הלבנה איטרטיבית מרחיבה את הריבוי עם שימוש באוטומציה של צביעה עבור מתקני ליבה

סיכום

כאן, אנו מתארים את היישום של שיטת ההלבנה האיטרטיבית מרחיבה את הריבוי (IBEX) תוך שימוש במכתימי רקמות אוטומטיים זמינים מסחרית ושיקולי אופטימיזציה לשימוש בריאגנטים מבוססי הגברת אותות טירמיד.

תקציר

הלבנה איטרטיבית מרחיבה ריבוי (IBEX) היא טכניקת הדמיה פלואורסצנטית רב-סיבובית המבוססת על הגברת אותות טירמיד (TSA) רגישה ביותר המאפשרת בדיקה מפורטת של ביומולקולות חלבון רבות בדגימת רקמה בודדת באמצעות הלבנה חוזרת, צביעה מחדש ורישום משותף של תמונה. למרות האימוץ ההולך וגובר ליצירת צביעה חיסונית מרובת מאוד, הטמעת IBEX באופן אוטומטי באמצעות פריסה במתקני ליבה מציעה יתרונות רבים, כולל תפוקה מוגברת, יכולת שחזור ויעילות כוללת של צוות המעבדה. כאן, אנו מדגימים את היישום המוצלח של IBEX על שתי פלטפורמות אוטו-סטיינר בשימוש נרחב ודנים בשיקולי אופטימיזציה חשובים לתכנון פאנל באמצעות תגובות מבוססות TSA עבור דגימות רקמה קבועות פורמלין, משובצות פרפין (FFPE). זה כולל את המתודולוגיה לבדיקת רגישות לאחזור נוגדנים-אנטיגן, שיקול חשוב לתכנון פאנל IBEX בעת קביעת רצף התפתחות הנוגדנים. בנוסף, אנו מציגים גישות הדמיה במורד הזרם תוך שימוש בסורקי שקופיות שלמות הזמינים מסחרית וממחישים יישור וניתוח איכותיים באמצעות תוכנת פנוטיפ תאים זמינה מסחרית. באמצעות תיאורים מפורטים של מתודולוגיות אלה וסרטונים נלווים, אנו שואפים להדגיש את הרבגוניות והקלות של IBEX, ולהציע הדרכה מעשית למתקני ליבה פתולוגיים לשילוב IBEX בפלטפורמות הצביעה האוטומטיות הקיימות שלהם.

מבוא

הלבנה איטרטיבית מרחיבה את הריבוי (IBEX) היא התקדמות משמעותית באימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית רב-סיבובית מבוססת TSA רגישה ביותר, המאפשרת הדמיה מפורטת וכימות של ביומולקולות רבות בתוך דגימת רקמה אחת. על ידי שימוש במחזורים חוזרים ונשנים של הלבנה וצביעה מחדש, IBEX מאפשר בחינה של סביבות תאיות מורכבות בעומק ובהירות שאין שני להם, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה בתחום הצביעה החיסונית והדמיה מרובת ^1,2.

גופים אקדמיים, ממשלתיים ותעשייתיים רבים מארחים מתקני ליבה פתולוגיים המוקדשים לתמיכה במגוון רחב של מתודולוגיות מחקר מבוססות רקמות שמטרתן ליצור מערכי נתונים מורפומולקולריים איכותיים וכמותיים. ליבות אלו הן משאבים קריטיים, המספקות שירותים מיוחדים מבוססי רקמות המאפשרים למעבדות מחקר לבצע מיקור חוץ של תהליכי פתולוגיה מולקולרית מורכבים ועתירי עבודה ולהתייעץ ישירות עם פתולוגים בתכנון מחקר, פיתוח בדיקות ופרשנות נתונים. כדי להבטיח עקביות ולהפחית את השונות בין ניסויים, מתקני ליבה אלה מסתמכים באופן שגרתי על מכשירים אוטומטיים אוטומטיים זמינים מסחרית שנועדו לבצע פרוטוקולי צביעה סטנדרטיים עם שחזור ויעילות גבוהים³.

בעוד שצביעה אוטומטית הפכה לעמוד השדרה של צביעה חיסונית במתקני ליבה, ומאפשרת תפוקה גבוהה ותוצאות עקביות, הם עדיין לא הותאמו כדי להתאים להתקדמות עדכנית יותר כמו IBEX. יתר על כן, הצורך בידע מיוחד בתכנון פאנלים, במיוחד בעת שימוש בריאגנטים מבוססי הגברת אותות טירמיד (TSA)⁴, מוסיף שכבה נוספת של מורכבות, ומגביל את האימוץ הרחב יותר של IBEX בתהליכי עבודה מחקריים שגרתיים. כתוצאה מכך, חוקרים המעוניינים לנצל את יכולות ההדמיה המרובות ברזולוציה גבוהה של IBEX עשויים לעתים קרובות להיות מוגבלים על ידי הציוד הקיים של מתקני הליבה שלהם. פער זה בין טכניקות הדמיה חדשניות לבין המציאות המעשית של פעולות הליבה של המתקן מדגיש מחסום לאימוץ רחב יותר של IBEX במחקר אקדמי. עבודה זו נועדה לטפל במחסום זה על ידי הדגמת היישום המוצלח של IBEX על פלטפורמות אוטוסטיינרים נפוצות, תוך התמקדות בשימוש בריאגנטים מבוססי TSA באמצעות רקמות קבועות פורמלין, משובצות פרפין (FFPE). תחילה נדון בשלבים הדרושים לבניית פאנל IBEX באמצעות צבעים מבוססי TSA, וביישום הכיסוי של לוחות אלה על שני אוטו-צבעים שונים הזמינים מסחרית. יחד, זה מציע הדרכה מעשית לגבי בדיקת רגישות לאחזור נוגדנים-אנטיגן, דיון בשיקולים מרכזיים לאופטימיזציה של תכנון הפאנל, ומתן שיטה חלופית ליישור פאנלים באמצעות תוכנה מסחרית שעשויה להיות זמינה ודרך מעבדות ליבה לפתולוגיה.

