3. ניתוח נתוני רקע אינסטרומנטלי O2
    1. חשב את שיפוע הרקע האינסטרומנטלי O2 ב-DatLab28. בחר שטף/שיפוע מהתפריט העליון.
    2. פתח את חלון תיקון הרקע O2. בחר Active File כמקור לרקע O2 ובחר את סימני J° שישמשו לחישוב הרגרסיה הליניארית. החל את תיקון הרקע O2.

figure-protocol-1
איור 1: תאים בנפח קטן (s V) ובנפח קלאסי (cV) ובדיקת רקע אינסטרומנטלית O2. (A) Chambers v. (ב) לשכה ג' נ' (C) עקבות מייצגים של שיפוע שלילי וסימני J°1, sV (0.5 מ"ל; ירוק) ו-cV (2.0 מ"ל; כחול). (ד) ריכוז חמצן וסימני R1 תואמים. שלוש טיטרציות נא-דיתיוניט ידניות (כ-0.7 מיקרוליטר, מלאי 10 מ"מ; cV) וטיטרציה סופית של 7.0 מיקרוליטר של 2.5 מ"מ ו-10 מ"מ בתא sV ו-cV , בהתאמה. קוצים שנגרמו על ידי טיטרציות בוטלו. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. הוספת דגימה לתאי אורובורוס

הערה: ניתן להוסיף את הדגימה לתא בשתי שיטות: החלפת נפח חלקית (טסיות דם ופיברובלסטים במחקר הנוכחי) או החלפת נפח מלאה (מיטוכונדריה מבודדת במחקר הנוכחי).

  1. החלפת נפח חלקית
    1. הסר את הפקק שהוכנס במלואו. פיפטה והשליכו נפח Vמתוך MiR05. Vout הוא 60-70 מיקרוליטר עבור טסיות דם ו-80-150 מיקרוליטר עבור פיברובלסטים, המחושבים על פי ריכוזי התאים בתרחיף תאי המלאי.
    2. שווה ערך ל-V out, פיפטה באותו נפח VJ.i של תרחיף תאי מלאי (עם ריכוז תאים ידוע) לתוך התא (איור 2).
    3. חשב את ריכוז תאי הניסוי בנפח V' בפועל (0.54 מ"ל ו-2.07 מ"ל), גדול מנפח הניסוי האפקטיבי V (0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל).
      הערה: יש לתכנן ריכוזים של תרחיף תאי המלאי וריכוז תאי הניסוי כדי להשיג נפחים של VJ.i = Vהחוצה התואמים לשגיאת טיטרציה קטנה. בניסויים עם טסיות דם, נעשה שימוש בפקק אב טיפוס עבור תאS V עם נפח מת נימי של 0.05 מ"ל.
  2. החלפת נפח מלאה
    1. שואבים את כל המדיום מהתא ומחליפים אותו בלפחות 0.54 מ"ל או 2.07 מ"ל של תמיסת מלאי מיטוכונדריה מבודדת בריכוז הדגימה הניסיוני בתאי sV או cV, בהתאמה.
    2. סגור את החדר ושאב את תמיסת המלאי המיטוכונדריאלית העודפת מכלי הפקק.
      הערה: החלפת נפח מלאה אינה כוללת כל שונות בריכוז המיטוכונדריה שעלולה להיגרם על ידי טיטרציה לתוך התא הסגור דרך נימי הפקק עם מזרק המילטון. השיטה האחרונה ישימה לדגימות בקוטר קטן שהוכנו בתרחיפים מרוכזים (למשל, מיטוכונדריה מבודדת); עם זאת, הוא חושף תאים שבירים לנזק פוטנציאלי של ממברנות הפלזמה על ידי כוחות גזירה המופעלים במחט באורך 51 מ"מ של מזרק המילטון (קוטר פנימי של 0.41 מ"מ). זה נמנע על ידי הסרת הפקק והכנסת הדגימה לתא על ידי החלפת נפח חלקית או מלאה. נחקרו שלושה סוגים של תכשירים מיטוכונדריאליים. ההכנות לדוגמה מתוארות בתיק משלים 1 1,26,29,30.
  3. תאים חיים: טסיות דם אנושיות
    1. הכניסו את הקריביאלים המכילים טסיות דם לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והפשירו את התוכן עד שיישאר מעט קרח.
    2. פתח את הקריוביאלים והוסף 1 מ"ל של מדיום מחומם מראש (DPBS + 10 מ"מ EGTA, 37 מעלות צלזיוס) לאט בטיפות.
    3. מערבבים בעדינות את הטסיות ומעבירים אותן לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בנפח כולל של 10 מ"ל בינוני מחומם מראש (DPBS + 10 מ"מ EGTA, 37 מעלות צלזיוס). צנטריפוגה ב 1000 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) באמצעות רוטור מתנדנד החוצה (תאוצה 6, בלם 2).
    4. השעו מחדש את הטסיות ב-0.25 מ"ל DPBS + 10 מ"מ EGTA (RT) והוסיפו אותן לתאים על ידי החלפת נפח חלקי לריכוז תאים ניסיוני ראשוני הנע בין 157 · 106 עד 210 · 106 x·mL-1 בתא של 0.5 מ"ל ומ-164 · 106 עד 220 · 106 x·mL-1 בתא של 2.0 מ"ל (ראה31 לפרטים על היחידה האלמנטרית x).
      הערה: אורובורוס אחד צויד בתא sV ו-cV במיקומים A ו-B, בהתאמה, בשימוש במקביל לאורובורוס אחר המצויד בתא sV ו-cV במיקומים B ו-A, בהתאמה.
  4. תאים חדירים: פיברובלסטים אנושיים
    1. הוסף את התאים לתאי האורובורוס על ידי החלפת נפח חלקית לריכוז תאים נומינלי של 0.75 · 106 x·mL-1 בשני סוגי התאים וחשב את הריכוז בפועל (שלב 4.1.3).
      הערה: במקביל נעשה שימוש בכלי אורובורוס שונים, כל אחד מהם מצויד בתאי sV או cV .
  5. מיטוכונדריה מבודדת: לב עכבר
    1. הוסף 15 מיקרוליטר של תרחיף מיטוכונדריאלי ל-5985 מיקרוליטר של מדיום נשימה מיטוכונדריאלי (MiR05), וכתוצאה מכך ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי מלאי נע בין 0.013-0.026 מ"ג∙mL-1.
    2. הוסף את התרחיף המיטוכונדריאלי לתאי Oroboros על ידי החלפת נפח מלאה.
      הערה: אורובורוס אחד צויד בתא sV ו-cV במיקומים A ו-B, בהתאמה, בשימוש במקביל לאורובורוס אחר המצויד בתאיs V ו-cV במיקומים B ו-A, בהתאמה.

figure-protocol-2
איור 2: הוספת תרחיף התא על ידי החלפת נפח חלקית. (A) תוספת בתא 0.5 מ"ל sV ו-(B) בתא 2.0 מ"ל cV. (1) תא סגור עם נפחים של מדיום נשימה V ונימי פקק מלא Vstc, למדידת רקע אינסטרומנטלי O2 שטף JO2°. (2) הפקק הוסר, Vstc התנקז לתוך התא וכתוצאה מכך הנפח הכולל V'= V+Vstc. (3) הסרה חלקית של מדיום Vהחוצה = -V J.i. נפח V'= V'+Vהחוצה נשאר בתא. (4) צנרת תת-דגימה עם נפח V J.i של תרחיף תאי מלאי רספירומטרי לתוך התא וכתוצאה מכך נפח כולל V# = V+Vstc של תרחיף תאים מדולל. (5) תא סגור עם נימי פקק מלאים (נפח מת Vstc) למדידת שטף O2 ספציפי לנפח J V,O2 בנפח ניסיוני V. נתון זה שונה מאיור 2A בספירת תאים ונורמליזציה ב-HRR41. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

