מאמר שיטה

הפרדה ואפיון דיפרנציאלי של שלפוחיות חוץ-תאיות של חיידקי מעיים בחולדות רגישות למלח בתנאי תזונה עתירי מלח

DOI:

10.3791/68279

⸱

6 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Pathology Department, Suining Central Hospital, 3School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy, Affiliated Sport Hospital of CDSU, 5Department of Neck, Shoulder, Waist, and Leg Pain, Sichuan Province Orthopedic Hospital, 6Neijiang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר בידוד של EVs מיקרוביאליים במעיים מחולדות רגישות למלח המוזנות ב-HSD באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות. EVs אופיינו במעקב אחר ננו-חלקיקים, מבחני TEM, LPS/BCA וריצוף 16S rRNA כדי לנתח את הגודל, המורפולוגיה, ההרכב ומקור המיקרוביוטה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צריכת מלח גבוהה היא גורם סיכון עיקרי ליתר לחץ דם, והמנגנון הבסיסי שלו עשוי להיות קשור קשר הדוק לשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המופרשות על ידי מיקרוביוטת המעיים. EVs אלה, המיוצרים על ידי מיקרוביוטת המעיים, נושאים רכיבים ביו-אקטיביים שונים שעשויים למלא תפקיד מכריע בהתפתחות יתר לחץ דם הנגרם על ידי תזונה עתירת מלח (HSD). כדי לחקור את המנגנון הזה, פיתחנו שיטת מיצוי יעילה המבוססת על צנטריפוגה של שיפוע צפיפות כדי לבודד EVs ממיקרוביוטת המעיים של חולדות רגישות למלח שניזונו מ-HSD. באמצעות ניתוח גודל חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) וזיהוי ליפופוליסכריד (LPS), זיהינו את התפלגות השיפוע של EVs של מיקרוביוטת המעיים והשגנו מיצוי מדויק. יתר על כן, ריצוף גנים 16S rRNA שימש לניתוח המקור וההבדלים בהרכב של EVs בין הקבוצה הנורמלית לקבוצת HSD, וחשף את ההשפעה של צריכת מלח גבוהה על המאפיינים הגנטיים של EVs של מיקרוביוטת המעיים. מחקר זה מספק כלים חשובים ותובנות מדעיות לגבי מנגנוני המיקרוביוטה של המעיים העומדים בבסיס יתר לחץ דם המושרה על ידי מלח ומציע נקודות מבט חדשות למניעה וטיפול במחלות קשורות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוביוטת המעיים, הידועה גם בשם מיקרוביוטת המעיים או מיקרואקולוגיה של המעיים, היא קומפלקס של עשרות אלפי מיקרואורגניזמים הממוקמים במערכת העיכול הביולוגית וממלאת תפקיד מכריע בשמירה על בריאות האדם1. בשנים האחרונות, עם מחקר נוסף, נמצא כי מיקרוביוטת המעיים יכולה לייצר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs)2. EVs הם שלפוחיות קטנות המשתחררות על ידי תאים, הנושאות מולקולות שונות בתא, כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים 3,4. הם יכולים לקיים אינטראקציה עם חיידקים אחרים5, תאי אפיתל במעי ואפילו רקמות ואיברים מרוחקים6, ובכך להשפיע על בריאות גוף האדם 7,8. קיים קשר הדוק בין ה-EVs המיוצרים על ידי מיקרוביוטת המעיים הללו לבין דיאטה9.

EVs המיוצרים על ידי מיקרוביוטת המעיים עשויים להיות גורמים משמעותיים שדרכם תזונה עתירת מלח (HSD) משפיעה על בריאות הגוף. HSD לא רק משבש באופן ישיר את האיזון של חיידקי המעיים10, מה שמוביל להפחתה משמעותית במספר החיידקים המועילים (כגון לקטובצילוס)11, אלא גם מקדם התפשטות של חיידקים מזיקים (כגון בקטרואידים וכו').12. חוסר איזון זה מפחית את תפקוד מחסום המעי ומגביר את הסיכון לדלקת מעיים. בנוסף, HSD משפיע עוד יותר על איזון החומצה-בסיס וספיגת החומרים המזינים במעי על ידי שינוי הפעילויות המטבוליות13 של מיקרוביוטת המעי, כגון הפחתת ייצור חומצות שומן קצרות שרשרת 14,15 עם פונקציות פיזיולוגיות מרובות.