פרוטוקול

1. בניית לוחות IBEX עם צבעים מבוססי TSA

הערה: השתמש תמיד בתכשיר טרי של נוגדנים וצבעים ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש.

1. בדיקת רגישות לאחזור אנטיגן
   1. הכנת שקופיות
      1. השתמש במיקרוטום כדי לאסוף שלושה חלקים סדרתיים עבור כל נוגדן כדי לבדוק מאותה רקמה משובצת FFPE על שלוש שקופיות נפרדות טעונות חיובית.
      2. שקופיות תווית עם הנוגדן לבדיקה, יחד עם מספר מחזורי אחזור האנטיגן לבדיקה: מחזור אחד, 3 מחזורים ו-6 מחזורים.
      3. יבש את השקופיות למשך הלילה בטמפרטורת החדר. אם עובדים עם סמני משטח בלבד, אופים שקופיות בחום של 60 ^{מעלות צלזיוס}למשך 20 דקות לפחות כדי לרכך את השעווה. אם עובדים עם סמנים גרעיניים, אופים את השקופיות בחום של 60 ^{מעלות צלזיוס}למשך הלילה.
   2. הכינו את התוכנית על ה-autostainer למספר המחזורים השונים, וודאו שיש שלושה שלבי כביסה בין כל שלב. ראה טבלה 1 לדוגמה פרוטוקולים לבדיקות מחזורים 1, 3 ו-6.
      הערה: עבור כל נוגדן בנפרד, הקפידו על זמן עקבי לשלב הנוגדן ולמריחת צבע TSA.
      עבור יישום צבע מבוסס TSA, חלופה לאפשר לצבע לשבת במשך 3-10 דקות בטמפרטורת החדר היא לאפשר לצבע לדגור במשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
   3. טען את הדגימות על הצביעה האוטומטית והפעל את הפרוטוקול עבור מספר המחזורים המשויך.
   4. חזור על תהליך זה משלבים 1.1.1 עד 1.1.3 עבור כל נוגדן בודד שיש לאמת ולהיבדק.
   5. הסר את השקופיות מהצביון האוטומטי והנח אותן ב-PBS.
   6. הרכיבו את השקופיות עם מדיית הרכבה מימית (זהה לסיבוב IBEX) וכיסוי #1.5 להדמיה אופטימלית.
   7. השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי לצלם את שקופית המחזור האחד עבור צבע TSA ו-DAPI, תוך ציון זמן החשיפה הדרוש להדמיית האות.
   8. חזור על כך עבור שקופיות 3 מחזורים ו-6 מחזורים, תוך ציון זמן החשיפה הדרוש כדי לדמיין את צבע ה-TSA.
   9. השווה זמני חשיפה בין מספרי המחזורים השונים. ראה איור 1 לדוגמאות. הקפידו על שלושה מחזורי כביסה בין כל השלבים.
      1. אם זמן החשיפה פוחת עם מחזורים מוגברים, הנח את הנוגדן והכתמים בשלב מאוחר יותר.
      2. אם זמן החשיפה גדל עם מחזורים מוגברים, מקם נוגדן זה בשלב מוקדם יותר.
      3. אם אין שינוי גדול בזמן החשיפה, הנח נוגדן זה בכל שלב.
      4. קבץ נוגדנים על סמך דרישות המחזור למעבר הראשוני בפאנלים של IBEX.
         הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, בצע אימות זה בכל הסמנים הרצויים עבור חלונית IBEX נתונה. בצע אימות זה בכל פעם שסוגי הרקמות משתנים או בעת עבודה עם נוגדנים ראשוניים רב-שבטיים עם מספרי אצווה ייחודיים.
2. דימום כתובת של אות מצבע סמוך ספקטרלית על ידי הערכת עוצמת האות.
   1. קבץ נוגדנים לפאנלים פוטנציאליים של IBEX על סמך המספר האופטימלי של מחזורי אחזור, כפי שנקבע לעיל לקבוצות של 1, 3 או 6 מחזורים.
   2. הכנת שקופיות
      1. השתמש במיקרוטום כדי ליצור מקטעים טוריים מדגימת FFPE, אחד לכל נוגדן לשימוש בפאנל IBEX יחיד.
      2. סמנו כל שקופית באחד מהנוגדנים שישמשו בחלונית IBEX.