5. פרוטוקולי תביעה

  1. טיטרציה של תמיסות המלאי של הכימיקלים המפורטים בטבלה משלימה 1 לתוך התאים עם מיקרו-מזרקים של המילטון, והתאמת נפחי הטיטרציה כדי להשיג את אותם ריכוזים ניסיוניים בתאיs V ו-cV (ראה מקרא איורים באיורים 6, 8, 10).
  2. בחר פרוטוקול SUIT-003_D018 32,33 (עבור טסיות דם במחקר הנוכחי).
  3. פרוטוקולים נבחרים SUIT-001_D004 4,15,34,35 ו-SUIT-002_D007 4,15,35,36 (עבור פיברובלסטים במחקר הנוכחי).
  4. בחר פרוטוקול SUIT-002_D005 4,15,35,37 (עבור מיטוכונדריה מבודדת במחקר הנוכחי).

6. ניתוח נתוני SUIT

  1. ב- DatLab, הגדר סימנים להגדרת מקטעים של חלקות נבחרות.
  2. בחר שטף/שיפוע בתפריט העליון. פתח את חלון השטף/שיפוע . החל את תיקון נפח הטיטרציה לדילול דגימות תלויות על ידי כל טיטרציה בפרוטוקול SUIT.
  3. בחר סימנים מהתפריט העליון. סטטיסטיקת Open Mark כדי להציג את החציון של נקודות הנתונים המסומנות בבסיס מתוקן על ידי הפחתת צריכת החמצן השיורית (rox).
  4. חשב את היירוט והשיפוע בין תוצאות זוגיות המתקבלות בתאי sV ו- cV על ידי ניתוח רגרסיה הפוכה25,28 באמצעות גיליון אלקטרוני.
  5. השווה את קצב הנשימה במצב רוקס (מינימום O2 שטפים) בתאי sV ו- cV על ידי מבחן t זוגי של סטודנט באמצעות התוכנה jamovi 2.3.1338.
    הערה: מכיוון ששני התאים במכשיר Oroboros הם עצמאיים מבחינה תפקודית (למעט מרווחי הטמפרטורה וההקלטה של DatLab), ניתן לשקול מדידות בכל תא בנפרד, בדומה לשימוש במכשירים שונים. התוצאות הסופיות עשויות להיות מדווחות כחציונים או ממוצעים של תאים מרובים עם מידע על השונות שלהם.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האותות הגולמיים R1 [μA] של חיישני החמצן (POS) צפויים להיות בלתי תלויים בנפח השלב המימי בשיווי משקל עם שלב הגז של האוויר בתא ה'פתוח', כפי שאושר ב טבלה משלימה 2. בתא הסגור, לעומת זאת, הרקע האינסטרומנטלי O2שטף קרוב לרוויה באוויר J°1[pmol∙s-1∙מ"ל-1] תלוי בנפח V (טבלה משלימה 2). ה-O2צריכת החיישן [PMOL∙s-1] ניתן לחזות מזרימת האלקטרונים הנמדדת כאות הגולמי המתוקן באפס R1-R0 [μA], מספר המטען 4 e-/O2וקבוע פאראדיי F = 96 485.33 C∙mol-1. 1 μA שווה ערך לזרימת אלקטרונים (e-) של 10.36 חלקים למיליון-1. חלוקה במספר החיוב גורמת ל-O2זרם15,39 של 2.591 pmol∙s-1·μA-1. החציון המתועד של R1-R0 היה 2.09 μA ו-1.98 μA בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל, בהתאמה (טבלה משלימה 2; R0 = 0.006 ± 0.007 μA ב-sV ו- R0 = 0.004 ± 0.003 μA ב- cV chambers), המקביל תיאורטית ל-O2שיעורי צריכה של 5.41 pmol∙s-1ו-5.13 pmol∙s-1. ה-O2זרימת החיישן מומרת לשטף הספציפי לנפח הצפוי בריווי האוויר (J°R1) כ-5.41 pmol∙s-1/0.5 מ"ל = 10.82 pmol∙s-1∙מ"ל-1ו-5.13 pmol∙s-1/2.0 מ"ל = 2.56 pmol∙s-1∙מ"ל-1בV ו-גV בהתאמה. עם אותו סוג של חיישני חמצן פולרוגרפיים בתא של 2.0 מ"ל ו-0.5 מ"ל, הרקע הספציפי לנפח O2שטף - מחושב מה- R1-R0 הנוכחי (J°R1) - גדל תיאורטית פי 4 ביחס הפוך לנפח החדר. J°אוויר (ברוויה אווירית, שבה הדיפוזיה האחורית היא אפס; השווה שולחן 2 ו טבלה משלימה 3) חושב עבור ה- O2ריכוז בריווי האוויר מהרגרסיה הליניארית של מבחן הרקע הניסיוני (איור 3). J°אוויר התקרב לערכים הצפויים תיאורטית J°R1 לשני הבתים (שולחן 2). ה J°אוויר / J°R1היחס היה 0.85 ± 0.04 ו-0.92 ± 0.12 ב-SV ו-גV תא, בהתאמה, בהתאם לסדרה עצמאית של 52 מדידות בתא של 2.0 מ"ל, בהן יחס זה היה 0.95 ± 0.12 (טבלה משלימה 4). J°אוויר היה גבוה פי 3.9 בתא של 0.5 מ"ל מאשר בתא של 2.0 מ"ל. הרשת O2דיפוזיה בגב J°50מחושב ב- 50 μM O,2מהרגרסיה הליניארית של מבחן הרקע הניסיוני, היה גבוה רק פי שלושה בתא של 0.5 מ"ל (שולחן 2). השונות של רקע אינסטרומנטלי O2השטפים היו כמעט זהים בשני נפחי התא השונים, עם סטיית תקן (SD) של 0.5 ו-0.3 pmol∙s-1∙מ"ל-1בשביל J°אוויר ו-0.9 ו-0.8 pmol∙s-1∙מ"ל-1 בשביל J°50בV ו-גV תא, בהתאמה (שולחן 2). למרות הרקע האינסטרומנטלי הגבוה יותר O2מדרונות בתא 0.5 מ"ל, התלות ברקע O2שטף על cO2היה ניתן לשחזור בשני סוגי התאים (איור תלת מימד). התוצאה היא ערכים נמוכים של השאריות <±1 pmol∙s-1∙מ"ל-1לשני הבתים (טבלה משלימה 5), בהתאם למגבלת הגילוי של האורובורוס28.