שינויים אלה לא רק משפיעים על בריאות המעיים אלא גם עשויים לווסת בעקיפין את הייצור והשחרור של רכבים חשמליים ולשנות את הרכב ותפקוד ה-EV. סביבת המלח הגבוהה עלולה להשפיע על התפקודים הפיזיולוגיים הרגילים של תאי המעי, כולל שחרור והובלה של EVs, ובכך להפריע לתפקידם של EVs בהעברת מידע בין-תאי ובוויסות חיסוני. יחד עם זאת, דלקת מעיים עלולה לקדם מגוון EVs בעלי פונקציות מיוחדות16 ולהתפשט לכל הגוף דרך ציר המעי-איבר ודרכים אחרות17,18, הקשור קשר הדוק להתרחשות והתפתחות יתר לחץ דם19,20, לב וכלי דם21 ומחלות כלי דם במוח22,23, השמנת יתר24,25, סוכרת26 ומחלות כרוניות אחרות.

לכן, המטרה הכוללת של מחקר זה הייתה לפתח שיטה יעילה ואמינה לחלץ EVs ממיקרוביוטת המעיים של חולדות רגישות למלח שניזונו מ-HSD ולחקור באופן שיטתי את התכונות הפיזיקליות, ההרכב והתפקודים שלהן. בשל המאפיינים של העלייה המשמעותית בלחץ הדם לאחר דיאטה עתירת מלח, נבחרו חולדות רגישות למלח וחשפו את השפעת HSD על חיידקי המעיים EV על ידי בניית שיטת מיצוי יעילה. השיטה התבססה על צנטריפוגה של שיפוע צפיפות ושילבה טכניקות זיהוי דינמיות שונות כגון זיהוי גודל חלקיקים, מדידת LPS/BCA, מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה וניתוח פרוטאומי. הפרוטוקול נועד לחשוף את ההשפעות של HSD על מיקרוביוטת המעיים EV והמנגנונים שלה במחלות לב וכלי דם. עם היעילות הגבוהה, יכולת השחזור והיישום הרחב שלה, גישה זו לא רק מספקת כלי חשוב לחקר המנגנון של חיידקי המעיים EVs ביתר לחץ דם המושרה על ידי מלח, אלא גם מניחה את הבסיס התיאורטי לפיתוח אסטרטגיות התערבות במחלות המבוססות על EVs. באמצעות מחקר זה, אנו מקווים לפתוח אפיקים חדשים למניעה וטיפול במחלות לב וכלי דם, כגון יתר לחץ דם27,28.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר ניסיוני זה בבעלי חיים עומד בהנחיות האתיות הרלוונטיות ובתקנים הבינלאומיים. מחקרים הכוללים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת חיות מעבדה ואתיקה של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית (מוסד: אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית; מספר פרוטוקול: 2018-21).

1. הכנת בעלי חיים ומשטר תזונה

  1. התאקלמות חולדות דאהל זכרות בנות 6 שבועות רגישות למלח, משקל גוף 180-200 גרם, על ידי גידול ב-50% ±-10% לחות; מחזור אור של 12 שעות / 12 שעות; 20.0 ±-2.0 מעלות צלזיוס למשך שבוע בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים.
  2. לאחר מכן, חלקו את החולדות באופן שווה לשתי קבוצות (n = 6). ספקו לכל קבוצה תזונה שונה שנמשכת 6 שבועות: דיאטת מלח רגילה (NSD) עם 0.5% נתרן כלורי ו-HSD עם 8% נתרן כלורי, שנמצא בשימוש נפוץ במחקרים שפורסמו 29,30,31. לעכברים הייתה גישה בלתי מוגבלת למזון ומים לאורך כל המחקר.

