מאמר שיטה

יצירת תרביות משותפות של ספרואידים אפיתליים-פיברובלסטים אנושיים רגילים צפים בחופשיות

DOI:

10.3791/68440

⸱

3 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cell Biology (Cancer Research), Medical Faculty, University of Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט ומעשי מאוד אך אמין לגידול משותף ספרואידלי ישיר של תאי אפיתל ריאה אנושיים ופיברובלסטים מבלי להסתמך על מטריצה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות תרבית תלת מימדיות (תלת מימד) הפכו פופולריות יותר ויותר בשל יכולתן לשחזר תכונות וארכיטקטורות תאים טבעיות, ובכך לחקות מבנים דמויי רקמה במבחנה. בין מודלים אלה, תרבית של אגרגטים של תאים כדוריים (מה שנקרא ספרואידים) המוטמעים במטריצה חוץ-תאית חצי מוצקה (ECM) מייצגת מודל מתקדם של תרבית תאים קרובה לגוף , מכיוון שהיא מאפשרת מצבי תא פונקציונליים שונים כתוצאה מאינטראקציות תא-תא ותא-ECM, כמו גם שיפועי חמצן וחומרים מזינים. מכיוון שספרואידים הם פחות תובעניים מבחינה טכנית וזולים יחסית להשגה, הם משמשים לעתים קרובות בבדיקת תרופות ובדיקות רעילות, מה שמאפשר סינון בעל תכולה גבוהה לבדיקת תרופות חדשות בשלב הפרה-קליני. לשם כך נוצרים בעיקר מבנים תלת מימדיים של גידולים שונים. יחד עם זאת, מטריג'ל הוא כיום אחד ה-ECM הנפוצים ביותר ונחשב לסטנדרט הזהב בגידול ספרואידים ואורגנואידים, אם כי מדובר במטריצה תלת מימדית המבוססת על ניסויים בעכברים, שהפקתה - כמו ניסויים בבעלי חיים באופן כללי - קשורה לחששות אתיים גדולים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נטול מטריצה לגידול משותף ספרואידלי ישיר של תאי אפיתל ופיברובלסטים אנושיים, שיכול להיחשב כשיטת גידול משותף אופטימלית, במיוחד בכל הנוגע לתקשורת אפיתל-פיברובלסטים ואינטראקציות בתוך הספרואידים המתאימים, מבלי להסתמך על מטריצת נשא (מבוססת בעלי חיים). על ידי הקמת תרביות ספרואידים אפיתליות-פיברובלסטואידיות צפות חופשיות אלה כפלטפורמה מוכוונת מטופל במבחנה למודל רעילות רקמות נורמליות (ריאות) של גישות טיפוליות בסרטן, ניתן להשיג לא רק הפחתה במספר חיות הניסוי אלא גם החלפה הולמת ומשמעותית של ניסויים מקבילים בבעלי חיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרביות תאים דו-ממדיות (2D), שבהן תאים חד-שכבתיים שטוחים מתורבתים, מורחבים ולאחר מכן מצופים לבדיקות מחקר מבוססות תאים, נותרו שיטה קלה, נוחה, חסכונית ונמצאת בשימוש נרחב עבור הליכי סינון פרה-קליניים סטנדרטיים 1,2. כדי לחקור את הדיבור האינטראקטיבי (פרקריני) בין סוגים שונים של תאים במבחנה, ניתן להשתמש במדיום מותנה מסוג תא אחד לגירוי מסוג תא אחר. בנוסף, הופיעו שיטות שונות של תרבית משותפת, למשל, שיטות עקיפות, כאשר תאים בתרבית משותפת מופרדים פיזית באמצעות ממברנה מיקרו-נקבובית. 'מערכות Transwell' אלה כוללות תוספת (הממברנה המיקרו-נקבובית) המונחת בצלחת תרבית תאים דו-ממדית מסורתית. לאחר מכן סוג תא אחד נזרע וגדל על הממברנה, חולק את אותה מדיה כמו הסוג השני הגדל על באר הלוויה, ובכך מאפשר תקשורת פרקרינית דו-כיוונית2. שני סוגי התאים עשויים אפילו להיזרע משני צידי הממברנה, וליצור יותר תרבית משותפת של מגע ישיר בין תא לתא, המתאימה לחקירת רקמות מובנות מחסום 3,4.