כימתנו את השפעת מהירות הערבוב על האות הגולמי של הכיול R1 של הקופה בין 350 סל"ד (5.8 הרץ) ל-950 סל"ד (15.8 הרץ) בשלבים של 100 סל"ד (1.7 הרץ) עם החדר בתצורה 'פתוחה'. בתצורה זו, ה-O2 המומס בתווך נמצא בשיווי משקל עם שלב הגז; לכן, שינויים באות הגולמי (מיקרואמפר [μA]) כפונקציה של מהירות הערבוב אינם משקפים הבדלים אמיתיים ב-cO2. חיישני החמצן הגיבו לשינוי במהירות הערבוב עם סטייה קטנה מ-R1 במהירות ברירת המחדל של 750 סל"ד, ללא תלות בנפח התא (איור 4). בתצורה 'פתוחה', הרעש של שיפוע O2, המוגדר כ-SD עבור כל שלב לאחר ייצוב האות, היה הנמוך ביותר ב-850 סל"ד בשני סוגי התאים וגדל כאשר מהירות הערבוב חרגה מערך זה לשני הכיוונים (איור 5A). מתחת ל-550 סל"ד, הרעש של שיפוע O2 חרג מהסף של ±4 pmol∙s-1∙mL-1, והגדיר את מהירות הערבוב המעשית המינימלית. בשל מגבלות טכניות, הגבול העליון לא הושג, מה שהופך את 950 סל"ד למהירות הערבוב המעשית המקסימלית (איור 5A). בטווח זה, הסטייה של אות O2 מ-R1 הייתה <2.5%. סגירת התאים לא שינתה את הקשר בין רעש למהירות הערבוב (איור 5B). קבוע הזמן האקספוננציאלי τ, היה 2.53 ± 0.05 שניות ב-550 סל"ד ו-2.50 ±-0.05 שניות ב-750 סל"ד עבור תא של 0.5 מ"ל (איור משלים 3).

פרוטוקול SUIT-003_D018 המיושם על טסיות הדם כולל עד 14 שלבי טיטרציה. הוא נועד לחקור את בקרת הצימוד של תאים חיים, CE וחדירות קרום הפלזמה כמדד לכדאיות התא32. זרימת החמצן שנמדדה בשני סוגי התאים (איור 6) הייתה מותאמת באופן הדוק בכל מצבי הנשימה (איור 7). נדרשים חמצון מחדש לסירוגין כדי למנוע היפוקסיה תפקודית או להגביל את ריכוז ה-O2 הניסיוני לטווח מוגדר. חמצון מחדש בוצע על ידי פתיחת התא למצב 'פתוח' לאחר טיטרציה של ריקבון. עם סגירת החדר, שטף O2 התייצב תוך 4 דקות בתא של 2.0 מ"ל, אך נדרשו כ-10 דקות בתא של 0.5 מ"ל לפני ייצוב וקביעת הסימן החדש (איור 6 ואיור משלים 4). חמצון מחדש במצב רוקס כאשר שטפי O2 נמוכים מונע ירידה של ריכוז O2 במהלך הזמן הנדרש לייצוב. רוקס מעוכב רוטנון היה 0.9 ± 0.6 ו-2.0 ±-0.6 pmol∙s-1∙mL-1 ב-98 ±-17 ו-94 ±-17 מיקרומטר O2 (ממוצע ± SD) בתא sV ו-c V, בהתאמה. רוקס גדל ב-3.1 ±-0.9 ו-0.9 ±-0.4 pmol∙s-1∙mL-1 עם חמצון מחדש ל-159 ±-8 ו-147 ±-11 מיקרומטר O2 בתא sV ו-cV, בהתאמה. התלות בחמצן של רוקס שנצפתה בטסיות הדם תואמת את התוצאות על פיברובלסטים אנושיים ותאי אנדותל ורידים טבוריים40.

לניתוח OXPHOS בפיברובלסטים חדירים השתמשנו בשני פרוטוקולי SUIT עם עד 17 ו-20 שלבי טיטרציה (SUIT-001 ו-SUIT-002, בהתאמה35; איור 8); לפיכך, תיקון נפח הטיטרציה חשוב במיוחד מכיוון שבסוף SUIT-002, הדילול הסתכם במקסימום של 14% ו-10.5% בתא sV ו-cV, בהתאמה. ספירת תאי פיברובלסטים של 0.35·106 x ו-1.44.106 x בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל, בהתאמה, הביאה לאותו ריכוז תאים של 0.75·106 x∙mL-1. השילוב של SUIT-001 ו-SUIT-002 התייחס ל-20 מצבי נשימה, שכולם היו בקורלציה הדוקה בסוגים הדו-תאיים (r2= 0.950 עבור SUIT-001 ו-r 2= 0.959 עבור SUIT-002). בשני הפרוטוקולים, לקומפלקס IV היה פיזור גבוה יחסית (איור 9). לא היה צורך בחמצון מחדש ב-SUIT-001 החל משטף O2 ספציפי לנפח נמוך של 18.7 ±-7.0 pmol∙s-1∙mL-1 במצב השגרתי (ממוצע ± SD), מה שמאפשר לריכוז O2 לרדת ל-56 מיקרומטר עד לחלק המקושר ל-CIV של הפרוטוקול (איור 8A; 8Ama). עם זאת, ב-SUIT-002, חימצון מחדש בוצע לפני טיטרציות ניתוק, מה שהגדיל את ריכוז ה-O2 מ-100 מיקרומטר ל-180 מיקרומטר (איור 8B; 6Gp). בהתחשב בזמן הארוך הנדרש לייצוב השטף לאחר חמצון מחדש, יש להימנע מחמצון מחדש במהלך טיטרציות ניתוק.

פרוטוקול SUIT מקוצר הוחל על מיטוכונדריה מבודדת (איור 10). ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי נקבע לאחר הבדיקה הספירומוטרית, כך שלא ניתן להגדיר מראש את ריכוז הדגימה המדויק בתא. שטף נשימה ספציפי לנפח משתנה כפונקציה של ריכוז המיטוכונדריה. לכן, הנתונים הוצגו כשטף ספציפי לנפח וספציפי למסת חלבון (איור 11). שני הייצוגים מציגים את המתאם ההדוק בין המדידות שהתקבלו בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל (איור 11).

צריכת חמצן שיורית שנמדדה לאחר עיכוב קומפלקס III על ידי אנטימיצין A יכולה לשמש כמדד לביצועים אינסטרומנטליים בשיעורי נשימה נמוכים מאוד. בכל סדרות הניסוי, רוקס היה דומה בין תאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל (טסיות דם: t(5) = -0.34, p = 0.74; פיברובלסטים: SUIT-001: t(10) = 20.00, p = 0.06; SUIT-002: t(10) = 11.00, p = 0.96; מיטוכונדריה מבודדת: t(4) = -1.18, p = 0.27). פיזור הנתונים תאם במידה רבה את אי הוודאות האינסטרומנטלית של ±1 pmol∙s-1∙mL-1 13,28, כפי שמוצג באיור 12. הקבצים המקוריים זמינים לגישה פתוחה במאגר Zenodo: 10.5281/zenodo.11634408. 