2. ניטור לחץ דם

הערה: פלתיסמוגרפיה של שרוול הזנב שימשה כשיטה לא פולשנית למדידת לחץ דם, ונעשה שימוש ברישום לחץ נפחי (VPR) כאשר לחץ הדם נמדד מנפח הדם של הזנב.

  1. הניחו חולדות בנפרד בכלובים קטנים עם נסורת, מחוממים למשך 10 דקות בטמפרטורה של כ-37 מעלות צלזיוס והניחו בריסון מכרסמים מותאם אישית עם אף ודלת מתכווננים לכניסת בעלי חיים. הניחו חולדות על כרית חימום במצב נוטה כדי לשמור על טמפרטורת גופן על 37 מעלות צלזיוס.
  2. חבר את חיישן ה-VPR לתחתית הזנב והגדר לפחות 10 מחזורי הסתגלות כדי לייצב את ה-BP28.
    1. מלאו את השרוול המתנפח בשורש הזנב והניחו את החיישן הפלתיסמוגרפי (או החיישן הפוטואלקטרי) מתחת. יש לנפח לאט ללחץ מעל הלחץ הסיסטולי (בדרך כלל 200 מ"מ כספית) ולאחר מכן לשחרר לאט. המכשיר מזהה אוטומטית את ערך הלחץ של היעלמות גלי הדופק (לחץ דם סיסטולי) והתאוששות (לחץ דם דיאסטולי). מדוד 3-5 פעמים רצופות וקח את הערך הממוצע.
  3. אמן את כל החולדות להתאים את נוהל הריסון ובצע מחקר זה במעבדה שקטה בסביבות השעה 9 בבוקר כדי למזער את ההשפעות של השונות הצירקדית.
  4. מדדו לחץ דם סיסטולי (SBP) ולחץ דם דיאסטולי (DBP) כל יומיים לפני ההקרבה. הערכת לחץ עורקי ממוצע (MAP) מ-SBP ו-DBP
    MAP = (SBP + 2 DBP)/3