      3. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. אם עובדים עם סמני משטח בלבד, הניחו לשקופיות לאפות בחום של 60 ^מעלותצלזיוס למשך 20 דקות לפחות כדי לרכך את השעווה. אם עובדים עם סמנים גרעיניים, הניחו לשקופיות לאפות בחום של 60 ^{מעלות צלזיוס}למשך הלילה.
   3. עבור קבוצת המחזורים 1, 3 ו-6, השתמש בהגדרת המחזור האחד מטבלה 1. הקפידו על שלוש כביסות בין כל השלבים
      1. שנה את הפרוטוקול עבור כל נוגדן שישמש עם זמן הצביעה האופטימלי.
      2. השתמש באותו זמן TSA עבור כל הנוגדנים.
   4. הכתים את הדגימות על הצביעה האוטומטית.
   5. הסר את הדגימות והנח את השקופיות ב-PBS.
   6. הרכיבו את השקופיות עם מדיית הרכבה מימית (זהה לסיבוב IBEX) וכיסוי #1.5 להדמיה אופטימלית.
   7. צלם את השקופיות במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי תוך שימוש בזמן חשיפה אופטימלי עבור כל תמונה.
   8. קבע את עוצמת האות. לשקופיות עם זמני חשיפה קצרים יש עוצמת אות גבוהה מאוד, בעוד שלשקופיות עם זמן חשיפה ארוך יש עוצמת אות נמוכה.
   9. השתמש בעוצמת האות יחד עם מספר המחזור כדי לפתח לוחות IBEX.
      1. קבץ נוגדנים על סמך מספר המחזור.
      2. עבור קבוצה נתונה של נוגדנים עם מספר מחזור ספציפי, ודא שאות חזק אינו קרוב אופטית לאות חלש כדי למזער את זליגת האות.
3. אמת את לוחות ה-IBEX הבודדים כדי להבטיח שכל פאנל יכול לייצר את התוצאה הרצויה.
   1. הכן את השקופיות.
      1. השתמש במיקרוטום כדי ליצור מקטעים טוריים, אחד לכל לוח IBEX מרובה, ותווית עם סדר הפאנל IBEX לשימוש.
      2. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. אם עובדים עם סמני משטח בלבד, הניחו לשקופיות לאפות בחום של 60 ^מעלותצלזיוס למשך 20 דקות לפחות כדי לרכך את השעווה. אם עובדים עם סמנים גרעיניים, הניחו לשקופיות לאפות בחום של 60 ^{מעלות צלזיוס}למשך הלילה.
   2. הגדר את הצביעה האוטומטית.
      1. עבור הפאנל הראשון, הגדר את תוכנית הצביעה האוטומטית ללא שלבי אחזור אנטיגן נוספים.
      2. עבור הפאנל השני, הציגו שלבי דנטורציה נוספים לפני הנוגדן הראשון השווים למספר שלבי הדנטורציה בפאנל הראשון. ראה טבלה 2 לדוגמא פאנל 1 עם חמישה נוגדנים, וטבלה 3 לדוגמא פאנל 2 עם ארבעה נוגדנים. הקפידו על שלושה שלבי כביסה בין כל השלבים.
      3. חזור על הפעולה לפי הצורך עבור לוחות IBEX נוספים, והוסף שלבי דנטורציה נוספים.
   3. הסר את השקופיות מהצביעה האוטומטית והנח אותן ב-PBS עד שהן מוכנות להרכבה.
   4. הרכיבו את השקופיות עם מדיית הרכבה מימית (זהה לסיבוב IBEX) וכיסוי #1.5 להדמיה אופטימלית.
   5. דמיין את השקופיות במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי תוך שימוש בזמן חשיפה אופטימלי עבור כל תמונה וכל צבע TSA.
   6. הערך אם כל החלוניות מוצגות כהלכה. אם כן, עברו להדמיית IBEX. אם לא, התייחס מחדש למחזורי איזון ואחזור אותות.
      הערה: ניתן לבצע התאמות מסוימות בתוך פאנל יחיד כדי לייעל את האות ולמנוע את "אפקט המטריה". כמה אותות בשפע מאוד יכולים לחסום צביעה של אותות במורד הזרם. הסתכלו בתוך פאנל נתון כדי להשתמש תחילה בכתמים דלילים יותר (ראו איור 2).