figure-results-1
איור 3: שטף O2 ברקע אינסטרומנטלי עבור תא sV (0.5 מ"ל; ירוק ושחור) ו- cV (2.0 מ"ל; כחול). ריכוז O2 נע בין רוויה באוויר (כ-180 מיקרומטר) לכ-50 מיקרומטר. סמלים מוצקים: O2 ריכוזים הנשלטים על ידי טיטרציות ידניות של Na-dithionite. עיגולים שחורים: ריכוזי O2 הנשלטים על ידי טיטרציות של Na-dithionite באמצעות TIP2k בתא של 0.5 מ"ל (N = 8). תוצאות מבדיקות רקע אינסטרומנטליות נאספו מ-(A) סדרה 1 (sV: N = 2; cV: N = 2) לפני השימוש בתאים חיים (ce); (B) סדרה 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) לפני שימוש בתאים חדירים (pce); (C) סדרה 3 (sV: N = 10; cV: N = 10) לפני שימוש במיטוכונדריה מבודדת (imt). (D) נתונים מונחים על גבי לוחות A-C. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 4: השפעת מהירות סיבוב הערבוב על אות ה-POS ברוויית האוויר (תא 'פתוח') בתא של 0.5 מ"ל (ירוק) ובתא של 2.0 מ"ל (כחול). תגובה [%] ביחס לאותות כיול אוויר מתוקנים R0 R1-R0 [μA] ב-750 סל"ד (sV: N = 4; cV: N = 4). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 5: רעש של שיפוע O2 כפונקציה של מהירות סיבוב ערבוב .רעש המתבטא כסטיית התקן ב-(A) תא 'פתוח'; (B) תא סגור (0.5 מ"ל, ירוק; 2.0 מ"ל, כחול). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 6: O2 צריכה של טסיות דם אנושיות שמורות בהקפאה בתא של 0.5 מ"ל. עקבות מייצגים של ריכוז O2 [μM] (קווים כחולים) וזרימת O2 לתא [amol∙s-1∙x-1] מחושבים כשטף O2 [pmol∙s-1∙mL-1] חלקי ריכוז התאים של 157∙106 x∙mL-1 (קווים אדומים, מתוקנים לשטף O2 ברקע אינסטרומנטלי; קוצים שנגרמו על ידי טיטרציות בוטלו). ריכוז O2 נשמר מעל 50 מיקרומטר על ידי חמצון מחדש לסירוגין (אוויר, תא 'פתוח', גוון כחול). רצף מצבי נשימה (טיטרציות וקצבים; פרוטוקול SUIT-003_D018): ce1, נשימה שגרתית R של תאים חיים. ce1P, פירובט 5 מ"מ כמצע חיצוני. ce2Omy10 (פאנל A), טיטרציות Omy בצעדים של 5 ננומטר; נשימת דליפה L. ce3U0.3 (פאנל A) ו-ce3U0.1 (פאנל B), טיטרציות מנתקות לריכוז CCCP אופטימלי של 0.3 ו-0.1 מיקרומטר, בהתאמה; קיבולת ET E. ce3Glc, גלוקוז 11 מ"מ; E מעוכב בהדרגה על ידי ניתוק. ce4ריקבון, רוטנון 0.5 מיקרומטר מעכב CI; צריכת חמצן שיורית Rox. ce5S, סוקסינט 10 מ"מ; מגרה E בתאים חדירים לקרום הפלזמה. 1חפירה15 (פאנל A) ו-1חפירה10 (פאנל B), טיטרציות דיגיטונין בשלבים של 5 מיקרוגרם·מ"ל-1 לריכוזים אופטימליים של 15 ו-10 מיקרוגרם·מ"ל-1, בהתאמה לחדירה מלאה של קרום הפלזמה; קיבולת ET במסלול סוקסינט SE. 1c, ציטוכרום c 10 מיקרומטר; בדיקת שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. 2Ama, אנטימיצין A 2.5 מיקרומטר מעכב CIII; רוקס. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 7: מתאם נשימה של טסיות דם אנושיות שמורות בהקפאה שנמדד בתא של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל. זרימת O2 מתוקנת Rox הוערכה בפרוטוקול SUIT-003_D018 (איור 6); N = 6. (א) עם אוליגומיצין אומי; (ב) בלי אומי. שיפועים ויירוטים figure-results-6 figure-results-7 ממוצעים של רגרסיה של ריבועים מינימליים הפוכים ומקדמי קביעה r2 מחושבים מכל הנתונים. קווים שחורים מקווקווים מייצגים את קווי הזהות. קווים אדומים מייצגים את קווי הרגרסיה המחושבים. O2 זרימות במצב לאחר הוספת גלוקוז לא נכללו (ראה איור 6). הפרוטוקולים עם ובלי אוליגומיצין מופרדים בפאנלים A ו-B כדי למנוע חפיפה של נקודות נתונים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: צריכת O2 של פיברובלסטים בתא של 0.5 מ"ל. עקבות מייצגים של cO2 (קווים כחולים [μM]) וזרימת O2 לתא מחושבים כשטף O2 [pmol∙s-1∙mL-1] חלקי ריכוז התא (0.75·106 x∙mL-1), מתוקנים לשטף O2 ברקע אינסטרומנטלי (קווים אדומים, קוצים שנגרמו על ידי טיטרציות בוטלו). ריכוז O2 נשמר מעל 50 מיקרומטר על ידי חמצון מחדש לסירוגין (אוויר, תא 'פתוח', גוון כחול). רצף מצבי נשימה (טיטרציות ושיעורים). (A) פרוטוקול SUIT-001_D004: ce1, נשימה שגרתית R. +Dig, digitonin 10 μg·mL-1 (ce to pce), שאריות נשימה אנדוגניות ren. 1PM, פירובט 5 מ"מ ומלאט 2 מ"מ; נשימת דליפת נתיב NN L. 2D, ADP 2.5 מ"מ; קיבולת OXPHOS במסלול NN 2c, ציטוכרום c 10 מיקרומטר; בדיקת שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. 