3. חילוץ רכבים חשמליים

  1. איסוף דוגמאות
    1. טבלו צמר גפן סטרילי באלכוהול 75% והשתמשו בו כדי לעורר את פי הטבעת של החולדה. הגירוי נועד לקדם תנועתיות מעיים ולהרגיע את הסוגר האנאלי, ובכך לקדם את עשיית הצרכים. לאחר הוצאת הצואה, אספו אותם בעזרת מלקחיים סטריליים למיכלים סטריליים בגודל מתאים ואחסנו אותם מיד בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת מדגם
    1. בעזרת כף מעבירים 5 גרם צואה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל שנשקל מראש. הוסף 50 מ"ל של PBS נטול אנדוטוקסין 37 מעלות צלזיוס מחומם מראש (ריכוז דגימה מקסימלי 10%) לצינור וסובב למשך 30 דקות. מצננים את הצנטריפוגה המהירה ל-4 מעלות צלזיוס.
    2. צנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 15 דקות לאחר הנחת דגימות באופן סימטרי כדי לאפשר לצנטריפוגה להתאזן. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והעבירו אותו לצינור צנטריפוגה סטרילי חדש.
    3. שוב צנטריפוגה ב 8,000 x גרם למשך 15 דקות. שאפו את הסופרנטנט והשתמשו בו לניתוח נוסף.
  3. הכנת תמצית גולמית
    1. השתמש ביחידת פילטר סטרילית של 0.22 מיקרומטר. הנח את יחידת המסנן על קרח והחזק את משאבת הוואקום בחוזקה. העבירו את הסופרנטנט שהתקבל לראש המסנן. הפעל את משאבת הוואקום כדי לאסוף את הדגימות המסוננות.
    2. מעבירים את המסנן למסנן צנטריפוגלי (10 kDa, 15 מ"ל), צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 3,000 x גרם למשך 30 דקות, ומרכזים את הדגימה ל-1400 מיקרוליטר לפחות.
    3. אסוף את הדגימה המרוכזת ובמידת הצורך דלל אותה ל -1400 מיקרוליטר באמצעות PBS נטול אנדוטוקסינים מקורר מראש. שמור את הדגימה על קרח מיד לאחר הדילול.
      הערה: ניתן להשתמש בתמצית הגולמית באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
  4. הפרדת רכבים חשמליים
    1. הכן את מאגר השיפוע A ואת מאגר השיפוע B כמתואר להלן. הכן את המאגר יום מראש, מכיוון שלוקח מספר שעות עד שהתרכובת מתמוססת לחלוטין. ניתן לאחסן את המאגר המוכן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
      1. הכנת מאגר שיפוע A: ממיסים 0.25 M סוכרוז, 6 מ"מ EDTA ו-60 מ"מ טריס ב-800 מ"ל של מים נטולי אנדוטוקסין על ידי ערבוב מערבל מגנטי, כאשר ה-pH מותאם ל-7.4 באמצעות חומצה הידרוכלורית. יש לדלל ל-1 ליטר במים ללא אנדוטוקסין. השתמש במסנן בקבוק של 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את המאגר.
      2. הכנת מאגר שיפוע B: ממיסים 0.25 M סוכרוז, 1 מ"מ EDTA ו-10 מ"מ טריס ב-800 מ"ל של מים נטולי אנדוטוקסין על ידי ערבוב מערבל מגנטי, עם pH מותאם ל-7.4 עם חומצה הידרוכלורית. מדולל ל-1 ליטר במים ללא אנדוטוקסין. השתמש במסנן עליון של בקבוק 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את המאגר.