2. הסתגלות IBEX עם אוטוסטיינרים באמצעות ריאגנטים TSA ופלטפורמות הדמיית שקופיות שלמות (איור 3)

הערה: להשוואה בין שני הצבעים האוטומטיים המאומתים המשמשים ונדונים בפרוטוקול זה, ראה טבלה 4.

1. הכן את כל השקופיות להפעלת IBEX.
   1. השתמש במיקרוטום כדי ליצור מקטעי FFPE בשקופית טעונה חיובית. הקפד לכלול שקופית אחת לכל דגימת ניסוי, שקופיות בקרה חיוביות של קטעי רקמה הידועים כמכילים את האנטיגנים שיש לצלם, ושקופית בקרה שלילית שבה נעשה שימוש ב-PBS במקום כל הנוגדנים הראשוניים.
      הערה: אם עובדים בקבוצות, כלול דוגמת בקרת אצווה. דגימת בקרת אצווה היא בלוק רקמת FFPE יחיד שנחתך ונכלל בכל אצווה של דגימות ניסיוניות לשימוש בנורמליזציה ובקרה של שונות ניסויית בין קבוצות של דגימות צביעה. זה הכרחי רק אם לא כל הדגימות יעובדו יחד.
   2. הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. אם עובדים עם סמני משטח בלבד, הניחו לשקופיות לאפות בחום של 60 ^מעלותצלזיוס למשך 20 דקות לפחות כדי לרכך את השעווה. אם עובדים עם סמנים גרעיניים, הניחו לשקופיות לאפות בחום של 60 ^{מעלות צלזיוס}למשך הלילה.
2. הכן נוגדנים וצבעים עבור פאנל ה-IBEX הראשון שיצולם.
3. הגדר את תוכנית הצביעה האוטומטית. ראה טבלה 2 לדוגמא של לוח בעל 5 סמנים. הקפידו על שלוש כביסות בין כל שלב.
4. טען דגימות ונוגדנים לתוך הצביעה האוטומטית והפעל את התוכנית כדי להכתים את הדגימות.
5. הסר את השקופיות מהצביעה האוטומטית והחל כיסוי באמצעות מדיית הרכבה מימית המתאימה להדמיה מולטי-ספקטרלית וכיסוי #1.5.
6. דמיין את השקופיות תוך יומיים מרגע הצביעה
7. הדמיה פלואורסצנטית בסורק שקופיות אפיפלואורסצנטי או פלואורסצנטי
   1. החל מדגימת הבקרה החיובית המבוקרת היטב, טען את דגימת הבקרה החיובית למיקרוסקופ.
      1. אתר אות חיובי בדגימה עבור כל אחד מהאנטיגנים השונים שיש לצלם.
      2. הגדר את זמן החשיפה כדי להבטיח לכידת הטווח הדינמי של הכתם תוך מזעור הרקע על ידי התחלה בחשיפה נמוכה והגדלה הדרגתית של זמן החשיפה עד לנוכחות האות. עשו זאת עבור כל צבע בנפרד.
         הערה: בדוק את נוכחותם של ביטויים גבוהים ונמוכים של הסמנים כדי להבטיח לכידת הטווח הדינמי המלא.
   2. שמור את ההגדרות המשמשות עבור דגימת הבקרה החיובית והשתמש בהן עבור כל שלבי ההדמיה הנוספים.
   3. טען ודמיין את דגימת הבקרה השלילית ואת כל דגימות הניסוי באמצעות ההגדרות שנקבעו על ידי דגימת הבקרה החיובית.
   4. ודא שהתמונות באיכות אופטימלית לפני שתמשיך לשלבים הבאים.
8. הסרת כיסוי
   1. טבלו מגלשות בצנצנת קופלין עם מי DI. הנח את צנצנת קופלין באמבט מים המוגדר ל-65 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות כדי להקל על הסרה טבעית של הכיסוי. לחלופין, אם נעשה שימוש באמצעי הרכבה על בסיס מימי או שאמצעי ההרכבה התקשה לחלוטין, הסר את החלקות הכיסוי על ידי השרייה במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) או מי DI למשך הלילה כדי לאפשר לכיסויים ליפול באופן טבעי.
9. הלבנה עם LiBH₄
   1. במכסה אדים, הכינו תמיסה טרייה של LiBH₄ בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל במי DI. הכינו מספיק כדי לכסות כל דגימה פי 3.
      הערה: אין להכין יותר מ-10 מ"ל בכל פעם עקב התגובה של LiBH₄ עם מים. השתמש במי DI ולא במים Millipore/nanopure לפעילות הלבנה מיטבית.
   2. תן לתמיסה לנוח 20 דקות. ייווצרו בועות.
   3. פיפטה 1 מ"ל של תמיסת LiBH₄ על כל שקופית בתא מכתים במכסה אדים. הניחו לתמיסה לנוח על השקופית למשך 10-15 דקות.
   4. הסר את ה-LiBH₄ על ידי פיפטינג מהמגלשה והחלף ב-1 מ"ל טרי של LiBH_4. תן לתמיסה לנוח 10-15 דקות.
   5. הסר את ה-LiBH₄ על ידי פיפטינג מהמגלשה והחלף ב-1 מ"ל טרי של LiBH_4. תן לתמיסה לנוח 10-15 דקות.
   6. הסר את ה-LiBH₄ מהמגלשות על ידי פיפטינג וטבל את המגלשות במי DI או PBS לאחסון לטווח קצר (לא יותר מיום אחד).
   7. תוך יום, עברו לסבב הצביעה הבא של IBEX.
   8. אופציונלי: הרכבה רטובה מחליקה ובצע הדמיה מהירה על היקף אפיפלואורסצנטי כדי לוודא את הצלחת ההלבנה.
10. הרכבה רטובה של שקופית לתוך מכתים אוטומטי וריצת צביעה שנייה של IBEX
    1. הכן את כל הנוגדנים ותמיסות הצבע TSA עבור הצביעה האוטומטית.
    2. עבור ה-autostainer של Ventana:
       1. כאשר אתה מוכן להתחיל בצביעה אוטומטית, פיפטה כ-1 מ"ל של מאגר כביסה אוטומטי על המגלשה כדי למנוע התייבשות מהתושבת הרטובה.
       2. טען שקופיות רטובות לתוך הצביעה האוטומטית.
    3. עבור בונד Rx:
       1. הנח אריחי כיסוי על שקופיות.
       2. בחלק העליון של הכיסוי, פיפטה 300 מיקרוליטר של מאגר כביסה כדי לאפשר לתמיסה לזרום לחלל שבין הדגימה לכיסוי.
       3. טען דגימות על הצביעה האוטומטית.
    4. הגדר את תוכנית הצביעה האוטומטית לפי הדוגמה בטבלה 2 כאשר N מוגדר למספר הנוגדנים בפאנל.
    5. הסר את השקופיות מהצביעה האוטומטית והחל כיסוי באמצעות מדיית הרכבה מימית המתאימה להדמיה מולטי-ספקטרלית וכיסוי #1.5.
    6. דמיין את השקופיות תוך יומיים מרגע הצביעה בהתאם להליך לדוגמה המתואר בשלב 2.7 להגדרת הפעלת ההדמיה ואיסוף התמונות.
    7. לאחר ההדמיה, דגימות אקונומיקה כמתואר בשלבים 2.8-2.9.
11. חזור על הפעולה עבור כל חלוניות IBEX הרצויות.

