Method Article

שימוש בספריות ראייה ממוחשבת לייעול כימות הגרעינים

DOI:

10.3791/67945

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Metabolic Health & Muscle Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University, 2Applied Exercise Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטות צעד-אחר-צעד לאוטומציה של כימות גרעינים מבוססי תמונה באמצעות תוכנית הפעלה בקוד פתוח המאומתת על פני מגוון צפיפויות תאים. תוכנית זו מספקת אלטרנטיבה המטפלת בחסמים הקשורים לעלות, נגישות למשתמשים בעלי כישורים טכנולוגיים מוגבלים ואימות ספציפי ליישום שעלול להגביל את התועלת של טכנולוגיות קיימות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני תאים חיים וניתוחי תאים מבוססי תמונה דורשים נורמליזציה של נתונים לפרשנות מדויקת. שיטה נפוצה היא צביעה וכימות גרעינים, ולאחר מכן נורמליזציה של נתונים לספירת גרעינים. ספירת גרעינים זו מתבטאת לעתים קרובות כספירת תאים עבור תאים חד-גרעיניים. בעוד שכימות ידני יכול להיות מייגע וגוזל זמן, שיטות אוטומטיות זמינות עשויות שלא להיות מועדפות על ידי כל המשתמשים, עשויות להיות חסרות אימות עבור יישום ספציפי זה, או עשויות להיות חסכוניות. כאן, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב ללכידת תמונות ניתנות לכימות של גרעינים מוכתמים בכתמי DNA פלואורסצנטיים ולאחר מכן לכימות הגרעינים באמצעות תוכנת ספירת אובייקטים אוטומטית שפותחה באמצעות ספריות ראייה ממוחשבת של Python. אנו גם מאמתים תוכנית זו על פני מגוון צפיפויות תאים. למרות שהזמן המדויק לביצוע התוכנית משתנה בהתאם למספר התמונות וחומרת המחשב, תוכנית זו מאחדת שעות עבודה בספירת גרעינים לשניות להפעלת התוכנית. בעוד שפרוטוקול זה פותח באמצעות תמונות של תאים קבועים ומוכתמים, ניתן לכמת גם תמונות של גרעינים מוכתמים בתאים חיים ויישומי אימונופלואורסצנציה באמצעות תוכנה זו. בסופו של דבר, תוכנית זו מספקת אפשרות שאינה דורשת רמה גבוהה של מיומנות טכנולוגית ומהווה חלופה מאומתת בקוד פתוח כדי לסייע לביולוגים תאיים ומולקולריים לייעל את זרימות העבודה שלהם, תוך אוטומציה של המשימה המייגעת וגוזלת הזמן של כימות גרעינים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים פונקציונליים ומבוססי תמונה הם קריטיים להבנת ההשפעות של טיפולים ניסיוניים על ביוכימיה ופיזיולוגיה של תאים שלמים. פרשנות תקפה של נתונים מניסויים בביולוגיה של התא תלויה בדיוק וביכולת השחזור של פרוטוקול הניסוי, כולל נורמליזציה של נתונים. לדוגמה, ניתוחים של צריכת חמצן ושיעורי החמצה חוץ-תאית בתאים חיים בנקודת ההתחלה ולאחר טיפול בתרופות ספציפיות מאפשרים הערכה של היבטים שונים של חילוף חומרים אנרגטי 1,2. מדידת פעילותם של אנזימים כגון לקטט דהידרוגנאז בסופרנטנט של תרביות תאים יכולה לסייע בכימות שלמות קרום התא3. צביעת תאים מתורבתים עם נספח V ופרופידיום יודי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ניתן למצוא קבצים משלימים בקישור הבא https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. צילום ושמירת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. הכן דגימות תאים או רקמות להדמיה, כולל צביעה בצבע DNA רצוי. כדי להשיג את התמונות המשמשות כאן, מיובלסטים C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) גודלו בצלחות של 6 בארות במשך 48-72 שעות בתנאי תרבית סטנדרטיים (5% CO2, 37 מעלות צלזיוס, לחות), עם או בלי 50 מ"מ EtOH6, וקובעו במתנול קר כקרח כפי שתואר קודם לכן13. תאים קבועים הותקנו באמצעות מדיוםהרכבה 15 המכיל