    2. מערבבים נפח אחד של מאגר שיפוע A ו-5 נפחים של מדיום שיפוע צפיפות (המדיום הוא תמיסת יודיקסנול של 60%) כדי להכין את תמיסת העבודה.
    3. הכנת תמיסת יודיקסנול (10%, 20%, 40%): להכנת תמיסת יודיקסנול של 10%, מערבבים תמיסת עבודה אחת יחידה ו-4 יחידות מאגר B; לתמיסת יודיקסנול של 20%, מערבבים תמיסת עבודה של 2 יחידות ומאגר B של 3 יחידות; לקבלת תמיסת יודיקסנול של 40%, מערבבים 4 יחידות תמיסת עבודה ומאגר יחידה אחת B. מכינים כל תמיסה טרייה ומאחסנים על קרח.
      הערה: יש להכין פתרונות עבודה חדשים לכל ניסוי, וניתן להכין נפח נוסף של 10% של פתרונות כדי להסביר את שגיאת הניסוי.
    4. מערבבים את התמיסה שהוכנה בשלב 3.3.3 עם 7 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות ליצירת תמיסת יודיקסנול של 50%.
    5. כדי להכין שיפוע צפיפות, הוסף תמיסת טריפאן כחולה לתמיסה של 40% ותמיסת יודיקסנול של 10% (wt/vol) כדי לספק מתאר ברור בין השכבות המובהקות.
    6. העבירו 8 מ"ל של תמיסת יודיקסנול של 50% לתחתית צינור הצנטריפוגה מפוליפרופילן בעל דופן דקה. הטה את הצינור ל-70° והעביר 8 מ"ל של תמיסת יודיקסנול של 40% למשטח הנוזל. הוסף 8 מ"ל של תמיסת יודיקסנול של 20%, לאחר מכן 7 מ"ל של תמיסת יודיקסנול של 10%, ולבסוף 2 מ"ל של PBS ללא אנדוטוקסין.
      הערה: הכנת שיפוע צפיפות דורשת תרגול. לאיכות שיפוע הצפיפות יש השפעה רבה על תוצאות הניסוי. אל תניח את הצינור זקוף בין שלבים שונים בתהליך ההוספה, מכיוון שהדבר משפיע לרעה על איכות שיפוע הצפיפות.
    7. מצננים מראש את הצנטריפוגה ומניחים את שיפוע הצפיפות המוכן לתוך האולטרה-צנטריפוגה. פרמטרי קלט להתחלה, ערכי פרמטרים: 100,000 x גרם, 20 שעות, 10 מעלות צלזיוס.
    8. להפרדת צפיפות שיפוע ידנית, משוך לאט 2 מ"ל מהתמיסה ממרכז פני המערכת המכילה בסך הכל 34 מ"ל נוזל. כל 2 מ"ל הוא שיפוע, ובכך מחלק את פתרון שיפוע הצפיפות ל-17 שיפועים.
    9. העבירו את שברי הצפיפות לצינור דגימה סטרילי באמצעות פיפטה והניחו אותם מיד על קרח. מהדק את צינור הצנטריפוגה בין האגודל לאצבע המורה כדי להבטיח שהוא יישאר זקוף.
  5. שחזור רכבים חשמליים
    1. באמצעות מערכת חילוץ EVs אוטומטית לחלוטין המפעילה תנודת לחץ שלילי באמצעות מערכת תנודה אולטראסונית עם צימוד כפול על שבב האולטרה-סינון, הסר זיהומי חומצות גרעין וחלבונים בדגימה דרך הננו-נקבוביות ויירוט EVs, מה שמוביל להעשרה וטיהור של EVs.
      1. הסר את המסנן בשלב 3.4.7 והוסף אותו לשבב האולטרה-סינון.
      2. הפעל את המכשיר בהתאם להוראות המכשיר ואסוף את המסנן המסונן, כלומר התמיסה המועשרת באקסוזום. התהליך העיקרי מוצג באיור 1.