עם זאת, התגובות התאיות של מערכות תרבית תאים דו-ממדיות מתקדמות אלה לא תמיד משקפות את תוצאות הניסויים המקבילים בבעלי חיים ואפילו מחקרים קליניים, מה שנובע בין היתר מהיעדר איתות ישיר בין סוגי התאים השונים ולכן היעדר ארגונים תאיים דמויי invivo. לכן, מערכות תרבית תלת מימדיות (תלת מימד) הפכו פופולריות יותר ויותר בגלל היכולות של מאפייני תאים דמויי טבע וארכיטקטורות המחקות מבנים דמויי רקמה במבחנה 5,6. בין מודלים אלה, תרבית של אגרגטים של תאים כדוריים, המכונים ספרואידים, המוטמעים במטריצות חוץ-תאיות מוצקות למחצה מספקים מודל תרבית משותפת מתקדם יותר של תאים שבו ניתן להשיג מצבים תאיים פונקציונליים שונים בעקבות אינטראקציות תא-תא ותא-ECM כמו גם שיפועים של חמצן ותזונה7. אלה רצויים תרביות תלת מימד מורכבות יותר ב-vivo דמויות מבחנה צריכות להיווצר ולשמור על הומוגניות לגבי גדלי הרכבת התאים תוך קידום התפתחות והתמיינות תאים, תוך היותן יעילות, מהירות, עקביות ונוחות 7,8.

באמצעות המאפיינים הטבעיים של צבירה עצמית והדבקה, ספרואידים (בעיקר ספרואידים של גידול) נוצרים בדרך כלל באמצעות טכניקת הטיפה התלויה 9,10. כאחת הטכניקות הראשונות המשמשות ליצירת גופים עובריים, בדיקת הטיפה התלויה הפכה לשיטה בשימוש נרחב ליצירת ספרואידים הומוגניים רבים המבוססים על עקרונות הכבידה ומתח הפנים לפני הטמעת ECM באמצעות Matrigel, 'תקן הזהב' של מטריצות חוץ-תאיות, אם כי מבוססת עכבר. נעשה מאמץ ניכר ליצור ספרואידים בגישות נטולות פיגומים 8,11. לדוגמה, ניתן לייצר ספרואידים באמצעות בקבוק תרבית תאים עם מערבל, ובכך למנוע זריעת תאים, השיטה הפשוטה ביותר לייצור ספרואידים בקנה מידה גדול12.

הדבר הקשה ביותר ביצירת תרביות תאים מורכבות ובכך בהקמת מערכת בעלת ערך פיזיולוגי כמו חלופות חוץ גופיות במעבדה הם פרוטוקולים מורכבים עם שלבים רבים ושונים (שעדיין צריך לבסס). לדוגמה, יצירת מבנים תאיים תחילה באמצעות שיטה, קצירתם, ולאחר מכן הטמעתם במטריצה, במיוחד שימוש במטריצות שאינן קלות לטיפול, הם צעדים קריטיים הדורשים שכנוע רב יותר לפני שניתן יהיה להשתמש בשיטה באופן שגרתי וסדרתי. כאן השתמשנו בלוחית הצמדה נמוכה במיוחד בפורמט של 96 בארות, המאפשרת כמעט שום חיבור תאים לכלי התרבית להקמת ספרואידים תלת מימדיים מורכבים של תאי אפיתל ריאה ופיברובלסטים. הספרואידים המתקבלים נוצרים אחידים מאוד ומהירים למדי תוך 24 שעות, מה שמקצר את ציר הזמן של הניסוי. טיפוח ממושך ובכך גידול ובידול תאים אמינים מתבצעים באותה באר לאורך כל התקופה, כך שלאחר הציפוי הראשוני יש להחליף רק את המדיום לאורך כל תקופת הטיפוח. לכן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט מאוד, מהיר ולכן מעשי ביותר ליצירת ספרואידים של ריאות אנושיות המשכפלים מורפולוגית ותפקודית את אפיתל דרכי הנשימה ברמות כמעט פיזיולוגיות. יתרון נוסף הוא שניתן להתאים את הפרוטוקול הזה בקלות לתאים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השלבים מבוצעים בתנאים סטריליים (ארון בטיחות ביולוגית). להרכבי המדיה ששימשו במחקר זה, עיין בטבלה 1.