3U1.5, טיטרציות ניתוק לריכוז CCCP אופטימלי 1.5 מיקרומטר; קיבולת ET הקשורה ל-NADH NE. 4G, גלוטמט 10 מ"מ; N(PGM)E. 5S, סוקסינט 10 מ"מ; קיבולת נתיב NS, ET, NSE. 6Rot, רוטנון 0.5 מיקרומטר; קיבולת ET במסלול סוקסינט SE. 7Gp, גליצרופוספט 10 מ"מ; SGpE. 8Ama, אנטימיצין A 2.5 מיקרומטר; רוקס. 9AsTm, אסקורבט 2 מ"מ ו-TMPD 0.5 מ"מ; מצעים לגירוי CIV; החדר נשאר פתוח למשך 20 דקות כדי לאפשר שיווי משקל של חמצון חיזור ללא דלדול חמצן4; O2 שטף מחוץ לקנה מידה לאחר סגירת החדר (205 amol·s-1·x-1). 10Azd, אזיד 100 מ"מ; שטף רקע כימי תלוי חמצן CHB. (ב) פרוטוקול SUIT-002_D007: ce1, R. +חפירה, רן. +D, רן מגרה. +M.1, מלאט 0.1 מ"מ ו-1Oct, אוקטנואילקרניטין 0.5 מ"מ; קיבולת OXPHOS במסלול FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, מלאט 2 מ"מ התומך במסלול ה-N האנפלרוטי; פ(נ)פ. 3P ו-4G, הפעלה פרוגרסיבית ל-FNP. 5S, FNSP. 6Gp, FNSGpP. 7U1.5, FNSGpE. 8Rot, SGpE. 9אמה, רוקס. 10AsTm O2 שטף מחוץ לקנה מידה 207 amol·s-1·x-1. 11Azd, chb. באופן כללי, פעילות קומפלקס IV היא הפרש השיעורים, J(AsTm)-J(Azd) בריכוזי O2 תואמים מאוד. ראה איור 6 לפרטים נוספים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: מתאם נשימה של פיברובלסטים חדירים בתא של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל. זרימת O2 מתוקנת Rox ב-(A) SUIT-001_D004 ו-(B) SUIT-002_D007 (N = 6). שיפוע figure-results-10 ממוצע ויירוט figure-results-11 של רגרסיה של ריבועים מינימליים הפוכים ומקדם קביעה r2 מחושב מכל הנתונים. הקו השחור המקווקו מייצג את קו הזהות. קווים אדומים מייצגים את קווי הרגרסיה המחושבים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12
איור 10: צריכת O2 של מיטוכונדריה מבודדת של לב עכבר בתאים של 0.5 מ"ל (ירוק) ו-2.0 מ"ל (כחול). עקבות מייצגים של (A) שטף O2 ספציפי למסה בריכוז חלבון מיטוכונדריאלי 0.023 מ"ג∙mL-1 (תוקן לשטף O2 ברקע אינסטרומנטלי, קוצים שנגרמו על ידי טיטרציות בוטלו) ו-(B) ריכוז O2 [מיקרומטר]. רצף מצבי נשימה (טיטרציות ושיעורים) בעקבות הפרוטוקול SUIT-002_D005: imt, שאריות נשימה אנדוגניות ren. +D, ADP 2.5 מ"מ; מגרה רן. +M.1, מלאט 0.1 מ"מ ו-1Oct, אוקטנואילקרניטין 0.5 מ"מ; קיבולת OXPHOS במסלול FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, ציטוכרום c 10 מיקרומטר; בדיקת שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. 2M2, מלאט גבוה 2 מ"מ התומך במסלול ה-N האנפלרוטי; פ(נ)פ. 3P, פירובט 5 מ"מ; פ.נ. פ. 4G, גלוטמט 10 מ"מ; פ.נ. פ. 5S, סוקסינט 10 מ"מ; FNSפ. 6Gp, גליצרופוספט 10 מ"מ; FNSGpP. 7U0.5, טיטרציות ניתוק לריכוז CCCP אופטימלי 0.5 מיקרומטר; FNSGpE. 8Rot, רוטנון 0.5 מיקרומטר מעכב CI; SGpE. 9Ama, אנטימיצין A 2.5 מיקרומטר מעכב CIII; צריכת חמצן שיורית Rox. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-13
איור 11: מתאם נשימה של מיטוכונדריה לבבית מבודדת של עכבר שנמדד בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל. שטף O2 בפרוטוקול המוצג באיור 10 (N = 4). (A) שטף O2 ספציפי לנפח. (B) שטף O2 מתוקן Rox חלקי ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי (0.013 - 0.026 mg∙mL-1). שיפוע figure-results-14 ממוצע ויירוט figure-results-15 של רגרסיה של ריבועים מינימליים הפוכים ומקדם קביעה r2 מחושב מכל הנתונים. קווים שחורים מקווקווים מייצגים את קו הזהות. קווים אדומים מייצגים את קו הרגרסיה המחושב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-16
איור 12: רוקס צריכת חמצן שיורית בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל. שטף לנפח שנמדד לאחר הוספת אנטימיצין A, בשילוב מניסויים עם תאים חיים (ce, ריבועים), תאים חדירים (pce, עיגולים) ומיטוכונדריה מבודדת (imt, משולשים). שיפוע figure-results-17 ממוצע ויירוט figure-results-18 של רגרסיה של ריבועים מינימליים הפוכים. קו מקווקו: קו זהות. קו אדום: קו רגרסיה מחושב. צל: טווח רזולוציה אינסטרומנטלית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מודולשוגו
תא ניסוי כרך V0.5 מ"ל2.0 מ"ל
קוטר פנימי של גליל זכוכית12.0 מ"מ16.0 מ"מ
קוטר חיצוני של גליל זכוכית24.0 מ"מ24.0 מ"מ
עובי קיר זכוכית6.0 מ"מ4.0 מ"מ
מוט בוחש מצופה PVDF11.5 x 6.2 מ"מ15.0 x 6.0 מ"מ
קוטר נימי פקק1.00 מ"מ1.30 מ"מ
שטח חתך נימי פקק0.79 מ"מ21.33 מ"מ2
אורך נימי פקק50.64 מ"מ48.86 מ"מ
נפח נימי פקק39.8 מיקרוליטר64.9 מיקרוליטר
נפח מת נימי פקק Vstc כולל טיפה קטנהא0.04 מ"ל0.07 מ"ל
Volume V' לכיול אמצעי אחסון0.54 מ"ל2.07 מ"ל