4. זיהוי רכבים חשמליים

  1. זיהוי גודל חלקיקים וריכוז
    1. הערך את התפלגות הגודל ופוטנציאל הזטה באמצעות מונה ננוקולומטר מבוסס חישת דופק התנגדות (RPS). בחר שבבי ננו-נקבוביות עם טווח מדידה של 60-200 ננומטר לניסוי זה. יתר על כן, הערך את התפלגות גודל החלקיקים ופוטנציאל הזטה של ה-EVs באמצעות מונה ננו-ספריות.
      1. קח כמות מתאימה של תמיסת EVs ודלל אותה (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. דילולים שונים של פתרונות EVs הונחו על המכשיר לבדיקה.
      3. מכפיל הדילול עם יציבות טובה יותר נבחר ונבדק שוב כדי לקבל נתונים מדויקים יותר.
  2. בדיקת LPS ו-BCA
    1. בדיקת BCA: ליז EVs באמצעות מאגר RIPA ולאחר מכן להפריד את החלבונים. קבע את תכולת החלבון של ה-EVs באמצעות ערכת קביעת ריכוז החלבון BCA.
    2. בדיקת LPS: באמצעות ערכת זיהוי האנדוטוקסין, הוסף דגימות, גלאי אנדוטוקסין וכרומוגני בהתאם לשלבי הערכה. מדוד את הספיגה ב-545 ננומטר וחשב את ביטוי ה-LPS של שלפוחיות חיצוניות לפי העקומה הסטנדרטית.
  3. הערכת TEM: לצביעה שלילית וניתוח TEM, יש למרוח דגימות על סורג נחושת זוהר המצופה בסרט פחמן רציף ולצבוע בפורמט אורניל של 0.75%. עבור cryo-EM, ספגו את הרכבים החשמליים לרשת פחמן EM של 300 רשת עם משטח הידרופילי והקפיאו בחנקן נוזלי. התבונן ונתח את הרשתות באמצעות Cryo-TEM והקלט את התמונות ב-22,000 הגדלות32.
  4. אפיון חלבונים: Lyse EVs באמצעות מאגר RIPA ולאחר מכן מפרידים את החלבונים. קבע את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת החלבון BCA, הפרד כמויות שוות של חלבון מכל דגימה על ידי SDS-PAGE, וצבוע בתמיסת צבע כחול של Coomassie לאחר אלקטרופורזה כדי להמחיש את פרופילי החלבון33,34.
  5. ריצוף וניתוח S: חלץ DNA גנומי מדגימות הצואה באמצעות ערכת מיצוי DNA צואתית. להעריך את שלמות וריכוז ה- DNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וספקטרופוטומטר. הגבירו את אזור V3 - V4 של הגן 16S rRNA עם פריימרים אוניברסליים, טהרו את תוצרי ה-PCR, כמתו אותם ורצפו אותם על פלטפורמת Illumina. בצע ניתוח נתונים באמצעות צינור QIIME235.
    1. סווג וריאנטים של רצף אמפליקון (ASV) באמצעות DADA2 והתאם מול מסד הנתונים של Silva באמצעות אלגוריתם VSEARCH. השתמש בניתוח α-מגוון כדי להעריך את העושר והמגוון של המינים בתוך המדגמים, בעיקר באמצעות מדדים כגון מדד שאנון ומדד Chao1. ניתוח β-Diversity משווה את הרכב הקהילה המיקרוביאלית בין דגימות ובדרך כלל מומחש על ידי ניתוח קואורדינטות ראשי (PCoA). השתמש בשיטות ניתוח דיפרנציאליות, כגון גודל אפקט ניתוח מבחין ליניארי (LEfSe) וניתוח עלילת הר געש, כדי לזהות טקסונים מיקרוביאליים עם תנאים שונים באופן משמעותי או בין קבוצות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריכוזי EVs נקבעו בשברים שונים (איור 2A). תוצאות הניסוי הראו שריכוז ה-EVs הציג דפוס התפלגות נורמלי טיפוסי בסדרה של פתרונות שיפוע צפיפות (איור 2B). באופן ספציפי, בשבר 9, ריכוז הרכבים החשמליים הגיע לנקודה הגבוהה ביותר שלו (3.85 x 109), מה שמצביע על כך שחלק ההפצה העיקרי של רכבים חשמליים עשוי להיות 936.