1. הכנת חומר ניסוי

  1. תרבית והרחבה של תאי אפיתל ריאה נורמליים אנושיים (HBEC3-KT) על צלחות תרבית תאי פלסטיק סטנדרטיות (צלוחיות T75) במדיום גידול אפיתל רגיל באמצעות אינקובטור סטנדרטי13 (ראה טבלה 1).
    הערה: לשיפור הצמיחה, ניתן להוסיף למדיום 10% סרום עגל עוברי (FCS).
  2. תרבית פיברובלסטים אנושיים (HS-5) ב-RPMI Medium בתוספת 10% סרום עגל עוברי ופניצילין/סטרפטומיצין10,14 (ראה טבלה 1).
  3. הכן מדיום אורגנואיד ריאה מסועף (BLO-Medium) על ידי תוספת DMEM/F12 עם N-2, B27, פניצילין-סטרפטומיצין, אלבומין בסרום בקר, מונותיוגליצרול, חומצה אסקורבית, KGF/FGF7, FGF10, ATRA ו-CHIR99021. (ראה טבלה 1 וטבלת החומרים).
    הערה: מומלץ להכין את המדיום טרי, לפחות בתוספת KGF/FGF7, FGF10, ATRA ו-CHIR99021. אם יש צורך במדיום נוסף תוך פרק זמן קצר, מומלץ רק תקופת אחסון קצרה של מספר ימים (עד שבוע) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לחלופין, ניתן להשתמש במדיום הבידול האורגנואיד של דרכי הנשימה PneumaCult הזמין מסחרית.

2. הכנת תאי אפיתל ופיברובלסטים

הערה: השתמש בשני סוגי התאים כאשר התאים מגיעים לסביבות 80% מפגש. הכן כל סוג תא בנפרד.

  1. הסר והשליך את מדיום התרבות.
  2. שטפו תאים על ידי שטיפה קצרה של שכבת התאים עם 5 מ"ל PBS.
  3. טריפסיניזציה של תאי אפיתל על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.5% טריפסין-EDTA, ולאחר מכן דגירה קצרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4-8 דקות.
  4. קצירת תאים מעוגלים וכמעט מנותקים על ידי הוספת מצע גידול תקין או PBS בתוספת 10% FCS באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
  5. פיפט את הנפח המתאים למעלה ולמטה מספר פעמים בבקבוק T75 (לאורך משטח הגידול) כדי להפריד עוד יותר את גושי התאים ולהעביר את תרחיף התאים לצינור של 15 מ"ל.
  6. קציר פיברובלסטים HS5 בהתאמה באמצעות טריפסיניזציה של TE ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
  7. גלולה כל סוג תא (ולכן נקי מטריפסין) על ידי צנטריפוגה (למשל, 300-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר [RT]) והשעיה מחדש (הן תאי אפיתל והן פיברובלסטים) ב-1-2 מ"ל של מצע גידול אפיתל תקין לפני ספירה קודמת.
  8. קבע מספרי תאים ברי קיימא באמצעות נפח מתאים של תאים תלויים; כל אחד מדולל 1/5 באמצעות 0.4% כתם כחול טריפן בתא ספירה של נויבאואר תחת מיקרוסקופ.

3. יצירת תרביות ספרואידים תלת מימדיות אפיתל-פיברובלסטים

  1. לדלל את מספר התאים הרצוי במדיום גידול אפיתל רגיל באמצעות צינור של 15 מ"ל. חשב 2000 תאי אפיתל עם 50 פיברובלסטים ב-100 מיקרוליטר של מדיום עבור כל באר מ-96 לוחות הבאר. מספרי התאים המתקבלים המתאימים לצלחת אחת של 96 בארות הם 200,000 תאי HBEC ו-5,000 פיברובלסטים HS5 ב-10 מ"ל של מצע גידול אפיתל תקין.
  2. יש לערבב בעדינות באמצעות פיפטות סרולוגיות סטריליות בנפח 10 מ"ל.
  3. העבירו את תרחיף התאים למאגר ריאגנטים סטרילי למיקרופיפטה רב-ערוצית.
  4. זרע את התאים לתוך צלחת חיבור נמוכה במיוחד על ידי העברת 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית (12 ערוצים).
  5. דגירה בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באווירה לחה.
    הערה: היווצרות הספרואידים מוערכת באמצעות בדיקה מיקרוסקופית רגילה באמצעות מיקרוסקופ הפוך ועל ידי צילום ספרואידים עבור כל נקודת זמן רצויה.
  6. לאחר 4 ימים, הוסף 100 מיקרוליטר של BLO-Medium לכל באר לספרואידים שנוצרו.
  7. דגירה נוספת בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באווירה לחה.