3. ניתוח דוגמאות עם תוכנה זמינה מסחרית

1. השלם סריקות שקופיות שלמות של השקופיות המוכתמות לפני שתמשיך ליישור.
2. אם התוכנה מאפשרת, בצע ביטול ערבוב ספקטרלי באמצעות פונקציית הערבוב האוטומטית המובנית בפונקציות הסריקה, כולל הסרת ספקטרום האוטופלואורסצנטי. אם זו פונקציה של התוכנה שבה נעשה שימוש, בחר באפשרות ביטול הערבוב והפעל באמצעות הגדרות סטנדרטיות וצבעים מוגדרים מראש
   הערה: ניתן ליצור ביטול ערבוב מותאם אישית ברוב התוכנות המאפשר ביטול ערבוב. כדי ליצור ספרייה, קטעי רקמה בודדים מוכתמים בפלואורופור יחיד מתווספים למדידות התוכנה. אזור של רקמה לא מוכתמת או אוטו-פלואורסצנטית נסרק גם הוא כדי לאפיין את ספקטרום האוטופלואורסצנטי, וזה נבחר עם כלי האוטופלואורסצנטי. ספקטרום זה נאסף בתוך התוכנית על ידי לחיצה על "הכן תמונה" ולאחר מכן מיוצא לספריית ביטול ערבוב ספציפית לפרויקט. לאחר מכן, ספרייה זו נבחרת כספריית ביטול הערבוב באפשרות ביטול הערבוב.
3. ייבא את השקופיות הסרוקות לתוכנת ניתוח תמונות זמינה מסחרית לצורך יישור.
4. רישום שקופיות של מספר סבבי IBEX
   1. בחר שני איטרציות של סבבי IBEX להרשמה.
   2. לחץ לחיצה ימנית על השניים ובחר באפשרות הרשמה .
   3. בחר את רישום ברירת המחדל עם רישום ברזולוציה גבוהה עבור ניסיון ראשוני לרישום.
   4. לחלופין, בחר רישום ערוץ יחיד מהאפשרויות ובחר ערוץ יחיד שהיה עקבי בכל הפעלות IBEX.
      הערה: אפשרות זו שימושית לצבעים העמידים בפני הלבנה (ראה חומרים שעבורם צבעים אינם מלבינים).
5. יישור תמונה
   1. פתח אחת מהתמונות הרשומות.
   2. בכרטיסייה כלים , תחת רישום תמונה, בחר כלי רישום כדי לפתוח את כל התמונות הרשומות.
   3. בכרטיסייה כלי רישום , בחר את פונקציית ציון הדרך.
   4. השתמש בפונקציית ציון הדרך כדי לכוונן את היישור של שקופיות שלמות.
      1. סמן ציוני דרך בתמונת שקופית אחת באופן ידני.
      2. בתמונות האחרות של IBEX, סמן את אותו ציון דרך. התוכנית תחדד את היישור באמצעות ציון הדרך שזוהה. חזור על הפעולה לכוונון עדין של היישור.
   5. לאחר שתהיה מרוצה מהיישור, מזג את השקופיות באמצעות ה-Fuse | פונקציית כתם סדרתי.
   6. חזור על תהליך זה עם כל סבבי הדמיה נוספים של IBEX עד להשלמת קומפוזיציה סופית של כל התמונות.
6. ניתוח תמונה
   1. פילוח תאים
      1. תחת הכרטיסייה ניתוח , בחר ופתח את מודול HighPlex ולאחר מכן בחר את מודול הפנוטיפ לזיהוי תאים.
         1. טען את כל הסמנים והתחל במציאת כל הגרעינים באמצעות הכרטיסייה גילוי גרעיני במודול הייפלקס . טען סמנים בכרטיסייה Dye Selection . זיהוי תאים באמצעות צביעת DAPI.
         2. בכרטיסייה ניתוח , הפעל את כלי הכוונון בזמן אמת באמצעות הפרמטרים העיקריים הבאים: עוצמה גרעינית מינימלית מוגדרת לסינון אות רקע; בהירות תמונה מקסימלית מוגדרת לשליטה בנראות האות הכוללת; סגמנטציה גרעינית אגרסיביות שנועדה לחדד את גבולות הגרעינים שזוהו.
         3. כוונן כל פרמטר בקפידה כדי להבטיח פילוח מדויק.
   2. זהה את הציטופלזמה וסמני הממברנה.
      1. נווט אל הכרטיסייה זיהוי ממברנה וציטופלזמה .
      2. הגדר את רדיוס הציטופלזמה המינימלי לערך המתאים לדגימה לגודל הצפוי של התאים.
      3. תחת האפשרות Membrane Paints , ציין אילו תעלות הן סמני ממברנה.
         הערה: זה אמור לגרום לפילוח טוב יותר של תאים בודדים להמשך ניתוח.
   3. סף סמן והקצאת פנוטיפ
      1. עבור כל סמן, הגדר את הסף לאותות חיוביים לעומת שליליים. בצע זאת תחת הכרטיסיות שנוצרו עבור כל סמן.
      2. בצע את הסף הידני עבור כל סמן כדי לזהות אוכלוסיות.
      3. לחלופין, השתמש בגישה אוטומטית מבוססת ביואינפורמטיקה לסף. בתפריט המתקדם | אחסן נתוני אובייקט (תא), העבר את האפשרות ל-True. בייצוא | נתוני אובייקט, ייצא את ערכת הנתונים כדי לקבל מידע על ביטוי סמן עבור כל תא מזוהה.
      4. ייבא נתונים אלה לתוכנה נוספת לניתוח נוסף ומותאם אישית. אפשרויות לתוכנה לניתוח נוסף נמצאות בטבלה 5.

תוצאות

אנו מספקים דוגמה לפאנל IBEX המשתמש בריאגנטים מבוססי TSA על Autostainer 2 (איור 4). ניתן לתחום בבירור כל סמן, ויש דימום מינימלי בין הסמנים. התמונה נאספה על פני שני סבבים של צביעה. הדגימה היא רקמת ריאה בעקבות זיהום ב-Mycobacterium tuberculosis. שני לוחות הצביעה של IBEX יושרו באמצעות תוכנה לדוגמה זמינה מסחרית. באמצעות גישת IBEX עם ריאגנטים TSA אופטימליים (כפי שמתואר כאן), ניתן לראות ולהעריך את הארגון המרחבי של תאי חיסון, סמנים דלקתיים ותאי ריאה מיוחדים. אופטימיזציה נכונה מאפשרת לסמנים להופיע בקלות עם רקע מינימלי.

איור 1: בדיקת אחזור אנטיגן עם פלואורופור עם פליטה של 520 ננומטר של שני אנטיגנים שונים. RAGE ו-CD3e צולמו תוך ניצול זמני חשיפה משומרים. האפיטופ של נוגדן RAGE זה רגיש מאוד ורגיש לאחזור אנטיגן חוזר עם ירידה מהירה ברגישות הבדיקה עם אחזור אנטיגן לאחר מכן. לעומת זאת, רגישות בדיקת CD3e משתפרת עם סבבים מרובים של אחזור אנטיגן. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: RAGE = קולטן לתוצרי קצה מתקדמים של גליקציה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמה לחשיבות של פיתוח רצף ביחס לאפקט המטריה. RAGE הוא סמן בעל ביטוי גבוה בתאי AT1, ובשילוב עם CD31, חוסם ביעילות את התגובתיות החיסונית של SARS-CoV-2. עם זאת, כאשר SARS-CoV-2 IHC מבוצע תחילה, ניתן לדמיין את כל האותות. פסי קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: RAGE = קולטן לתוצרי קצה מתקדמים של גליקציה; AT1 = מכתשית סוג 1; SARS-CoV-2 = תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2; IHC = אימונוהיסטוכימיה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סקירה כללית של התהליך באמצעות ציוד צביעה אוטומטי עבור פרוטוקול IBEX. הרכבה רטובה לסיבוב 2 ומעלה של תהליך הצביעה כדי למנוע התייבשות של רקמות. קיצור: IBEX = הלבנה איטרטיבית מרחיבה את הריבוי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: דוגמה של IBEX עם צבעים מבוססי TSA מ-autostainer 2 על ריאה נגועה ב-Mycobacterium tuberculosis. פאנל 1 מכיל את כל הצבעים, ופאנל 2 מכיל צבעים שהיו ניתנים להלבנה. מוצגת תמונה ממוזגת של כל הערוצים על פני ה-IBEX המלא של תמונת הריאה. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: IBEX = הלבנה איטרטיבית מרחיבה את הריבוי; TSA = הגברת אות טירמיד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פרוטוקול לדוגמה לאימות השפעות מספר המחזור על נוגדנים עבור בדיקות 1, 3 ו-6 מחזורים. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: פאנל 1 לדוגמה עם חמישה נוגדנים עבור הצביעה האוטומטית IBEX לאימות פאנל. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 3: פאנל 2 לדוגמה עם ארבעה נוגדנים עבור הצביעה האוטומטית IBEX לאימות פאנל. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 4: השוואה בין שני מכתימים אוטומטיים. טבלה המסכמת את היתרונות והחסרונות של ה-Ventana Autostainer וה-Bond Rx. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 5: סיכום תוכנה לניתוח תמונה. טבלה המסכמת כמה מגישות הניתוח וכלי התוכנה הזמינים לניתוח תמונות לאחר הפילוח. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

דיון

כאן, אנו מספקים שיקולים להתאמת פרוטוקול IBEX למתקני ליבה פתולוגיים עם יישום ציוד צביעה אוטומטי ואופטימיזציה של ריאגנטים מבוססי TSA בפרוטוקול IBEX. אנו מדגימים כיצד לבצע אופטימיזציה מיטבית לסבבים החוזרים ונשנים של אחזור אנטיגן וטעינה נכונה בסבב 2 ומעלה על הציוד האוטומטי. בנוסף, אנו מדגימים שיטה נוספת לביצוע יישור באמצעות תוכנת Halo שעשויה להיות זמינה במתקני ליבה. גישות אלו הוכחו כשימושיות בקביעת ההבדלים בסביבות הריאות ברקמת פרימטים לא אנושית בעקבות זיהומי SARS-CoV-2⁵.

מרכיב מרכזי בעבודה זו הוא הדגשת הצורך באופטימיזציה נרחבת של עיצוב פאנל IBEX לפני צביעת רקמות ניסוי. בפרט, עם השימוש בריאגנטים מבוססי TSA, יש לקחת בחשבון כמה שיקולים שלא נראו בשיטות הבסיס של IBEX. הראשון הוא ההשפעה של סבבים מרובים של אחזור אנטיגן על רגישות הנוגדנים. עם ריאגנטים מבוססי TSA, לכל פיתוח נוגדנים חדש קדם דנטורציה של נוגדנים. זוגות נוגדנים/אנטיגנים מסוימים יהיו רגישים לסבבים נוספים של אחזור אנטיגן ולהפחית את רגישות הבדיקה, בעוד שחלקם ישיגו רגישות משופרת עם דנטורציה/אחזור אנטיגן חוזר ונשנה. בדיקה קפדנית של כל נוגדן ברקמת המטרה לפני תכנון הפאנלים חשובה כדי להבטיח שיטות צביעה מיטביות וליידע את סדר הרצף הן של הנוגדנים והן של הצבעים הפלואורסצנטיים. חוצצים, כולל מבוססי ציטראט (pH 6.0) ומבוססי Tris-EDTA (pH 9.0), נבדקים עבור כל הנוגדנים כדי לקבוע את תנאי אחזור האנטיגן האופטימליים. זה כרוך בהערכה שיטתית של כל מאגר כדי לזהות איזה מהם ממקסם את החשיפה לאנטיגן עבור נוגדן נתון. בנוסף, טמפרטורה (למשל, 20-37 מעלות צלזיוס), זמן הדגירה (בדרך כלל 30-60 דקות) ותנאי חסימה מותאמים להפחתת כתמי רקע לא ספציפיים ולהבטיח קשירה ספציפית של הנוגדנים הראשוניים והמשניים, במידת הצורך. חסימה לפני הנוגדנים הראשוניים והמשניים עשויה לכלול שימוש בריאגנטים חוסמים זמינים מסחרית כדי להסביר אוטופלואורסצנציה ספציפית לרקמה או אינטראקציות לא ספציפיות. שיקולים חשובים אחרים שיש לייעל לפני סיום פאנלים של IBEX כוללים את אפקט המטריה, שבו מיגון האפיטופים יכול להתרחש אם הסדר אינו מותאם לשאלת המחקר הספציפית שנשאלת⁶. כדי למנוע דימום פלואורסצנטי, אופייני לשים מטרות אנטיגן בעלות ביטוי גבוה יותר לתעלות אדומות רחוקות שיש להן הכי פחות דימום וסמנים חלשים יותר בטווח של 480-520 ננומטר, שיהיה להם יחס האות לרעש הטוב ביותר בהתחשב בכך שצבעי הפלואורסצנט הללו הם הבהירים ביותר⁷. עם זאת, יש להקפיד על דגימות רקמה אוטו-פלואורסצנטיות מאוד שעשויות להיות הבהירות ביותר בטווח זה; אנו ממליצים לטפל בבעיה זו על ידי הדמיית רקמות ללא צבעים כדי לטפל ברמות פוטנציאליות של אוטופלואורסנס. יחד, שלבי אופטימיזציה אלה, הננקטים עם כל האופטימיזציה והבקרות הרגילות הנעשות בדרך כלל עם IBEX, יכולים ליידע על תכנון פאנל נכון עבור IBEX עם ריאגנטים TSA.

בשיטה זו הדגמנו את השימוש בשני אוטוסטיינרים נפוצים. עם זאת, ניתן ליישם גישות אלו גם בשיטות אחרות של אוטוסטיינרים. החלק העיקרי כאן הוא הסרה אופטימלית של כיסויים והעומס הרטוב לסבבי מכתים נוספים. בנוסף, איננו מציינים הגדרת מיקרוסקופ ספציפית. למרות שערכות עשויות להמליץ על שימוש במערכות הדמיה מסוימות לסריקת שקופיות אופטימלית, כל הגדרת מיקרוסקופ, במיוחד מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם קוביות סינון תואמות ומקור אור LED רחב ספקטרום, אמור לעבוד. צבעים מסוימים דורשים גלאים מולטי-ספקטרליים או קוביות סינון מיוחדות, שאולי לא יהיו זמינות בכל המעבדות ויכולות להוות אתגרים בשימוש עם קוביות סינון סטנדרטיות בשל החפיפה הספקטרלית שלהן. צבעים אלה מופרדים טוב יותר באמצעות מערכות הדמיה מולטי-ספקטרליות או מסננים ספציפיים ביותר. חלק מהפלואורופורים נופלים מחוץ לטווח המסננים האדומים הרחוקים הקונבנציונליים (בדרך כלל ~700 ננומטר) ודורשים קוביית סינון או גלאי מיוחדים המסוגלים ללכוד אותות אינפרא אדום קרובים. מיקרוסקופים מיוחדים בנויים עם מסננים אלה, אך קיימות חלופות. אלה ידרשו אופטימיזציה נוספת כדי לקבוע כיצד הצבעים מתפקדים בתצורת מיקרוסקופ נתונה.

ביטול ערבוב מולטי-ספקטרלי מומלץ מאוד עבור IHC פלואורסצנטי מרובה, במיוחד כאשר עובדים עם רקמות המועדות לאוטופלואורסצנטיות, מכיוון שהוא מפריד ביעילות בין האות האמיתי לרעשי רקע. אוטופלואורסצנטיות, שלעתים קרובות חופפת לספקטרום הפליטה של פלואורופורים נפוצים (במיוחד בערוצים באורכי גל באנרגיה גבוהה יותר), יכולה לטשטש או להפריע לאותות ספציפיים, ולהפחית את הדיוק. פירוק ספקטרלי מתמטי מנתק ספקטרום פליטה חופף, מבודד אותות פלואורסצנטיים אמיתיים תוך "ניקוי" אוטו-פלואורסצנציה לא רצויה. ביטול ערבוב ספקטרלי הוא בעל ערך מיוחד בתהליכי עבודה של IBEX, שבהם השגת האותות הנקיים ביותר האפשריים היא קריטית בשל האופי האיטרטיבי של תהליך הצביעה וההדמיה. ב-IBEX, אותות מסבבי צביעה מרובים מצולמים, מולבנים ונערמים זה על גבי זה כדי ליצור תמונה מורכבת. כל אוטופלואורסצנטיות או דימום שנותרים לא פתורים בסיבוב אחד יכולים להתפשט דרך התמונות המוערמות, לסבך את הניתוח במורד הזרם ולהפחית את הביטחון בלוקליזציה של הסמן. ביטול ערבוב ספקטרלי מבודד ביעילות אותות פלואורסצנטיים אמיתיים מאוטופלואורסצנטיות ברקע, ומבטיח זיהוי אותות נקי ומדויק יותר בכל סיבוב בודד. בהירות אות זו חיונית ליצירת תמונות מורכבות אמינות שבהן סמנים מרובים מנותחים יחד על פני סיבובים, מה שמאפשר פנוטיפ בטוח וניתוח מרחבי. לפלטפורמת ההדמיה המשמשת לפרוטוקול זה יש יכולות ניתוק ערבוב מובנות, אך יש צורך באפשרויות ביטול ערבוב נוספות לתאימות עם פלטפורמות הדמיה פלואורסצנטיות אחרות עם שקופיות שלמות.

בנוסף, מגבלה של עבודה זו היא האופי הקנייני של האוטוסטיינרים, שכן הריאגנטים ומאגרי הכביסה הקשורים אליהם מותאמים למערכות אלה, אך התכשירים הספציפיים נותרים עלומים. יתר על כן, התמקדנו אך ורק בתוכנה אחת לניתוח תמונות זמינה מסחרית לניתוח תמונות שקופיות שלמות ומכירים בכך שעלות רישיונות התוכנה עשויה להוות מחסום פיננסי עבור מעבדות מסוימות. תוכנת ניתוח נוספת ^8,9 ואפשרויות ב-R נראות מבטיחות; בפרט, קבוצת Bodenmiller¹⁰, שיצרה ערכת חבילות שנראית אופטימלית עבור ליבות, בכך ש-IMCDataAnalysis¹¹ מיועד לזרימת עבודה הניתנת לשחזור על ניתוח תמונה מרובה במורד הזרם ב-R. עם זאת, יש צורך במאמצים עתידיים לפתח ולאפיין חלופות נגישות וחסכוניות לניתוח IBEX שלם כדי להבטיח אימוץ רחב יותר במסגרות מוגבלות במשאבים. יתר על כן, גישה זו עם השימוש ב-autostainers עבור IBEX יכולה להיות מותאמת לצביעה מסורתית יותר ב-IBEX, כולל עם נוגדנים ראשוניים מצומדים פלואורסצנטיים, או עם נוגדנים משניים סטנדרטיים ללא צבעים מבוססי TSA אם הרקמה איכותית מספיק וזמן קיבוע אופטימלי כדי לאפשר אות טוב.

בסך הכל, אנו מקווים שעבודה זו תסייע ביישום של IHC פלואורסצנטי מולטיפלקס מבוסס TSA תוך שימוש שגרתי בציוד ליבה של מתקן פתולוגיה כדי להתאים את IBEX באופן נרחב יותר לסביבות אלה. סוג זה של יישום באמת מדגיש את הרבגוניות של פרוטוקול IBEX ומדגים את התועלת שלו אפילו בדגימות רקמה קשות או בגישות אצווה גדולות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכות TSA של Alexa Reagent לכתמים	תרמופישר		צבעי TSA חלופיים אם מסנני מיקרוסקופ אופל אינם זמינים. אלה כוללים את Alexa Fluor 488 (ערוץ כחול/ירוק), Alexa Fluor 555 או 568 (ערוץ אדום), Alexa Fluor 647 (ערוץ אדום רחוק), Alexa Fluor 750 (קרוב לאינפרא-אדום, אם מצויד במסננים מתאימים).
נוגדן Arg1	איתות סלולרי	93668	שימש באיור 4 ב-1:100
להבי חומר	Leica Biosystems		או דומה, פרופיל גבוה או נמוך תלוי בסוג הרקמה
נוגדנים CD11b	אבקאם	AB133357	שימש באיור 4 ב-1:2000
נוגדן CD163	אבקאם	ab182422	שימש באיור 4 ב-1:500
נוגדנים CD31	איתות סלולרי	77699S	שימש באיור 2 ב-1:100
נוגדנים CD3e	דאקו	A045201-2	משמש באיור 1 ב-1:100
צנצנת Tool Coplin	פישר סיינטיפיק	01-816-21	או משהו דומה
Material Coverslips	VWR	v48393-026	או משהו דומה
נוגדן CX3CR1	אבקאם	AB308613	בשימוש באיור 4 ב-1:450
Stain DAPI	אקויה	FP1490
תוכנה<בר/> פיג'י			משמש למדידת עוצמת האות
Slide Fisher Superfront Slides	פישר סיינטיפיק	22-037-246	או משהו דומה
Software HALO	אינדיקה לאבס		דוגמה לתוכנות ניתוח תמונות מסחריות. משמש ליישור וניתוח תמונות.
נוגדנים Iba1	איתות סלולרי	17191	משמש באיור 4 ב-1:800
Software inForm	אקויה		משמש למדידת עוצמת האות
נוגדנים iNOS	אבקאם	AB283655	בשימוש באיור 4 ב-1:400
Instrument לייקה בונד Rx (או RXm)	Leica Biosystems	21.2201	בטקסט נקרא "אוטוסטיינר 1". ודאו שכל התגובות הנלווות זמינות גם כן, כולל קופסאות צביעה ותמיסות בתפזורת.
Reagent LiBH4	סיגמא-אלדריץ'	62460-5G-F	להישאר בסביבה ללא מים
Instrument מנטרה סנאפ	אקויה		נדרש מיקרוסקופ ריח רב-ספקטרלי כדי לזהות את הצבעים. דוגמה למיקרוסקופ שניתן להשתמש בו לזיהוי צבעי אופל.
Tool Microtome	Leica Biosystems		או משהו דומה עם אביזרים מועדפים כמו מברשות
תגובת צביעה ערכת Opal IHC 480	אקויה	FP1500001KT	בשימוש באיור 4
תגובת צביעה ערכת פלקס Opal IHC 6-plex	אקויה	NEL821001KT	520 ו-620 אינם מבהירים, כפי שנעשה שימוש באיורים 1, 2 ו-4
תגובת כתמים ערכת Opal IHC 780	אקויה	FP1501001KT	בשימוש באיור 4
תנור Tool	מיליפור סיגמא	Z683329	או משהו דומה, אפשר גם לעשות על אוטוסטיינר
נוגדן פנסיטוקרטין	אבקאם	ab9377	בשימוש באיור 4 ב-1:50
Reagent PBS (אופציונלי)	פישר סיינטיפיק	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	אקויה		דימות שקופית שלמה רב-ספקטרלית עם פירוק ספקטרלי מובנה כלול בתוכנה
Reagent ProLong Gold Antifade	פישר סיינטיפיק	P36961	או מדיה מימית דומה
נוגדן ProSP-C n-terminal (ProSPC)	ביוריאג'נטים של שבעת הגבעות	WRAB-9337	שימש באיור 4 ב-1:250
נוגדנים RAGE	R& D	MAB1179	שימש באיור 1 ו-2 ב-1:50
בופר תגובה Reagent	רוש	NC1895692	לשימוש עם Ventana Autostainer
נוגדנים SARS-CoV-2-N	איתות סלולרי	68344	שימש באיור 2 ב-1:1000
סלייד<בר/> TOMO עם מיקרוסקופ CC הידבק - WH	אבנטיק	SKUSL6519-1	אם היצמדות לרקמה היא דאגה
Instrument ונטנה דיסקברי אולטרה	רוש		בטקסט מכונה "אוטוסטיינר 2". ודאו שכל התגובות הנלווות זמינות גם כן, כולל קופסאות צביעה ותמיסות בתפזורת.
בופר שטיפה Reagent	Leica Biosystems	AR9590	לשימוש עם אוטוסטיינר Leica Bond
ריאגנט<בר/> מים	פישר סיינטיפיק	15-230-147	DI הוא הטוב ביותר, לא מיליפור
Tool אמבט מים	Leica Biosystems	140607020C1	או משהו דומה