לקביעת תכולת החלבון, ערכות BCA שימשו להערכת תכולת החלבון בשברים שונים (איור 2C

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, התמקדנו במיקרוביוטת המעיים EVs בחולדות רגישות למלח ב-HSD והשגנו סדרה של הישגים מרכזיים. ראשית, שיטת מיצוי יעילה המבוססת על צנטריפוגה של שיפוע צפיפות נבנתה בהצלחה כדי לבודד EVs ממיקרוביוטת מעיים של חולדות רגישה למלח ב-HSD, ורוב הרכיבים שאינם EV בודדו באמצעות מניפולציה ניסויית קפדנית וסטנדרטית של בעלי חיים ותהליך עיבוד דגימות. שיטת מיצוי הרכבים החשמליים של צנטריפוגת שיפוע צפיפות יעילה ביותר וניתנת לשחזור, טובה יותר משיטת האולטרה-צנטריפוגה הקונבנציונלית, ויכולה לשמור טוב יותר על ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי לא ידוע על אינטרסים פיננסיים מתחרים או קשרים אישיים שיכולים היו להשפיע על העבודה המדווחת במאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82205240), הקרן למדעי הטבע של מחוז סצ'ואן (2025ZNSFSC1836), והפרויקט הבסיסי הקליני של בית החולים האורתופדי המחוזי של סצ'ואן (PY202414).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>אספקה חיונית
10nkDa 2 מ"ל)צנטריפוגה MilliporeUFC903096
Tude(50 מ"ל)BKMAN
TudesBECKMAN COULTERZ30815SCA
מערכת סינון ואקוםBiosharp24902581
<חזק>ריאגנטים
כרומוגניים ערכת בדיקת אנדוטוקסין LALBeyotime022124240705
Coomassie Blue תמיסת צביעה מהירהBeyotimeZ972241010
EDTADamas-betaP3117308
ערכת בדיקת חלבון BCA משופרתBeyotimeA006241112
אתנולKESH
HCl
OptiPrep (60% משקל/נפח, יודיקסאנול)Serumwerk00124
PBSLabshark130114005
חומצה פוספוטונגסטיתRUIXIN
סוכרוזDamas-betaP1917057
Tris (VWR)Damas-betaP3061764
תמיסת צביעה כחולה טריפן (0.4%)BeyotimeBD07242904
<חזק>ציוד
ספיגה קורא מיקרופלייטSpectraMaxABP01690
ביומיקרוסקופמוטיקBA210
דיגיטלית CenceCHT210R
שולחן עבודה מיקרו צנטריפוגה במהירות גבוההDLABD3024
רוטור אלומיניום בזווית קבועה + 500 מ"ל צנטריפוגליתCence
איזון אלקטרוני דיוק גבוהSKRBN-200
ארון זרימה למינאריNantong Hunan Scientific Instrument Co., Ltd.SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti סיבוב דלי נדנדה + SW 32.1 דלי רוטור TiBECKMAN COULTER
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורJEOLJEM-1400FLASH
מסובב
אולטרה-צנטריפוגהBECKMAN COULTEROptima XE-100
מערכת מים טהורים במיוחדULPHWUPR-II-15TNZ
משאבת ואקום רב תכליתית מיםQiang QiangSHZ-D(III)
(צנטריפוגה 20220404 צנטריפוגה שולחנית צינור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  2. Aschtgen, M. S., et al. Rotation of Vibrio fischeri Flagella Produces Outer Membrane Vesicles That Induce Host Development. J Bacteriol. 198 (16), 2156-2165 (2016).
  3. Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling. Cell Comm Signal. 19 (1), 47(2021).
  4. Avila-Calderón, E. D., et al. Outer Membrane Vesicles of Gram-Negative Bacteria: An Outlook on Biogenesis. Front Microbiol. 12, 557902(2021).
  5. Melo-Marques, I., Cardoso, S. M., Empadinhas, N. Bacterial extracellular vesicles at the interface of gut microbiota and immunity. Gut Microbes. 16 (1), 2396494(2024).
  6. Kim, N. Y., et al. Effect of gut microbiota-derived metabolites and extracellular vesicles on neurodegenerative disease in a gut-brain axis chip. Nano Converg. 11 (1), 7(2024).
  7. Ahmadi Badi, S., et al. Microbiota-Derived Extracellular Vesicles as New Systemic Regulators. Front Microbiol. 8, 1610(2017).
  8. Barathan, M., Ng, S. L., Lokanathan, Y., Ng, M. H., Law, J. X. The Profound Influence of Gut Microbiome and Extracellular Vesicles on Animal Health and Disease. Int J Mol Sci. 25 (7), 4024(2024).
  9. Maukonen, J., Saarela, M. Human gut microbiota: does diet matter. Proc Nutri Soc. 74 (1), 23-36 (2015).
  10. Bier, A., et al. A High Salt Diet Modulates the Gut Microbiota and Short Chain Fatty Acids Production in a Salt-Sensitive Hypertension Rat Model. Nutrients. 10 (9), 1154(2018).
  11. Aghamohammad, S., et al. Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of Lactobacillus spp. as a preservative and therapeutic agent for IBD control. Immun Inflamm Dis. 10 (6), e635(2022).
  12. Dong, Z., et al. The Effects of High-Salt Gastric Intake on the Composition of the Intestinal Microbiota in Wistar Rats. Med Sci Monit. 26, e922160(2020).
  13. Yan, X., et al. Intestinal Flora Modulates Blood Pressure by Regulating the Synthesis of Intestinal-Derived Corticosterone in High Salt-Induced Hypertension. Circ Res. 126 (7), 839-853 (2020).
  14. Wang, X., Lang, F., Liu, D. High-Salt Diet and Intestinal Microbiota: Influence on Cardiovascular Disease and Inflammatory Bowel Disease. Biology. 13 (9), 674(2024).