אהירידה צריכה להתאים ל-5 מיקרוליטר עבור החדר cV וקרוב ל-0 מיקרוליטר עבור החדרs V.
טבלה 1: מידות מודולי הנפח הקטן (sV) והנפח הקלאסי (cV) עם פקקי פוליאתר קטון (PEEK).

J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
תא ניסוי כרך V0.5 מ"ל2.0 מ"ל0.5 מ"ל2.0 מ"ל
התכוון9.222.37-3.17-1.17
חציון9.252.36-3.08-1.04
סטיית תקן0.490.340.930.83
מינימום8.201.79-5.11-3.72
המרבי10.413.42-0.820.67

טבלה 2: J°אוויר משוער לרוויה באוויר ו-J°50 מחושב בריכוז של 50 מיקרומטר O2 . נתונים מאוגמים של בדיקות רקע אינסטרומנטליות בסדרה 2 (pce) ו-3 (imt) ולפני טיטרציות TIP2k (0.5 מ"ל: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 מ"ל: N = 60).

קובץ משלים 1: הכנות לדוגמה. טסיות דם אנושיות, פיברובלסטים אנושיים ומיטוכונדריה מבודדים מלבבות עכברים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 1: בדיקת רקע אינסטרומנטלית O2 באמצעות TIP2k. עקבות מייצגים של הבדיקה שבוצעה באמצעות TIP2k לטיטרציה של Na-dithionite (2.5 מ"מ) בתא של 0.5 מ"ל. בינוני: MiR05, טמפרטורה: 37 מעלות צלזיוס, מהירות ערבוב: 750 סל"ד. קוצים שנגרמו על ידי טיטרציות בוטלו. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: רקע אינסטרומנטלי שטף O2 J°1 כפונקציה של ריכוז O2. תא s V (0.5 מ"ל; ירוק, N = 48) וחדרc V (2.0 מ"ל; כחול, N = 60) בסדרה 2 (pce, עיגולים) ו-3 (imt, משולשים), ולפני טיטרציות TIP2k בתא של 0.5 מ"ל (עיגולים שחורים, N = 8). קווים אדומים: חציון ± SD. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 3: קבוע זמן אקספוננציאלי τ כפונקציה של מהירות סיבוב הערבוב. ערכי τ בודדים עבור תא 0.5 מ"ל ב-37 מעלות צלזיוס (N = 2). בתא של 0.5 מ"ל τ היה 2.53 ± 0.05 שניות ב-550 סל"ד, 2.50 ±-0.05 שניות ב-750 סל"ד ו-2.47 ±-0.04 שניות ב-850 סל"ד. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 4: O2 צריכה של טסיות דם אנושיות שמורות בהקפאה בתא של 2.0 מ"ל. עקבות מייצגים של הפרוטוקול SUIT-003_D018, כולל טיטרציות אוליגומיצין (Omy). שטף [pmol∙s-1∙mL-1] תוקן עבור שטף O2 ברקע אינסטרומנטלי וחולק בריכוז התאים (164∙106 x∙mL-1). קוצים שנגרמו על ידי טיטרציות בוטלו. cO2 נשמר מעל 60 מיקרומטר על ידי חמצון מחדש לסירוגין (אוויר, תא 'פתוח', גוון כחול). רצף מצבי נשימה (טיטרציות ושיעורים): ce1, נשימה שגרתית R של תאים חיים. ce1P, פירובט כמצע חיצוני. ce2Omy10, טיטרציות Omy בצעדים של 5 ננומטר; נשימת דליפה L. ce3U2.0, טיטרציות מנתקות לריכוזים אופטימליים של 2 מיקרומטר; קיבולת ET E. ce3Glc, גלוקוז 11 מ"מ; E מעוכב בהדרגה על ידי ניתוק. ce4Rot, רוטנון 0.5 מיקרומטר מעכב CI; צריכת חמצן שיורית Rox. ce5S, סוקסינט 10 מ"מ; מגרה E בתאים חדירים לקרום הפלזמה. 1Dig20, טיטרציות דיגיטונין לריכוזים אופטימליים של 20 מיקרוגרם·מ"ל-1, לחדירה מלאה של קרום הפלזמה; קיבולת ET במסלול סוקסינט SE. 1c, ציטוכרום c 10 מיקרומטר; בדיקת שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. 2Ama, אנטימיצין A 2.5 מיקרומטר מעכב CIII; רוקס. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 1: כימיקלים המשמשים בפרוטוקולי מעכב-מצמד-ניתוק-טיטרציה (SUIT). קיצורים וריכוזי תמיסות מלאי עבור תאיs V ו- cV . אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 2: השוואה בין R1-R0 ו-J°1 בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל. נתונים מאוגמים של בדיקות רקע אינסטרומנטליות בסדרה 2 (pce) ו-3 (imt) ולפני טיטרציות TIP2k (0.5 מ"ל: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 מ"ל: N = 60). ממוצע הנתונים נלקח מסדרות ניסיוניות 2 (pce) ו-3 (imt) בלבד, שבוצעו בלחץ ברומטרי ממוצע של 94.9 kPa (אינסברוק, אוסטריה), לא כולל נתונים מסדרה 1 (ce) שהתקבלו בגובה פני הים. נעשה שימוש באותו סוג אך קופה בודדת שונה בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל. לכן, יש לקחת בחשבון את השונות בין חיישנים בעת השוואת תאיs V ו- cV. בעוד ש-J°1 = 2.26 ±-0.41 pmol∙s-1∙mL-1 שהושג בניסוי עבור תא של 2.0 מ"ל תאם באופן הדוק לערך המחושב, הניסוי J°1 = 8.48 ±-0.53 pmol∙s-1∙mL-1 עבור תא של 0.5 מ"ל היה נמוך מהצפוי. זה הוסבר על ידי התצפיות הבאות. לאחר סגירת החדר, שטף הרקע O2 הגבוה יותר בתא של 0.5 מ"ל מוריד את ריכוזי ה-O2 בסימנים עבור J°1 שנקבעו במרווחי זמן דומים (איור 1). ריכוז החמצן ב-J°1 היה בממוצע 4.06% ו-1.72% מתחת לרוויית האוויר בתא של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל, בהתאמה (איור משלים 2, טבלה משלימה 2). ב-cO2 נמוך יותר, צריכת ה-O2 המופחתת על ידי החיישן וחלק מהדיפוזיה האחורית של O2 מפחיתים את ה-J°1 שנקבע בניסוי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 3: ריכוז החמצן [μM] שבו התקבלו הכיול (R1) ו-J°1 וההפרש ביניהם באחוזים. נתונים מאוגמים של בדיקות רקע אינסטרומנטליות בסדרה 2 (pce) ו-3 (imt) ולפני טיטרציות TIP2k (0.5 מ"ל: N = 48; TIP2k: N = 8; 2.0 מ"ל: N = 60). אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 4: J°1 נמדד וצפוי בתא של 2.0 מ"ל. סדרה עצמאית של בדיקות רקע אינסטרומנטליות עם סדרה O2k A (עם פקקי טיטניום13), V = 2.0 מ"ל (37 מעלות צלזיוס, תמיסת NaCl עם מקדם מסיסות O2 0.92; N = 52). nO2/Qe = 106/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙μC-1 = 2.591 pmol∙s-1∙μA-1. מבוסס על ההנחה שדיפוזיה אחורית של O2 זניחה ב-cO2,1, מה שנכון רק ב-c O2,1 ~ cO2*. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 5: שאריות רגרסיה ליניארית (ערכים מוחלטים [pmol O2∙s-1∙mL-1]) המחושבות עבור כל מבחן רקע O2 אינסטרומנטלי. נתונים מאוגמים של מבחני רקע אינסטרומנטליים בסדרה 2 (pce) ו-3 (imt) ולפני טיטרציות TIP2k. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמות הדגימה הזמינה לרספריומטריה מוגבלת לעתים קרובות, למשל, במחקרים של ביופסיות, תאים ראשוניים או תרביות תאים הגדלות לאט עם ספירת תאים נמוכה1. יתר על כן, פעילות הנשימה מדוכאת עקב פגיעות מיטוכונדריאליות11 או בעת חקירת מסלולים מיטוכונדריאלים בעלי יכולות נמוכות, כגון חמצון חומצות שומן12. במקרים אלה, נפח תא נשימה נמוך מציע יתרונות לרזולוציה של שטף O2. עם זאת, שטפי O2 ברקע אינסטרומנטלי גדלים בנפחי תא נמוכים יותר וגורמים לשגיאות כאשר אינם נמדדים באופן אמין ולא מתוקנים כראוי כפונקציה של ריכוז O2. שכפול של בדיקות רקע אינסטרומנטליות של O2 ותיקוני רקע חשובים במיוחד עבור נפחי תא נמוכים. ערכים כמעט זהים של השטף התיאורטי (J°R1) והניסיוני (J°air) O2 מספקים ראיות לדיוק המדידה הפולרוגרפית עם 4 e-/O2 בתגובת הקתודה של הקופה. ההבדל בין J°R1 ל-J°air היה 1.64 ±-0.43 ו-0.22 ±-0.31 pmol∙s-1∙mL-1 בתא sV ו-cV, בהתאמה, מה שמצביע על דיוק במדידות שנופל בגבול הגילוי של תא 2.0 מ"ל (±1 pmol∙s-1∙mL-1)28. עם אותו סוג של חיישני חמצן פולרוגרפיים בתא של 2.0 מ"ל ו-0.5 מ"ל, שטף הרקע הספציפי לנפח O2 גדל פי 4 ביחס הפוך לנפח החדר, והשונות הייתה כמעט זהה בשני נפחי התא, עם SD של 0.5 ו-0.3 pmol∙s-1∙mL-1 עבור J°air ו-0.9 ו-0.8 pmol∙s-1∙mL-1 עבור J°50 ב-sV ו-cV תא, בהתאמה (טבלה 2). במינימום פעילויות נשימה - שעבורן תוכנן תא הנפח הקטן - אפילו תופעות רקע קטנות הופכות למשמעותיות (טבלה משלימה 3; איור משלים 2). לכן, נדרשת הערכה שגרתית של שטף הרקע האינסטרומנטלי O2 (איור 1) כדי ליישם את התיקון הנכון28.