4. ביצוע החלפת מדיה רגילה

  1. לאחר 7-8 ימים, בצע החלפת מדיה קבועה. לכן, מקם את הצלחת בזווית קלה כך שהספרואידים ישקעו בכיוון ההטיה בהתאם לכוח הכבידה.
  2. שאפו את הסופרנטנט בזהירות ובצורה הטובה ביותר האפשרית עם קצה פיפטה של 100-200 מיקרוליטר.
  3. מקם מחדש את הצלחת אופקית ומלא ב-100-150 מיקרוליטר של מדיום BLO לבאר (באמצעות פיפטה רב ערוצית)
  4. דגירה נוספת בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באווירה לחה או התחל ניסוי/טיפול.
    הערה: ניתן לתרבית את הספרואידים לתקופות ארוכות יותר (עד 21 יום). לאחר מכן, יש לבצע שינוי בינוני מלא לפחות פעמיים בשבוע.

5. אנליזות במורד הזרם (קצירת ספרואידים)

  1. בצע בדיקה ותיעוד מיקרוסקופי קבוע על ידי צילום תמונות בשילוב עם מדידות גודל הכדור וחישובי נפח, ולבסוף מאפשר כימות של צמיחת הספרואידים ושינויים פוטנציאליים בגדילה לאחר הטיפולים.
  2. להדמיית תאים חיים בנקודות זמן רצויות, דגרו את הספרואידים למשך 15 דקות נוספות עם 1 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 (או DAPI) לצביעה של גרעינים וניתוח במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
  3. הקציר יצר ספרואידים בנקודת הזמן הרצויה באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר כשהיציאה מנותקת (שמור על סטרילי) כדי להגדיל את הקוטר. לכן, שאפו גם את המדיה המכילה את הספרואיד. שלב ואסוף את הספרואידים בצינור של 2-5 מ"ל. לאחר 2-5 דקות, כאשר הספרואידים שקעו עקב כוח הכבידה, הסר את הסופרנטנט והמשך לניתוח במורד הזרם.
  4. ליצירת ליזטים שלמים של חלבון ספרואידי, יש להוסיף ישירות מאגר ליזה קר כקרח (150 מילימול/ליטר NaCl, 1% NP40, 0.5% נתרן-דאוקסיכולאט, 0.1% נתרן-דודצילסולפט, 50 ממול/ליטר Tris/HCl, pH 8, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז) לשפופרת המכילה את הספרואידים שנקטפו. לאחר שניים עד שלושה מחזורי הקפאה והפשרה, קבע את תכולת החלבון של הליזטים והמשך לניתוח במורד הזרם, למשל, ניתוח כתמים מערביים15.
  5. ליצירת ליזטים שלמים של RNA ספרואידי, הוסף ישירות מאגר ליזה של RNA לצינור המכיל את הספרואידים שנקטפו ובצע בידוד RNA בהתאם להוראות היצרן של ערכת בידוד ה-RNA המתאימה המשמשת.
  6. עבור אימונוהיסטוכימיה (IHC) וצביעה אימונופלואורסצנטית, בצע את השלבים 5.6.1-5.6.3.
    1. טפל בספרואידים שנקטפו עם 1-2 מ"ל של 4% תמיסת מלח פרפורמלדהיד/פוספט (PBS) למשך 30 דקות ולאחר מכן כפוף להטמעה וחתך של פרפין (3-5 מיקרומטר).
    2. לפני צביעה אימונו-פלואורסצנטית, הכינו דגימות באמצעות סדרה יורדת של אלכוהול ודגירה עם תמיסת אחזור מטרה. לאחר מכן, חסמו שקופיות עם תמיסת חסימה (2% סרום עיזים רגיל / PBS) כדי להפחית אינטראקציות לא ספציפיות ולדגור נוגדנים ראשוניים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. זיהוי אנטיגנים על ידי נוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית. גרעיני כתמים נגדיים עם DAPI. בצע צביעה נוספת (למשל, ערכת צביעה PAS) בהתאם לפרוטוקולי היצרן להערכה היסטולוגית.
  7. עבור מתלים חד-תאיים, בצע את השלבים 5.7.1 ו-5.7.2.
    1. השעו מחדש את הספרואידים שנקטפו ב-1-2 מ"ל של TrypLE המכילים 100 U/mL DNase I ואחריו דגירה של 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. עצור את העיכול על ידי הוספת PBS המכיל 2-5% FCS, 2 מ"מ EDTA ו-DNAse I.