  15. Qi, L., et al. Microbiome-metabolome analysis insight into the effects of high-salt diet on hemorheological functions in SD rats. Front Nutri. 11, 1408778(2024).
  16. Wu, Q., et al. Insights into the unique roles of extracellular vesicles for gut health modulation: Mechanisms, challenges, and perspectives. Curr Res Microb Sci. 7, 100301(2024).
  17. Zhang, H., et al. Effects of bacterial extracellular vesicles derived from oral and gastrointestinal pathogens on systemic diseases. Microbiol Res. 285, 127788(2024).
  18. Wang, H. X., Wang, Y. P. Gut Microbiota-brain Axis. Chinese Med J. 129 (19), 2373-2380 (2016).
  19. Huang, S., et al. A cross-tissue transcriptome association study identifies key genes in essential hypertension. Front Genet. 14, 1114174(2023).
  20. Gao, H., et al. Microbial DNA Enrichment Promotes Adrenomedullary Inflammation, Catecholamine Secretion, and Hypertension in Obese Mice. J Am Heart Assoc. 11 (4), e024561(2022).
  21. Chen, P. Gut Microbiota and Pathogenesis of Organ Injury. , Springer. Singapore. (2020).
  22. Xie, N., et al. hPSCs-derived brain organoids for disease modeling, toxicity testing and drug evaluation. Exp Neurol. 385, 115110(2024).
  23. Liu, N., et al. The underlying mechanisms of DNA methylation in high salt memory in hypertensive vascular disease. Sci Rep. 14 (1), 925(2024).
  24. Li, M., et al. Wheat β-glucan reduces obesity and hyperlipidemia in mice with high-fat and high-salt diet by regulating intestinal flora. Int J Biol Macromol. 288, 138754(2024).
  25. Kerem, G., et al. Small intestinal microbiota composition altered in obesity-T2DM mice with high salt fed. Sci Rep. 13 (1), 8256(2023).
  26. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. J Physiol Biochem. 78 (2), 485-499 (2022).
  27. Wu, S., et al. Liuzijue training improves hypertension and modulates gut microbiota profile. Front Cardiovasc Med. 10, 1075084(2023).
  28. Qi, L. M., et al. Salvia miltiorrhiza bunge extract improves the Th17/Treg imbalance and modulates gut microbiota of hypertensive rats induced by high-salt diet. J Funct Foods. 117, 106211(2024).
  29. Wilck, N., et al. Salt-responsive gut commensal modulates T(H)17 axis and disease. Nature. 551 (7682), 585-589 (2017).
  30. Jiang, X., et al. Intestinal Gastrin/CCKBR (Cholecystokinin B Receptor) Ameliorates Salt-Sensitive Hypertension by Inhibiting Intestinal Na(+)/H(+) Exchanger 3 Activity Through a PKC (Protein Kinase C)-Mediated NHERF1 and NHERF2 Pathway. Hypertension. 79 (8), 1668-1679 (2022).
  31. Zheng, T., et al. Hypertension of liver-yang hyperactivity syndrome induced by a high salt diet by altering components of the gut microbiota associated with the glutamate/GABA-glutamine cycle. Front Nutr. 9, 964273(2022).
  32. Mulligan, S. K., et al. Multiplexed TEM Specimen Preparation and Analysis of Plasmonic Nanoparticles. Microsc Microanal. 21 (4), 1017-1025 (2015).
  33. Olson, B. Assays for Determination of Protein Concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A.3a.1-a.3a.32 (2016).
  34. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of Protein Molecular Weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  35. Sanschagrin, S., Yergeau, E. Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons. J Vis Exp. (90), e51709(2014).
  36. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nat Protoc. 15 (1), 40-67 (2020).
  37. Ruhal, R., Kataria, R. Biofilm patterns in gram-positive and gram-negative bacteria. Microbiol Res. 251, 126829(2021).
  38. Maldonado, R. F., Sá-Correia, I., Valvano, M. A. Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection. FEMS Microbio Rev. 40 (4), 480-493 (2016).
  39. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  40. Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
  41. Huang, J., et al. Extracellular vesicles as a novel mediator of interkingdom communication. Cytokine Growth Factor Rev. 73, 173-184 (2023).
  42. Li, W., et al. Alleviation of colitis by honeysuckle MIR2911 via direct regulation of gut microbiota. J Control Release. 376, 123-137 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gut Microbial VesiclesExtracellular VesiclesDensity Gradient CentrifugationHigh Salt DietSalt Sensitive RatsTransmission Electron MicroscopyNanoparticle TrackingLipopolysaccharide Detection16S rRNA SequencingHypertension Mechanism

מאמרים קשורים