ערבוב גבוה ומתמיד של המדיום נדרש כדי לשמור על מערכת הומוגנית ולהבטיח אות חמצן יציב. מהירות הערבוב של 750 סל"ד נקבעה עבור תא ה-2.0 מ"ל, אך המהירות האופטימלית לא הייתה ידועה בתא של 0.5 מ"ל. הגיאומטריות השונות של תא הזכוכית ומוט המערבל (טבלה 2) דורשות הערכה עצמאית של מהירות הערבוב האופטימלית. חיישני החמצן הגיבו לשינויים במהירות הערבוב בין 550 סל"ד ל-950 סל"ד, עם סטייה קטנה מהאות O2 R1 ב-750 סל"ד, ללא תלות בנפח החדר. קבוע הזמן האקספוננציאלי τ שהוערך עבור החדר sV היה בהסכמה עם τ שדווח עבור תא של 2.0 מ"ל באותה מהירות ערבוב13. תוצאות אלו מצביעות על כך שערבוב יעיל באותה מידה בשתי הגיאומטריות של התא וכי ניתן ליישם את מהירות הערבוב המוגדרת כברירת מחדל של 750 סל"ד (תא של 2.0 מ"ל) על תא ה-0.5 מ"ל. הן בתצורת התא 'הפתוח' והן בתצורת ה'סגור', לתא של 0.5 מ"ל היה יחס אות לרעש גבוה יותר, מה שמרמז על דיוק גבוה יותר כיתרון של תא 0.5 מ"ל (איור 5), אם כי לא ניתן לשלול את ההשפעה של שונות קופה בודדת. מכיוון שהרעש לא גדל בעת הורדת מהירות הערבוב מ-750 סל"ד ל-550 סל"ד, הפחתת מהירות הערבוב ל-550 סל"ד בתא של 0.5 מ"ל עשויה להועיל כדי למזער את מתח הגזירה מבלי לפגוע ביחס האות לרעש.

שיעורי צריכת O2 כמעט זהים נמדדו בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל בשלושה מודלים ניסיוניים כאשר הוחל תיקון הרקע המתאים. התוצאות שהתקבלו עם טסיות קטנות בקוטר 2 מיקרומטר42, פיברובלסטים חיים וחדירים, ומיטוכונדריה מבודדת מצביעות על כך שניתן לצפות לקבל קצב נשימה עקבי בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל במגוון רחב של סוגי תאים ותכשירים מיטוכונדריים. סיבי שריר חדורים, לעומת זאת, לא נבדקו במחקר הנוכחי. מדידה מדויקת של רוקס דורשת שליטה ברמות החמצן40 ורזולוציה אינסטרומנטלית גבוהה1. שטף O2 ספציפי לנפח של רוקס עשוי להיות נמוך עד לגבול הזיהוי. חמצון מחדש אינו הכרחי כאשר משתמשים בספירת תאים נמוכה או בכמויות נמוכות של דגימות בדרך כלל בניסוי. עם זאת, במידת הצורך, מומלץ לבצע חמצון מחדש במצבי נשימה עם שטף O2 נמוך כדי למנוע ירידה מהירה של ריכוז O2 במהלך התקופה הנדרשת לייצוב שטף O2. ייצוב שטף O2 לאחר חמצון מחדש לוקח זמן רב יותר בתא של 0.5 מ"ל.

כתרומה לבקרת האיכות, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לדילול המדגם בהשעיה במהלך החלפת נפח חלקית. לאחר הסרת הפקק שהוכנס במלואו, הנפח הכולל V' של מדיום הנשימה בתא ניתן על ידי נפח הניסוי V ונפח נימי הפקק Vstc (טבלה 2). לכן, נפח המלאי V J.i מדולל בנפח V' בפועל, שהוא גדול מ-V, וכתוצאה מכך גורם דילול V/V' של 0.5/0.54 = 0.926 ו-2.0/2.07 = 0.966 בתאים של 0.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל, בהתאמה (איור 2). בניסויים עם טסיות דם, נעשה שימוש בפקק אב טיפוס עבור תא s V עם נפח מת נימי של 0.05 מ"ל, המתאים למקדם דילול של 0.909.

נדרשות כמויות נמוכות כמעט פי ארבעה של תאים חיים, תאים חדירים ומיטוכונדריה מבודדת ב-0.5 מ"ל מאשר בתא של 2.0 מ"ל בריכוזי דגימה זהים (כמות לנפח), מה שמניב תוצאות דומות כמותית של צריכת O2 נשימתית מנורמלת עבור ספירת תאים או מסת חלבון. זה מצביע על כך ש-Chamber s V הוא כלי רב ערך למחקרים שבהם כמות הדגימות הזמינות מוגבלת. מצד שני, יישום כמות זהה של דגימה בתאs V מגדיל את שטף ה-O2 הספציפי לנפח ובכך מפחית את אי הוודאות של מדידות כאשר פעילות הנשימה נמוכה.

משטר החמצן במחקר הנוכחי הוגבל לטווח O2 של רוויית האוויר ל-30 מיקרומטר. מספר תצורות מרובות חיישנים של מודולי Oroboros NADH- ו-Q-; pH, NO ו-TPP+ -אלקטרודות10,44 - לא ניתן להכיל בתאS V ודורשות תא של 2.0 מ"ל.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EL הוא עובד של Oroboros Instruments. EG הוא המייסד והמנכ"ל של Oroboros Instruments.

LFGS הועסקה על ידי Oroboros Instruments במהלך הפרויקט. EÅF ו-EE הם עובדי Abliva AB, לונד, שוודיה, המחזיקה בהסכם מסחרי עם Oroboros Instruments.