    2. העבירו תמיסה סלולרית דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי טרי לפני ניתוח במורד הזרם (למשל, ציטומטריית זרימה או ניתוח תא בודד).
  8. לניתוח ריצוף RNA של תא בודד, בצע את השלבים 5.8.1-5.8.3.
    1. סמן את ההשעיות השונות של תאים בודדים המעניינים המייצגים נקודות זמן או טיפולים שונים באמצעות ערכת ריבוב תאים בודדים (אנושית) בהתאם להוראות היצרן.
    2. שלב דגימות לאחר מכן וטען על נתיב על מחסנית תא יחיד המכוונת ל-10,000-40,000 תאים.
    3. אחזר תאים בודדים, בצע שעתוק הפוך והכנת ספרייה בהתאם להוראות היצרן, ורצף RNA מבודד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול פשוט זה מאפשר גידול ספרואידלי נטול-מטריצה של תאי אפיתל ופיברובלסטים אנושיים בשילוב עם לוחות חיבור אולטרה-נמוכים (איור 1A). במהלך תהליך הטיפוח, ספרואידים מורכבים יותר של הריאות נוצרים בהדרגה מהספרואידים שנוצרו בתחילה, עם יצירה יעילה של מבנים אפיתל ופיברובלסטיים שונים המייצגים אינטראקציות תאיות ישירות כפי שמתגלות על ידי ניתוחים מורפולוגיים באמצעות דימות תאים חיים (איור 1B), אימונוהיסטוכימיה (איור 1C) ואימונופלואורסצנציה (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של תרביות תאים תלת מימדיות הוצעו כדי לגשר על הפער בין תרביות דו-ממדיות למחקרי in vivo, מכיוון שסוג זה של תרבית (co-) מחקה טוב יותר את התכונות הפיזיולוגיות, המורפולוגיות והפתולוגיות הקיימות in vivo מכיוון שקיימות יותר אינטראקציות תא-תא דמויות vivo, אינטראקציות תא-ECM, תגובות לגירויים, ביטוי גנים, ביטוי חלבונים והתמיינות17, 18. בנוסף לספרואידים הרבים ולעיתים המורכבים מאוד של הגידול 10,15,19,20, ספר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים קובעים כי אין ניגודי אינטרסים אישיים או מוסדיים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למוחמד בנצ'לאל, אווה גאו, סבין סנקל ואולגה קרוזה על הסיוע הטכני המצוין. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד הפדרלי לחינוך ומחקר (BMBF) (LuOrgNTT: 16LW0293 to D.K., SeniRad: 02NUK086C to V.J., D.K.) ועל ידי קבוצת ההכשרה למחקר DFG 2762.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 מ"ל פיפטות סרולוגיות סטריליות ThermoFischer170356Nפיפטות סרולוגיות סטריליות של Nunc, או
צינור חרוטי שווה ערך של 15 מ"לקורנינג430052או שווה ערך
ל-37 מעלות; C/ 5% CO2 לחות  אינקובטור
5 מ"ל פיפטות סרולוגיות סטריליות ThermoFischer170355Nפיפטות סרולוגיות סטריליות Nunc, או שווה ערך
ל-50 מ"ל צינור חרוטיקורנינגCLS430829או שווה ערך
ATRA (חומצה רטינואית All-Trans)StemCell TechnologiesCat#72262תוסף 50 ננומטר
B-27 (50x), ThermoFischer/GibcoCat#175040441x
BD Rhapsody ערכת הגברה WTABioscienceCat#633801שימוש בהתאם להוראות היצרן
ארון
סרום בקר אלבומיןרושCat#BSAVHS-RO0.4% (v/v)
מסננת תאיםקורנינג352350פלקון 70 ומיקרו; m מסננת תאים, לבנה, סטרילית, צנטריפוגה אפנדורף ארוזה בנפרד
https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001למשל, צנטריפוגה אפנדורף 5804 - צנטריפוגה שולחנית
DMEM/F12InvitrogenCat#11330-032500 מ"ל
DNase I, ללא RNase (1  U/μ L)ThermoFischerCat#EN0521100 U/mL 