DAPI ויובשו בחושך לפני הה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ריצת תמונת אצווה מייצרת: 1) קבוצה של קבצי תמונה עם קווי מתאר מוחלים המציגים את קווי המתאר של גרעינים מזוהים (איור 5), ו-2) קובץ .csv (גיליון אלקטרוני) המקשר בין שמות קבצי תמונה והספירות המשויכות. צפייה בקווי המתאר תאפשר למשתמש להעריך חזותית את איכות הספירה. באופן ספציפי, תמונות המתקבלות על פי סעיף 1 צריכות להכיל את כל הגרעינים (או כמעט את כולם) מוקפים בקו ירוק מוצק המציין שהגרעין נספר על ידי התוכנית. קווי המתאר האלה שימשו לכוונון התוכנית כאן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לתוכנית כימות הגרעינים שלנו יש מספר יתרונות על פני האפשרויות הקיימות: היא דורשת מיומנויות טכנולוגיות מינימליות בלבד, מאומתת למשימה הספציפית של כימות גרעינים והיא קוד פתוח; האחרון מתגבר על חסמים הקשורים לעלות. בסופו של דבר, תוכנית זו מספקת לביולוגים תאיים ומולקולריים אפשרות נוספת לכמת במהירות ובדייקנות גרעינים בתמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תוכניות ספירת גרעינים או תאים אוטומטיות הזמינות כיום אינן מועדפות על ידי כל המשתמשים, חלקן יקרות, והאימות עשוי להיות מינימלי או נעדר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המימון לעבודה זו ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי להזדקנות (R01AG084597; DEL ו-HYL) ועל ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת טקסס טק (DEL). המחברים רוצים להודות לחוקרי המחקר לתואר ראשון של אוניברסיטת טקסס טק ולתוכניות TrUE Scholars על מתן תמיכה כספית לחוקרים לתואר ראשון שתרמו לעבודה זו (REH, MRD, CJM, AKW). אנו מודים גם לד"ר לורן ס. גולהון ומייקל פ. מאסט על שיתוף אדיב בשטח המעבדה ובציוד שלהם.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מחשב עם גישה לקובץ תוצאות משיטה 2 או 3-ראה שלב 2.6 (לשיטה 2) או שלב 3.3.9 או 3.4.9 (לשיטה 3)
מחשב עם גישה לאינטרנט, דפדפן מודרני-למשל, מחשב Google Chrome
עם גישה לאינטרנט, דפדפן מודרני ומערכת הפעלה Windowsמשתנהמשתנהעבור Mac, Linux או מערכת הפעלה אחרת, השתמש בשיטה 3
מחשב עם תוכנה ללכידת תמונותZeissAxioVisionתוכנה אחרת מקובלת; חייבת להיות תואמת למיקרוסקופ הקרינה
מיקום קובץ לפלט (גיליון אלקטרוני של תוצאות וקווי מתאר תמונה)-יכוללהיות תיקייה חדשה וריקה
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeissAxiovert 200Mמיקרוסקופים פלואורסצנטיים אחרים מקובלים; חייב להיות מצויד בקוביות סינון מתאימות, מטרה רצויה ומצלמה  
תיקיה המכילה את כל התמונות שיש לכמת-ראה שלב 1.12
Python גרסה 3.10 ומעלהPython-זמין להורדה והתקנה בחינם ב-https://www.python.org/downloads/ 
דגימות להדמיה-קבועות או חיות, מוכתמות או מוכתמות בצבעי DNA פלואורסצנטיים
תוכנת גיליון אלקטרוניMicrosoftExcelתוכנת גיליון אלקטרוני דומה מקובלת גם היא

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chacko, B. K., et al. The bioenergetic health index: A new concept in mitochondrial translational research. Clin Sci. 127 (6), 367-373 (2014).
  2. Desousa, B. R., et al. Calculation of ATP production rates using the Seahorse XF Analyzer. EMBO Rep....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nuclei QuantificationComputer VisionAutomated Object CountingFluorescent DNA StainsImage Based Cell AnalysisData NormalizationPython Computer VisionCell AssaysOpen Source WorkflowCell Count

Related Articles