LR מצהיר שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למנואלה פסרוגר על איסוף הנתונים על מיטוכונדריה מבודדת, לפטריציה גרת על התמיכה הטכנית בבדיקת מהירות סיבוב הערבוב ולמתאוס גרינגס על ניתוח קבוע הזמן מבדיקות הבוחש. אנו מודים לשותפתנו, WGT Elektronik GmbH & Co KG, קולסאס, אוסטריה, על מידע על נתונים טכניים של תאי הזכוכית, הפקקים ועוצמת השדה המגנטי. אנו מודים ללואיזה HD קרדוסו, אלחנדרה רומרו-מרטינז, אונדריי סובוטקה, אלבה טימון-גומז וחיימה וויליס על הערותיהם. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס' 859770, פרויקט NextGen-O2k. תרומה ל-COST Action CA15203-MitoEAGLE בתמיכה כספית של משימות מדעיות לטווח קצר (LFGS, LR).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Anaconda3Anaconda Software Distributionhttps://www.anaconda.com/תוכנה
ADPMerck, גרמניה117105
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריות 100xBiosera, צרפתXC-A4110זהירות H317 עלול לגרום לתגובה אלרגית בעור
Antimycin ASigma-Aldrich, ארה"בA8674זהירות H300  קטלני במקרה של בליעה, H400 לטווח קצר (אקוטי) סכנת מים 
אסקורבטסיגמא-אולדריץ', ארה"בA7631
ATPסיגמא-אולדריץ', ארה"ב  A 2383
BSA ללא חומצות שומןסיגמא-אולדריץ', ארה"ב A 6003אלבומין סרום בקר
CaCO3Sigma-Aldrich, ארה"בC 4830
CCCPSigma-Aldrich, ארה"בC2759קרבוניל ציאניד m-כלורופניל הידרזון זהירות H301 + H311 + H331 רעיל במקרה של בליעה, במגע עם העור או במקרה של שאיפה
Countess Automated Cell counter תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"בAMQAX100
ציטוכרום cסיגמא-אולדריץ', ארה"בC7752
DatLab Oroboros Instruments, אוסטריהגרסה 7.4תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים
DatLab Oroboros Instruments, אוסטריהגרסה 8.1תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים
בדיקת חלבון DCBio-Rad, ארה"ב5000112ערכת בדיקת חלבון; זהירות H314 גורם לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים
DigitoninSigma-Aldrich, ארה"D5628זהירות H301 רעיל אם נבלע
DithiothreitolSigma-Aldrich, ארה"בD 0632זהירות H318 גורם לנזק חמור לעיניים
DMEMPan Biotech, גרמניהP04-05551Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני
DMSOSigma-Aldrich, ארה"בD2650דימתיל-סולפוקסיד
DPBSLonza Bioscience, שוויץLONBE17-512FDulbecco ללא סידן s מי מלח חוצץ פוספט
EGTASigma-Aldrich, ארה"בE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, ארה"בA5256701סרום בקר עוברי
גלוקוזסיגמא-אולדריץ', ארה"ב&nbsp; G7528
גלוטמט סיגמא-אולדריץ', ארה"בG1626
גליצרופוספטסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-215789
Heraeus Multifuge 3s גדולתרמו פישר מדעי, ארה"בצנטריפוגהHM3S
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, גרמניה1701צנטריפוגה
ImidazoleHoneywell Fluka, אוסטריה56750זהירות H302 מזיק בבליעה, H314 גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים, H360D עלול לפגוע בתינוק שטרם נולד
jamovi פרויקט jamoviגרסה 2.3.13תוכנה
K+-MESSigma-Aldrich, ארה"בM 8250
Leucosep tube Greiner Bio-One GmbH, אוסטריהZ642843-300EAצינור צנטריפוגה עם מחסום פוליאתילן
Malate Sigma-Aldrich, ארה"בM1000אזהרה H319 גורם לגירוי חמור בעיניים.
מניטולסיגמא-אולדריץ', ארה"בM 4125
MgCl2 שרלאו, ספרדMA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments, אוסטריה60101-01מיקסר בינוני נשימה מיטוכונדריאלית
 Swelab Instruments, שוודיהשולחן נדנדה440S
Mr Frosty Frozen ContainerThermo Fisher Scientific, ארה"ב5100-0001מיכל הקפאה
OroborosOroboros Instruments, אוסטריהNextGen-O2k ו-O2k מטופלים באופן קולקטיבי עם המונח ' אורובורוס
Oroboros Chamber cVOroboros Instruments, אוסטריה23100-01תא נפח קלאסי
Oroboros Chamber sVOroboros Instruments, אוסטריה33100-01תא נפח קטן
Oroboros TIP2k-ModuleOroboros Instruments, אוסטריה11100-03מיקרו-Pump טיטרציה-הזרקה
O2-Zero PowderOroboros Instruments, אוסטריהברקוד 26600-02  Na-dithionite זהירות H251 חימום עצמי: עלול להתלקח, H302 מזיק בבליעה, H319 גורם לגירוי חמור בעיניים
אוקטנויל קרניטיןביוטרנד - APExBIO Technology, גרמניהB6371
אוליגומיציןסיגמא-אולדריץ', ארה"בO4876
פוספוקריאטיןסיגמא-אולדריץ', ארה"בP 7936
פירובטסיגמא-אולדריץ', ארה"בP2256זהירות H317 עלול לגרום לתגובה אלרגית בעור
רוטנוןסיגמא-אולדריץ', ארה"בR8875זהירות H300 קטלני אם נבלע
שורות תאי פיברובלסטים בעור   ATCC, ארה"ב
נתרן אזידסיגמא-אולדריץ', ארה"בS2002אזהרה H300 + H310 + H330 קטלני במקרה של בליעה, במגע עם העור או במקרה של שאיפת
סובטיליסין Aסיגמא-אולדריץ', ארה"P. 5380אזהרה H318 - גורם לנזק חמור לעיניים, H334 - עלול לגרום לתסמיני אלרגיה או אסתמה או קשיי נשימה בשאיפה
SuccinateSigma-Aldrich, ארה"בS2378
סוכרוזסיגמא-אולדריץ', ארה"בS 7903
Swelab Alfa מונה תאי דם Boule Diagnostics AB, שבדיה1420041
טאורין סיגמא-אולדריץ', ארה"בT 0625
Tecan Infinite TM F200Tecan, שוויץספקטרופוטומטר
TMPDסיגמא-אולדריץ', ארה"בT3134N,N,N',N'-טטרמתיל-p-פנילאנדיאמין דיהידרוכלוריד זהירות H315 גורם לגירוי בעור, H319 גורם לגירוי חמור בעיניים
טריפסיןסיגמא-אולדריץ', ארה"בT4799זהירות H334 עלול לגרום לתסמיני אלרגיה או אסתמה או קשיי נשימה בשאיפה
VacuetteGreiner Bio-One GmbH, אוסטריה15452520
ב ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts. PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).
  2. Schöpf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).
  3. Meszaros, A. T., et al. The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation. Transplant International. 37, 12380(2024).
  4. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  5. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
  6. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  7. Gnaiger, E. Oxygen Conformance of Cellular Respiration. Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).
  8. Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia. J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria. Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).
  11. Suomalainen, A., Nunnari, J. Mitochondria at the crossroads of health and disease. Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).
  12. Cardoso, L. H. D., et al. Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).
  13. Gnaiger, E. Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply. Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).
  14. Gnaiger, E. Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function. Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis. Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).
  16. Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study. Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).
  17. Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients. J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).
  18. Heimler, S., et al. Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women. Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).
  19. Palacka, P., et al. Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma. Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).
  20. Fischer, C., et al. Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver. Metabolites. 12 (3), 270(2022).
  21. JedIicka, J., et al. Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs. Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).
  22. Westerlund, E., et al. Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers. Heliyon. 10 (5), e26745(2024).
  23. Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts. Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).
  24. Yépez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).
  25. Gnaiger, E. Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts. MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).
  26. Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle. J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).
  27. Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).
  28. Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry. Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).
  29. Mela, L., Seitz, S. Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue. Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).
  30. Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration. Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).
  31. Gnaiger, E. The elementary unit — count and numbers in the International System of Units. BEC preprints. , (2025).
  32. Vernerova, A., et al. Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods. Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).
  33. Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018 (2024).
  34. Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004 (2024).
  35. Timón-Gómez, A., et al. Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation. Exp Physiol. , 1-33 (2025).
  36. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007 (2024).
  37. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005 (2024).
  38. The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , https://www.jamovi.org/ (2024).
  39. Gnaiger, E. Preface: A biologist´s view. Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).
  40. Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).
  41. Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR (2020).
  42. Williams, O., Sergent, S. R. Histology Platelets. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).
  43. Donnelly, C., et al. The ABC of hypoxia - what is the norm. Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).
  44. Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells. Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Oroboros

מאמרים קשורים