EDTA (0,5 M), pH 8,0,ThermoFischerAM9260G2 מ"מ
Eppendorf Research בתוספת פיפטה רב-ערוצית 12 ערוצים Eppendorfלמשל, #3125000044 (10– 100 ומיקרו; L) או #3125000060 (30– 300 ומיקרו; L)
סרום עגל עובריThermoFischer/GibcoCat#A525670110% (v/v)
HBEC3-KT ATCCCRL-4051קו תאי אפיתל ריאה תקין אנושי 
תמיסת הפרין (0.2%)StemCell TechnologiesCat#79800.8 מ"ל
Hoechst 33342 חתול ThermoFischer#H13991 ומיקרו; גרם/מ"ל
HS-5 ATCCCRL-3611פיברובלסטים סטרומליים אנושיים
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACFStemCell TechnologiesCat#78173.110 ננוגרם/מ"ל
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF StemCell TechnologiesCat#78186.110 ננוגרם/מ"ל
ערכת ריבוב תאים בודדים אנושייםBD BioscienceCat#633781להשתמש בהתאם להוראות היצרן
Hydrocortisin Stock Solution StemCell TechnologiesCat#79260.5 מ"ל לכל 500 מ"ל
Laduviglusib (CHIR-99021)Biozol/SelleckchemCat#S12633 & micro; M
L-חומצה אסקורביתסיגמא-אולדריץ'חתול#A9290250 ומיקרו; g/mL
מיקרוסקופZEISS
מונותיוגליצרולסיגמא-אולדריץ'Cat#M61450.4 & מיקרו; תוסף M
N-2 (100x)ThermoFischer/GibcoCat#175020481x
תא ספירת נויבאוארMerckBR718605למשל, BRAND  לשכת הספירה BLAUBRAND  דפוס נויבאואר
סרום עיזים רגילThermoFischerCat#318732% (v/v) ב-PBS
NP-40Merck/MilliporeCat#492016NP-40-Alternative, 1
ערכת צביעה PASSigma AldrichCat#1016460001להשתמש בהתאם להוראות היצרן
PBSThermoFischerCat#100100231x
פניצילין-סטרפטומיצין (10.000  U/mL), 100xThermoFischer/GibcoCat#151401221x
PFAThermoFischerCat#J61899. AKParaformaldehyd, 4% ב-PBS
PneumaCult Airway Organoid Differentiation Medium (ODM)StemCell TechnologiesCat#05060PneumaCult Airway Organoid Basal Medium (#05061, 360 מ"ל) ו-PneumaCult Airway Organoid Differentiation Supplement* (#05063, 40 מ"ל)
PneumaCult Ex Plus MediumStemCell Technologies Cat#5040ערכה המורכבת מ-PneumaCult-Ex Plus Basal Medium (#05041, 490 מ"ל) ותוסף PneumaCult-Ex Plus 50X*(#05042, 10 מ"ל)
קוקטייל מעכב פרוטאזMerck/RocheCat#46931320011 טבליות/10 מ"ל
Rhapsody cDNA KitBD BioscienceCat#633773לשימוש בהתאם להוראות היצרן
RPMI 1640 MediumThermoFischer/GibcoCat#11875093500 מ"ל
נתרן כלוריMerck/Sigma-AldrichS9625150 ממול/ליטר
נתרן ציטראטMerck/Sigma-AldrichCat#1613859-1G0.10%
נתרן דאוקסיכולאטMerck/Sigma-AldrichCat#309700.50%
נתרן דודציל סולפט Merck/Sigma-AldrichCat#116672890010.10%
מאגר ריאגנטים סטרילי למיקרופיפטה רב-ערוצית (למשל, 60 מ"ל)ThermoFischer9510037או שווה ערך
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ckSarstedt (או facellitate)83.3925.400 (או F202003)צלחת חיבור נמוכה במיוחד
Tris/HClThermoFischerCat#AM9855G50 ממול/ליטר, pH 8
טריטון  X-100סיגמא-אולדריץ'קאט#X100-5ML0.05 % 
Trypan Blue Stain (0.4%)ThermoFischerCat#152500611/5 (v/v) עם NGM
TrypLEThermoFischerCat#126040131x
Trypsin-EDTA (0.5 %)ThermoFischerCat#154000540.05% תמיסת טריפסין-EDTA (TE) מדוללת אספטית ל-1X באמצעות תמיסת מלח חוצצת פוספט (ללא סידן ומגנזיום)
מגיב WST-1CELLPRO-RO, RocheCat#5015944001מגיב שגשוג תאים 
BD בטיחות ביולוגית נטול RNase %

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasouli, M., Safari, F. Principles of indirect co-culture method using Transwell. Methods Mol Biol. , (2024).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng C. 107, 110264(2020).
  3. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84 (6), 736-752 (2004).
  4. Huang, X., et al. Current advances in 3D dynamic cell culture systems. Gels. 8 (12), 829(2022).
  5. Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: progress so far and future prospects. Pharmaceutics. 15 (8), 926(2022).
  6. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  7. Baarsma, H. A., et al. Epithelial 3D-spheroids as a tool to study air pollutant-induced lung pathology. SLAS Discov. 27 (3), 185-190 (2022).
  8. Shah, D. D., Raghani, N. R., Chorawala, M. R., Singh, S., Prajapati, B. G. Harnessing three-dimensional (3D) cell culture models for pulmonary infections: state of the art and future directions. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 396 (11), 2861-2880 (2023).
  9. Ketteler, J., et al. Caveolin-1 regulates the ASMase/ceramide-mediated radiation response of endothelial cells in the context of tumor-stroma interactions. Cell Death Dis. 11 (4), 228(2020).
  10. Wittka, A., et al. Stromal fibroblasts counteract the caveolin-1-dependent radiation response of LNCaP prostate carcinoma cells. Front Oncol. 12, 802482(2022).
  11. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Matrix-free human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells to model lung injury. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 468(2024).
  12. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  13. Hansel, C., et al. Metformin protects against radiation-induced acute effects by limiting senescence of bronchial-epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (13), 7064(2021).
  14. Panic, A., et al. Progression-related loss of stromal caveolin 1 levels fosters the growth of human PC3 xenografts and mediates radiation resistance. Sci Rep. 7, 41138(2017).
  15. Sentek, H., Braun, A., Budeus, B., Klein, D. Non-small cell lung cancer cells and concomitant cancer therapy induce a resistance-promoting phenotype of tumor-associated mesenchymal stem cells. Front Oncol. 14, 1406268(2024).
  16. Steens, J., et al. Direct conversion of human fibroblasts into therapeutically active vascular wall-typical mesenchymal stem cells. Cell Mol Life Sci. 77 (17), 3401-3422 (2020).
  17. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  18. Arora, S., et al. Spheroids in cancer research: recent advances and opportunities. J Drug Deliv Sci Technol. 100, 106033(2024).
  19. Chen, S., et al. 3D co-culture of lung cancer cells with CAFs: An in vitro model system to study tumor progression. J Vis Exp. , e20235(2025).
  20. Hey, S., Linder, S. A macrophage-tumor spheroid co-invasion assay. JoVE. (215), (2025).
  21. Miranda, G., et al. Cost-effective 3D lung tissue spheroid as a model for SARS-CoV-2 infection and drug screening. Artif Organs. 48 (7), 723-733 (2024).
  22. Celis, T., Bullens, D. M. A., Hoet, P. H. M., Ghosh, M. Development and validation of a human bronchial epithelial spheroid model to study respiratory toxicity in vitro. Arch Toxicol. 98 (2), 493-505 (2024).
  23. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of normal human bronchial epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Sci Rep. 9 (1), 500(2019).
  24. Basil, M. C., et al. The cellular and physiological basis for lung repair and regeneration: past, present, and future. Cell Stem Cell. 26 (4), 482-502 (2020).
  25. Klein, D. Lung multipotent stem cells of mesenchymal nature: cellular basis, clinical relevance, and implications for stem cell therapy. Antioxid Redox Signal. 35 (3), 204-216 (2021).
  26. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. J Clin Invest. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  27. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaço-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: an overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  28. Budeus, B., Kroepel, C., Stasch, L. M., Klein, D. Free-floating human lung organoids derived from induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. , (2025).
  29. Li, C., et al. Establishing human lung organoids and proximal differentiation to generate mature airway organoids. JoVE. (181), e63684(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים