מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Summary

מאמר זה מספק תיאור מפורט כיצד ליצור דגימות למעקב אחר חלבון יחיד בשכבות דו-שכביות ליפידיות הנתמכות על ידי מוצקים. הוא גם מסביר מיקרוסקופ פלואורסצנציה פשוט עם רגישות למולקולה בודדת וקצב פריימים מהיר. לבסוף, אנו מתארים את ההליך להפקת מסלולי חלבון יחיד.

Abstract

תצפית ישירה היא שיטה יסודית לגילוי והבנה מדעיים. הדמיית פלואורסצנציה חד-מולקולית ב-Time-lapse מאפשרת תצפית על חלבונים בודדים כשהם נעים ומתקשרים עם סביבתם, מה שהופך מצבים שבדרך כלל היו מוסתרים במדידות קבוצתיות לגלוי. מעקב חלבון יחיד מתאים במיוחד לחקר חלבוני ממברנה, שם אופיו הדו-ממדי מאפשר הדמיה מהירה ורחבת שדה עם רגישות לפלואורופור יחיד. שימוש בבי-שכבות ליפידים מלאכותיות המדמות ממברנות שבהן נמצאים חלבוני ממברנה או ממברנה היקפית (כגון ממברנות פלזמה או ממברנות של אברונים תוך-תאיים מסוגי תאים שונים) מאפשר מדידה של אינטראקציות ספציפיות בסביבות כמעט טבעיות. זה גם מאפשר הוספת מורכבות הדרגתית, רכיב אחר רכיב, תוך דיכוי הפרעות רקע מפלואורסצנציה ופיזור רמאן. על ידי הוספת בקרת טמפרטורה, ניתן לקבוע גם את התכונות התרמודינמיות של אינטראקציות חלקיקים בודדים. בעבודה זו אנו מתארים פרוטוקול להכנת דגימות, איסוף נתונים, מעקב פלואורסצנציה חד-מולקולי וניתוח מסלולי חלבוני ממברנה בדו-שכבות ליפידים באמצעות Aquaporin-4. עבודה זו משמשת כדוגמה יסודית וניתנת להתאמה לחלבונים ורכבים דו-שכבתיים שונים.

Introduction

בתנאים ביולוגיים טבעיים, חלבוני ממברנה מוקפים ברשת נרחבת של אינטראקציות, הכוללת חלבוני ממברנה נוספים, חלבונים בנוזלים התוך-תאיים והחיצוניים, סוגים שונים של ליפידים וכולסטרול, סובסטרטים או ליגנדים, אינטראקציות עם תמיסה, ואינטראקציות בין מטריצות חוץ-תאיות לתוך-תאיות. גישה ביופיזיקלית קלאסית להבנה טובה יותר של אינטראקציות קונקרטיות וקולקטיביות מתחילה ברכיב יחיד, ומוסיפה בהדרגה רכיבים נוספים אחד בכל פעם עד שהמורכבות משקפת את הסביבה הטבעית – גישה של "חלוקה וכבוש" לביופיזיקה. שיטה מודרנית בקנה מידה מולקולי לחקר אינטראקציות אלו היא באמצעות תצפית ישירה באמצעות הדמיית פלואורסצנציה חד-מולקולית בזמן-לפס, כדי לעקוב אחר חלבונים בודדים בזמן שהם נעים ומתקשרים עם סביבתם. במאמר זה אנו מתארים את השלבים הבסיסיים של הגישה הזו, כולל היווצרות דו-שכבת ליפידים על כיסויי קוורץ והכנסת חלבון ממברנה גדול לתוך הביליירים המוכנים הללו באופן המתאים להדמיה בחלבון יחיד. לאחר מכן יתבצע פרוטוקול 'סוס עבודה' למעקב אחר חלבונים בודדים בשכבות דו-שכביות נתמכות.

מאמר זה מתאר כיצד ליצור דו-שכבות ליפידיות נתמכות מוצק באמצעות וזיקולות חד-למלריות קטנות (SUVs) שמתפרקות על כיסויי קוורץ הידרופיליים. משטחי הקוורץ מוכנים באמצעות שטיפה חומצית או ניקוי אוזון אולטרה סגול (UV). הליפיד המשמש ליצירת רכבי השטח צריך, ככל האפשר, להתאים להרכב הכימי העיקרי של הממברנה הביולוגית המעניינת (למשל, אקוופורין-4 (AQP4) נמצא בממברנת הפלזמה של האסטרוציטים והרכיבים העיקריים הם POPC (46.4%), POPE (8.5%), PS (5.6%), כולסטרול (30%), PI (2.5%) ו-SM (5.6^%)1,2). כדי למנוע אינטראקציה עם המצע המוצק, תוספים כמו פוליאתילן גליקול (PEG) שהושתלו לשומן מרימים את השכבה הבילית מהמשטח ^3,4. כמות כל תוסף חייבת להיות מכוונת בקפידה כדי להבטיח שהדיפוזיה של החלבון אינה נחסמת, תוך מתן תמיכה מספקת להרמת הממברנה מפני שטח המצע. תוספים כמו ליפידים PEGylated מציגים בדרך כלל שני שלבים: 'שלב מברשת' ו'שלב פטריה'. שלב המברשת מתרחש כאשר ה-PEG בריכוז גבוה, מה שגורם לפולימר לעמוד זקוף כדי להפחית מכשולים סטריים. שלב הפטרייה מתרחש בריכוזים נמוכים, כאשר הפולימרים מופרדים מספיק כדי להתקיים כסלילים אקראיים. באופן כללי, שלב המברשת מגביל את הפיזוזיה, אך שלב הפטרייה מספק מעט תמיכה. הריכוז בין שלב המברשת לפטרייה הוא מיטבי, ומספק תמיכה עם השפעה מינימלית על הדיפוזיה ^3,4.

חלק מחלבוני ממברנה ייכנסו באופן ספונטני לממברנות ליפידים הנתמכות מוצק, כמו P450s וציטוכרום P450 רדוקטאז⁵, בעוד שאחרים יצטרכו להחדיר באמצעות חומרי ניקוי, תהליך עדין. ניקוי זהיר נדרש להסרת חומרי הניקוי הללו, כמו גם כל חלבון לא משולב שעלול להפריע למעקב חלבון יחיד – תהליך שיתואר בפירוט. המוקד המרכזי של מאמר זה הוא הכנת דגימה למעקב מולקולה בודדת (SMT) באמצעות הדמיית פלואורסצנציה בזמן-לפס. זה דורש מטרה עם הגדלה גבוהה וצמצם מספרי (NA) – בדרך כלל מטרה טבילה בשמן של 100x ו-1.45 NA ^6,7. הוא גם דורש מצלמה מהירה ורגישה מאוד (מצלמת EMCCD, CMOS או ICCD) וגירוי לייזר. עירור לייזר צריך לכסות שדה ראייה גדול מספיק כדי למדוד מסלולי חלבון ארוכים, דבר שנעשה לעיתים באמצעות החזרה פנימית כוללת ליצירת שדה מתמקם של כ-50 מיקרון x 100 מיקרון או אפי-הארה עם אופטיקת עיצוב קרן (גאוסיאן עד טופ-האט) כ-80 מיקרון על 80 מיקרון⁸ או גיליון אופטי (HILO) עם שדה דומה ל-TIRF. למיקרוסקופ פלואורסצנציה פנימית כוללת (TIRF) יש יתרון בהפחתת אות הרקע. עיצוב מיקרוסקופ TIRF פשוט וזול יחסית מוצג להלן. על ידי הוספת בקרות טמפרטורה, ניתן למדוד מספר תכונות תרמודינמיות כגון אנתלפיה, אנטרופיה ואנרגיה חופשית של גיבס⁹. הטכניקה דורשת גם סימון פלואורסצנטי של חלבון הממברנה ברמת סימון שמבטיחה שרוב חלבוני הממברנה נושאים תג פלואורסצנטי.

החלבון הטרנסממברני שמעניין במאמר זה הוא AQP4. AQP4 הוא תעלת מים מקוטבת בקצה כפות הרגליים של האסטרוציטים ובאזורים אחרים בכלי הדם של מערכת העצבים^{המרכזית.} הוא מסוגל להוביל עד 3 מיליארד מולקולות מים בשנייה ומעורב בהומאוסטזיס מים, נדידת תאים, בצקת מוח, למידה ויצירת זיכרון דרך פלסטיות סינפטית¹¹. חוסר ויסות בתפקוד AQP4 נקשר למצבים נוירולוגיים שונים, כולל בצקת מוחית, נוירומיאליטיס אופטי ואפילפסיה 12,13,14,15. AQP4 הוא חלבון בגודל 32-37 קילו-דל, התלוי באיזופורם שלו, ובעל מבנה רבעוני טטרמרי עם שמונה תחומי ממברנה הידרופוביים המחוברים בלולאות חיבור, דומיין N-טרמינל תוך-תאי, ותחום C-טרמינל תוך-תאי גדול¹⁶. ישנם שני איזופורמים עיקריים של AQP4, M1 ו-M23; ההבדל נובע מההתחלה בשארית מתיונין 1 או בשארית מתיונין 23. מחקרים הראו כי האיזופורם M1 יכול ליצור דיאדות או טריאדות עם עצמו, בהתאם למצב הפלמיטוילציה שלו⁹. איזופורם M23 מתחבר לאגרגטים חלבונים גדולים הידועים כ-OAPs (מערכים אורתוגונליים של חלקיקים). כאשר הוא מבוטא במשותף, איזופורם M1 מגביל את גדילת ה-OAP על ידי יצירת ציפוי חלבון היקפי סביב החלק החיצוני 17,18,19. הדינמיקה של הצטברות OAP עשויה להיות גורם מרכזי בוויסות חדירות המים וההומאוסטזיס במוח. במאמר זה אנו מתארים את השלבים הנדרשים למעקב אחר AQP4 בודדים בממברנה ולצפות באינטראקציות חלבון בודד.

Protocol

1. הכנת וזיקולות חד-למלריות קטנות

1. הוציאו את תמיסות ציר השומנים מהמקפיא ותנו להן להגיע לטמפרטורת החדר.
2. קח בקבוק נקי של 10 מ"ל מהתנור ותן לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
3. הוסיפו 900 מיקרולטר כלורופורם בדרגת ספקטרוסקופיה ו-100 מיקרוליטר מתנול בדרגת ספקטרוסקופיה לבקבוק הקר עם תחתית עגולה, ואז הוסיפו את הכמויות המתאימות מכל ליפיד בתערובת. סובבו את הבקבוקון כדי לוודא שהשומנים מעורבבים היטב.
   הערה: מחברים אחרים משתמשים ביחסים שונים של כלורופורם:מתנול, אך מצאנו שהיחס הטוב ביותר ליצירת עוגות שומן אחידות היה 9:1.
   גיליון אלקטרוני לחישוב הכמויות הנכונות של שומנים מסופק בקובץ המשלים 1. אם מכינים ליפידים לאימות היווצרות שכבת הליפידים על פני השטח של הסובסטרט, השתמשו בליפיד מסומן פלואורסצנטית.
4. הניחו מחבר זיקוק ואקום מעל הבקבוק עם תחתית עגולה, כפי שמוצג באיור 1, וחברו אותו לקו החנקן (מכשיר הייבוש).
   הערה: השתמש ב-N₂(g) מטוהר והעבר אותו דרך פילטר של 0.22 מיקרון לפני החיבור למכשיר הייבוש.
5. הפעל את_ה-N2(g) וכיוון את הלחץ כך שהזרימה תהיה כזו שהיא כמעט לא מורגשת בגב היד.
   הערה: הרטבת גב היד יכולה לעזור לחוש את האידוי.
6. אפשר לדגימה להתייבש בזרימה של_N2(g) למשך 2.5-3 שעות, תוך בדיקה מעת לעת לוודא שהחנקן ממשיך לזרום. הדגימה כנראה תיראה יבשה בתוך חצי השעה הראשונה; עם זאת, יש להמשיך לזרום חנקן למשך 2-2.5 שעות נוספות כדי להסיר את הממס שנותר.
   הערה: ניתן גם לייבש את הדגימה ללילה.
7. הוסף 1 מ"ל בופר לכל 5.0 מיקרומול של שומן כולל בבקבוק התחתית העגולה.
   הערה: הבופר ששימש במחקר זה כלל 100 מ"מ HEPES, 5 מ"מ CaCl₂, ו-140 מ"מ NaCl; זהו אותו בופר שמשמש לאורך כל הכנת הדגימה.
8. שים פקק זכוכית על הבקבוק ועוטף אותו בסרט פרפין.
9. הניחו את הבקבוק במהדק על מעמד טבעת וטבלו את תחתית הבקבוק באמבט של סוניקטור על טמפרטורה של 60°C. אפשר לבקבוק לדוג במשך שעה, תוך סיבוב עדין כל 15 דקות ליצירת ליפוזומים רב-למלריים, הנראים כתמיסה אטומה ללא שומנים מחוברים לבקבוק.
10. לאחר הדגירה של שעה, הפעל את הסוניקטור (~35 קילוהרץ) והגדר את המשרעת להגדרה הגבוהה ביותר. לאחר מכן, הזיזו את הבקבוק באמבטיה כדי למצוא את המקום שבו מתרחשת התנועה הגדולה ביותר, כך שהתמיסה תתנגש ותתזה בתוך הבקבוק. Sonicate ל-30 דקות, מחפש שינוי מאטום לשקופ ומעט אופלסנטי.
11. הסר את תמיסת השומנים מהבקבוק ומניח אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה, ואז בצנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך שעה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט מצינור המיקרוצנטריפוגה.
    הערה: עשויה להיווצר כדור קטן בתחתית הצינור. אם הכדור גדול, השליכו אותו וחזרו על התהליך.
12. השתמש ברכבי השטח אחרי הצנטריפוגה, אחסן אותם ב-4 מעלות צלזיוס במשך שבוע, או שמור על מינוס 80 מעלות צלזיוס עם קצת טרהלוזה.
    הערה: הכמות המומלצת של טרהלוז היא 1 מ"ג למ"ל של תמיסת שומן. לתוצאות מיטביות, ניתן לייצר רכבי שטח חדשים מדי שבוע ולאחסן במקרר.
    הערה: זו רק שיטה אחת להכנת רכבי שטח. מלבד רכבי שטח, ניתן לייצר וזיקולות חד-למלריות קטנות, בינוניות וגדולות באמצעות אקסטרוזיה או ליפוזומים ענקיים חד-למלריים באמצעות אלקטרופורמציה 20,21,22,23.

2. תיוג חלבונים

הערה: תיוג חלבונים באמצעות גלאי פלואורסצנטיים באמצעות קונוגטים שונים, כגון אסטרים ומאלימידים של NHS, מתועד ומובן היטב. עם זאת, רמת הסימון (DOL) חשובה במיוחד במעקב חלבון יחיד. במחקר זה, היה חיוני לקבוע איזה אחוז של חלבונים טרנסממברנליים מסומנים ומה התפלגות הפלואורופורים על כל טטרמר AQP4.

1. הניחו צינור דיאליזה בכוס עם בופר של 0.1 מטר פוספט ב-pH 8.3 שעבר דרך פילטר של 0.22 מיקרון. לאחר מכן, תן לו לשבת בבופר למשך הלילה במצב הפוך, כדי לאפשר לממברנה להתפתח.
2. ביום הבא, החלף את הבופר בתוך צינור הדיאליזה בתמיסת החלבון.
   הערה: נפח תמיסת החלבון צריך להיות בטווח של 20-250 מיקרוליטר. צריך להיות ~1-5 מ"ג חלבון מומס בתוך התמיסה.
3. לאחר שהחלבון מונח בצינור הדיאליזה, תן לו לשבת הפוך כל הלילה בבופר הפוספט של 0.1 מטר.
4. לאחר הדיאליזה, העבר את החלבון לצינור מיקרוצנטריפוגה.
5. הכינו צינור דיאליזה חדש על ידי חזרה על שלב 2.1.
6. הכינו את צבע ה-NHS על ידי הנחת כמה גרגרים (3-4) על חתיכת נייר שקילה קטנה, ואז העברו לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וממוססים ב-100 מיקרו ליטר DSMO. לאחר מכן יש שתי דילול של 1 מ"ל בגודל 10 פעמים ב-DMSO, תוך שימוש בדילול הסופי לקביעת ריכוזי כל דגימה באמצעות ספקטרוסקופיית UV-vis. כדי להגיע ל-DOL ממוצע של 2-3, הוסיפו תוספת מולרית של צבע תגובתי לתמיסת החלבון תוך כדי ניעור עדין.
   הערה: ספקטרומטר UV-vis סטנדרטי יספיק למטרה זו, אם כי ספקטרומטר בנפח קטן הוא יתרון בשל גודל המדגם.
7. הוסף את הצבע הפעיל לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל את החלבון בנפחים שווים. לאחר שהצבע והחלבון התגובתי מתווספים יחד, יש נוטט למשך מינימום של 8 שעות.
8. לאחר הניוטציה, העבר את החלבון המסומן לצינור הדיאליזה שהוכנה בשלב 2.5 ומניח אותו בבקבוק המכיל בופר פוספט טרי. שים מוט ערבוב בבופר ותן לו להסתובב בעדינות במשך 6 שעות, ואז החלפת בופר ועוד 6 שעות דיאליזה.
9. לאחר שני החלפות הבופר, הניחו את צינור הדיאליזה המכיל את החלבון המסומן בבקבוק נקי המכיל את הבופר העובד הסופי.
   הערה: הבופר הסופי ששימש במחקר זה כלל 100 מ"מ HEPES, 5 מ"מ מ"מ CaCl₂, ו-140 מ"מ NaCl ב-pH 7.4.
10. לאחר הדיאליזה, מדדו את DOL באמצעות ספקטרומטר UV-vis.
    הערה: חשוב לעקוב אחרי שיטות סטנדרטיות למדידת DOL. להלן משוואה לחישוב.
    (1)
    כאשר הספיגה הנמדדת בשיא הצבע היא ושיא החלבון ב-280 ננומטר הוא . מקדם ההכחדה של החלבון הוא (מחושב מהמשקל המולקולרי של החלבון), בעוד ש- מסופקים על ידי יצרן הצבע.

3. הכנת כיסויי קוורץ בקוטר 25 מ"מ

הערה: להלן שתי שיטות שונות:

1. שטיפה חומצית
   הערה: ישנם מספר שיטות שטיפת חומצה שפורסמו, כולל פיראניה וחריטה בסיסית. מצאנו שההליך שלהלן מספק משטח נקי והידרופילי במיוחד ללא חריטה, מה שמומלץ למחקרים חד-מולקולריים באמצעות הדמיית פלואורסצנציה.
   1. שיטת Acid Wash דורשת מכסה אדים בזמן חימום התמיסה וציוד מגן (משקפי מגן מעבדה, מעיל מעבדה, כפפות). בקבוק סוכריות נתרן ביקרבונט צריך להיות זמין במכסה המנוע למקרה של דליפה.
   2. הנח את הכיסוי בכוס ומלא במים ננו-טהורים, 30% מי חמצן, וחומצה חנקתית מרוכזת בחלקים שווים בנפח (תמיסה של 1:1:1).
   3. חממו את הכיסוי בתמיסה הזו במשך 30 דקות עד שהתמיסה מתחילה לבעבע.
   4. בדוק את התמיסה וערבב בעדינות כל 10 דקות כדי למנוע מהכיסוי להידבק יחד. כשמערבבים את התמיסה, שימו לב שההחלקות מחליקות ואז מתפרקות. לאחר שהם מופרדים, האט בהדרגה כדי להרחיק אותם, ומאפשר לתמיסה המבעבעת לעטוף את הסליפים.
      הערה: אין לחמם את התמיסה בעוצמה רבה מדי, שכן התגובה מייצרת חום. כוון את הפלטה החמה לבועות עדינות בדרך כלל, בדרך כלל על ההגדרה הנמוכה ביותר. בהגדרות אלו, התמיסה נשארת ב~70 מעלות צלזיוס. מומלץ גם מי חמצן טריים.
   5. לאחר שעברו 30 דקות או שהתמיסה מפסיקה לבעבע, תן לתמיסה 1:1:1 להתקרר לטמפרטורת החדר, ואז שטוף היטב את הכיסוי במים מטוהרים עם סיבוב עדין.
2. אוזון UV
   1. נקה את כיסויי הקוורץ עם n-הקסאן, ואז מתנול, באמצעות רקמות עדשה.
   2. הניחו את הכיסוי במכשיר ניקוי אוזון UV כאשר המשטח לטיפול פונה אל המנורה.
   3. הזרימו חמצן לתא ב-5 psi למשך 5 דקות; לאחר מכן, כבה את זרימת החמצן.
   4. לאחר מכן, הדלק את אורות ה-UV למשך 15 דקות, ותן לכיסויי הכיסוי לעמוד לפחות 10 דקות כדי לאפשר לאוזון לברוח.
   5. לאחר שימוש באחת משיטות הניקוי, הקפידו להשתמש מיד בכיסויי הכיסוי הנקיים. אם משתמשים במחליפים שנוקו קודם, חזרו על התהליך כדי לחדש את המשטח.
      הערה: אוזוניזציה בקרינת UV דורשת זרימה עקבית כדי להסיר את האוזון מהאוויר. יש למקם את המערכת מתחת לשנורקל לטיפול באוויר או בתוך מכסה אדים.

4. היווצרות דו-שכבתית ושילוב AQP4 לממברנה דו-שכבתית

הערה: הבופר ששימש במחקר זה כלל 100 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, ו-140 mM NaCl ב-pH 7.4.

1. הנח את הכיסוי הנקי במחזיק דגימות בגודל 25 מ"מ באמצעות צינור עדשה SM1 בגודל 1/4 אינץ'. לאחר מכן, חתכו אטם פרפילם כפול בקוטר 8 מ"מ ומקמו אותו במרכז מחזיק הדגימה (ראו איור 3).
2. מרחו טיפה של 50 מיקרולטר של רכבי השטח במרכז אטם ה-8 מ"מ, אטמו אותו, ואז דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
   הערה: זה מאפשר לליפוזומים להתמזג עם פני השטח של הקוורץ ההידרופילי ולהיקרע, וליצור שכבה דו-צדדית רציפה.
   סביר להניח שכמות הליפוזומים שמוסיפים לאזור האטם יכולה להשתנות, ואטם גדול יותר עשוי לדרוש יותר ליפוזומים ליצירת שכבה דו-צדדית רציפה. עם זאת, הסכומים שנקבעו בשלב 4.2 כמעט תמיד מקדמים יצירת שכבה כפולה רציפה.
3. לאחר הדגירה, שוטפים את הדגימה באמצעות פיפטה כדי להסיר את התמיסה. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של בופר טרי לשכבה הכפולה. לאחר מכן, חזור על התהליך סך הכל 10 פעמים.
   הערה: חשוב מאוד שקצה הפיפטה לא ייגע בשכבת הליפידים ושיישאר תמיסה שתשמור על הלחות של השכבה. כשמביאים את הקצה לחלק העליון של הטיפה, תראו שהיא נוגעת. אפשר להסיר את התמיסה מבלי לפגוע בשכבה הדו-שכבתית על ידי שמירה על מגע מינימלי עם פני הטיפה. בסופו של דבר, הטיפה תתהפך ותסתגל לכיוון האטם; זהו הרגע האידיאלי להפסיק להסיר את התמיסה. האור המוחזר אמור להשתנות בנקודה זו ויכול לשמש כאות לעצירה. אם אתה חושש להסיר יותר מדי תמיסה, הורד את הגדרת הפיפטה בזמן הכביסה כדי להשאיר כמות נוחה של בופר מעל שכבת הליפידים.
   ניתן להעריך מראש את שלמות היווצרות שכבת הליפידים בתנאים אלו באמצעות התאוששות פלואורסצנציה לאחר פוטובלינציה (FRAP). זה דורש רכיב בתערובת הליפידים שמסומן פלואורסצנטית 6,7,24,25.
4. לאחר סיום השטיפה הסופית, הסר שוב את הבופר ומוסיפים 50 מיקרו-ליטר אליקוט מהחלבון הרצוי בדטרגנט בריכוז המיסלרי הקריטי שלו או מתחתיו. יש לאפשר לפחות שעה אחת לשילוב חלבון בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: הדטרגנט ירכך בעדינות את השכבה הדו-צדדית ויסייע לחלבון להשתלב בממברנה. בפרוטוקול זה, הדטרגנט שנעשה בו שימוש היה 50 מיקרומום n-Dodecyl-beta-D-thiomaltoside (DOTM), דטרגנט לא-יוני, וריכוז החלבון היה 2 ננומטר.
5. לאחר שעה, שטוף את הדגימה עם בופר כדי להסיר חלבון או חומר ניקוי לא משולב.
6. הוסף 5 מ"ג חרוזי פוליסטירן בתנאי (חרוזי ביולוגיה) לדגימה, והשאירו לפחות שעה לפני ההסרה. הדגימה מוכנה להדמיה (ראו להלן).

5. תוסף אנטי-פייד

1. המיס 5 מ"ג טרולוקס ו-80 מ"ג D-גלוקוז ב-10 מ"ל של בופר (ראו למעלה). רעד ומערבולת עד שלא נשארים מוצקים. נוט לילה בחושך, ואז מסנן את התמיסה דרך פילטר של 0.22 מיקרון. הכינו טרי כל שבוע.
2. המיס 6.5 מ"ג גלוקוז אוקסידאז (1650 U) ו-8 מיקרוליטר קטלאז (29,200 U/mL בבופר) ב-92 מיקרונלטר של בופר. מערבבים את התמיסה בעדינות ללא מערבולות, ואז צנטריפוגה והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והגן מפני אור.
   הערה: תמיסה זו יכולה להישמר במקרר במשך מספר חודשים; עם זאת, אם מופיעה עכירות כלשהי, להשליך אותה ולהכין תמיסה חדשה.
3. מערבבים 99 מיקרוליטר תמיסה מ-5.1 עם 1 מיקרוליטר משלב 5.2 לתוך צינור חדש. לאחר השטיפה הסופית של הדגימה, מוסיפים את תמיסת האנטיפייד מעל הדגימה (הנקראת תמיסת הדמיה).
   הערה: תמיסות אנטיפייד יכולות לשנות את תפקודי חלבוני הממברנה; חשוב לוודא תאימות למערכת.

6. הגדרת מיקרוסקופ והגדרות

הערה: מיקרוסקופ TIRF מותאם אישית שימש למחקר חד-מולקולי זה. סעיף זה מתאר את הרכיבים העיקריים וטכניקות היישור המרכזיות למיקרוסקופ פלואורסצנציה בסיסי המתאים להדמיה מהירה בטיימלפס (איור 4), שהוא מכשיר אמין.

1. השתמש בלייזר He:Ne של 633 ננומטר כדי לעורר את הדגימות. הלייזר עובר דרך מסנן מעבר פס ולוחית גל 1/4 כדי ללטש את קו הלייזר ולהמיר את העירור מאור מקוטב ליניארית לאור מקוטב מעגלית.
   הערה: קיטוב מעגלי מפחיתה את השפעת כיוון הגשוש.
2. הקרן עוברת דרך עדשה בקוטר 300 מ"מ ומסנן לייזר בקוטר 633 ננומטר, מוחזרת ממראה דיכרואית ארוכת מעבר של 633 ננומטר, וממוקדת בגב מטרה של מיקרוסקופ שמן 100x, 1.45 N/A. יישר את הקורה כדי לוודא שהיא עוברת בצורה חלקה במרכז המטרה ונשארת ישרה ביציאה מהמטרה.
   הערה: בשלב זה, המיקרוסקופ מוגדר לאפיפלואורסצנציה (אפינפרין). כמות קטנה של אבקת חלב אפשר להוסיף לקובטה עם תחתית שקופה. הקובטה מונחת על מטרה של המיקרוסקופ עם טיפה של שמן טבילה ביניהם. זה מאפשר לך לצפות שהקרן עוברת ישר דרך המטרה.
3. הפליטה מהחלבונים המסומנים בפלואורסצנציה עוברת דרך מראה אובייקטיבית, דיכרואית, מסנן מעבר ארוך ועדשה בקוטר 300 מ"מ, ואז מצולמת על מצלמת EMCCD. השתמשו בעדשות צינור באורך מוקד ארוך יותר להגדלת התמונות במצלמה ולשפר את דיוק הסופר-לוקליזציה, מה שמועיל לחלבונים ואגרגטים טרנסממברניים איטיים. תדאג לכייל את פיקסלי המצלמה לננומטרים.
   הערה: עם זאת, הגדלה פי 1 מושגת עם עדשת הצינור שמוגדר על ידי יצרן האובייקטיבי, מה שמעלה את יחס האות לרעש על ידי מיקוד פלואורסצנציה על פחות פיקסלים. אורכי מוקד נפוצים כוללים עדשות של 200 מ"מ, 180 מ"מ, 165 מ"מ ו-164.5 מ"מ. אנו ממליצים להשתמש במטרת הגדלה של חיל האוויר האמריקאי משנת 1951. באמצעות עדשת 300 מ"מ במערכת זו, נמדדה כיול פיקסלים של 74 ננומטר בהגדלה כוללת של פי 170.
4. שלוט בטמפרטורת הדגימה באמצעות קולר אובייקטיבי ומחזיק דגימות המצויד במחמם/מקרר Peltier²⁶.
   הערה: שמירה על טמפרטורה יציבה היא חיונית להבטחת יציבות תרמית של המיקרוסקופ ולאפשר מדידות מדויקות התלויות בטמפרטורה ומיקוד המכשיר.
5. מפעילי פיזו מזיזים את הדגימה לכיווני XYZ. לאחר שהדגימה בפוקוס, כוונו את הקרן לקצה מטרת המיקרוסקופ (ראו איור 4) באמצעות הבמה המחוברת למראה המסתובבת הסופית עד להשגת זווית קריטית. זה יוצר שדה גירוי חולף. המיקרוסקופ ממוקם כעת ב-TIRF.
   הערה: ניתן לקבוע שהמיקרוסקופ נמצא ב-TIRF כאשר ההחזרה האחורית מהלייזר היא קו (ולא נקודה), והרקע מהדגימה יורד בעוצמה ומתארך.

7. איסוף נתונים

הערה: המצלמה חייבת להיות מוגדרת לאיסוף נתונים מהיר.

1. הגדר את מהירות ההזזה האנכית של הפיקסל לכ-600 ננו-נוניות ואוברקלוק את מתח השעון האנכי (בדרך כלל +4). לאחר מכן, הגדר את קריאת הפיקסל האופקי להגדרה המקסימלית שלה (30 MHz ב-16 ביט בדוגמה זו). כוונן את הגבר הקדם-מגבר ל-2 והגדר את יציאת המגבר להכפלת אלקטרונים. לבסוף, הגדר את רווח מכפיל האלקטרונים לרמה הגבוהה ביותר שלו.
2. הגדר את החשיפה ל-25 מילישניות. בחשיפה של 25 מילישניות, ודא שקצב הפריימים מעט ארוך יותר (25.802 מילישניות במצלמה המשמשת כאן).
3. כוון את עוצמת הלייזר כך שהאות יהיה ברור מעל הרקע.
   הערה: התאמת עוצמת הלייזר יכולה להיות מאתגרת. גבוה מדי, והגשושית מתבהרת מהר מדי; נמוך מדי, ויחס האות לרעש מקשה על המעקב. אנו ממליצים להגדיר את ההספק כך שהאות יעלה על הרקע פי 3-5 עבור החלקיקים עם האות החלש ביותר. סעיף 2 מסביר מדוע בהירות מולקולרית מראה התפלגות.
4. אסוף מספיק נתונים כדי לספק לפחות 1,000 רצועות לכל דגימה.

8. ניתוח מעקב

הערה: במעבדות שלנו, ניתוח מעקב של חלקיק בודד מתבצע בדרך כלל באמצעות סקריפטים מותאמים אישית ב-MATLAB המבוססים על עבודות של קרוקר וגרייר, ועברו שינויים על ידי המחברים ^3,26,27. להלן תיאור המשתמש ב-ImageJ, תוכנה חינמית לקהילת המחקר. שתי השיטות מניבות תוצאות זהות.

1. חתוך מערכי נתונים לגודל אחיד ואז תיקון רקע באמצעות ImageJ.
   הערה: אם הנתונים שנאספו זהים בין הקבוצות, אין צורך לחתוך נתונים. בדרך כלל זה נעשה רק אם אזור העניין זז בחיישן המצלמה בין אוספי הנתונים. יכולות ImageJ יכולות להיות מורחבות משמעותית עם תוספים. אפשרות אחת היא להתקין ולהשתמש ב-FIJI, שהוא ImageJ שמגיע עם סט תוספים סטנדרטיים. בין התוספים הללו נמצא TrackMate, שישמש את הפרוטוקול כאן^28,29.
   אתר הוויקי של ImageJ מציע מדריכים ודוגמאות לתוספים רבים. הוא כולל גם מדריכי וידאו.
2. בתוך FIJI, גררו ושחררו את הסרט או קובץ *.tif הערום לניתוח (ראו קובץ משלים 2).
3. הכירו את פרטי כיול הפיקסלים. בלשונית ניתוח , בחרו ב-Set Scale והחלו את כיול הפיקסל-למרחק עבור הכלי.
4. שמור עותק שלו כדי לעקוב אחרי שינויים מהמקור.
5. החסר את הרקע מהחלון הנבחר והחלו אותו על העותק השמור של הנתונים המקוריים. בלשונית התהליך , בחר חיסור רקע.
   הערה: זה יהיה מותאם בהתאם לנתונים. נקודת התחלה טובה היא להשתמש ב"כדור גלגול" שהוא גדול יותר מהחלקיקים המדומים בדימויים.
6. בלשונית התוספים , בחר מעקב | TrackMate. זה פותח את חלון הדיאלוג של TrackMate , שמנחה את המשתמש בתהליך המעקב.
   הערה: לאחר סיום המעקב, ניתן לייצא את המסלולים לניתוח נוסף מחוץ ל-ImageJ.

9. עיבוד נתונים

הערה: כאן נדון כיצד לעבד את הנתונים המייצגים וכיצד לחשב התפלגויות בגודל צעד ולקבל קבוע דיפוזיה ממוצע.

1. גרור ושחרר את ערימת התמונות לתוך FIJI; לאחר מכן, הפעיל את הכיול (74 ננומטר/פיקסל).
2. חיסור הרקע באמצעות חיסור כדור גלגול ברוחב של 5 פיקסלים. חותכים את השדה לארבעה מקטעים נפרדים בגודל 11 מיקרון על 11 מיקרון וניתחו בנפרד.
   הערה: הדבר נועד למזער כל שונות סף הנובעת משדה ההתרגשות בעת מעקב אחר חלבוני ממברנה.
3. תפעיל את תוסף TrackMate . ודאו שהכיול מיושם על הפיקסלים (ראו קובץ משלים 3) ושהזמן מכסה את הטווח הרצוי.
   1. ב-TrackMate, בחרו את הלפלסיאן של גאוסי (LoG) כשיטת גילוי החלקיקים, עם קוטר מוערך של 350 ננומטר באמצעות מסנן החציון לפני התהליך. לחץ על כפתור התצוגה המקדימה כדי לוודא שהחלקיקים שזוהו הם סבירים.
      הערה: חלק מהחלקיקים עשויים להיות ברקע בבירור; אל תדאגו לגבי אלה – הם יוסרו בשלב הבא.
   2. כשאתה מרוצה מהגדרות הספירה, תעבד את שאר הערימה, ואחריה סף. השתמש בסף אוטומטי או גרור את תיבת הבחירה כדי לכוון את הסף.
   3. לאחר בחירת אופן המחשה של החלקיקים שזוהו, בחרו בשיטת המעקב: Advanced Kalman Tracker עבור מאגר נתונים זה, עם ההגדרות הבאות: 350 ננומטר לרדיוסים החיפוש ופער מסגרת מקסימלי של 2 פריימים.
      הערה: ניתן גם להוסיף עונשים, פיצול מסלולים ומיזוג מסלולים. עבור מאגר נתונים זה, בוצע רק מעקב.
   4. החליטו איך לסנן ולהמחיש את המסלולים.
      הערה: במאגר נתונים זה מוצגים רק נקודות שזוהו (ראו קובץ משלים 4).
   5. לאחר עיבוד המסלולים הבודדים, יייצא את נתוני המעקב כקובץ XML לשימוש בתוכנת עריכת גיליונות אלקטרוניים (ראו קובץ משלים 5).

Results

כפי שמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול, ליזינים סומנו באמצעות אסטרים של NHS שמחוברים למולקולת צבע פלואורסצנטי (NHS-Dye). לאחר הצמיד לחלבון, מדוד את DOL באמצעות ספקטרומטר UV-Vis. לניסוי זה, DOL של טטראמרים של AQP4 היה 4.12. לאחר מכן, קבעו את ההסתברות שלכל טטרמר AQP4 יהיה לפחות מולקולת צבע אחת באמצעות התפלגות פואסון המובנת להלן.

(2)

כאשר P היא ההסתברות שכל AQP4 מסומן, באמצעות משוואה 2, ההסתברות שלכל טטרמר AQP4 יש תווית פלואורסצנטית מחוברת אליו היא 98%. התפלגות התוויות לכל טטראמר מוצגת באיור 2 ומשקפת את התפלגות הבהירות שנצפתה בדגימה.

יחס האות לרעש שהושג בדוגמה זו היה 8-9x מעל הרקע עבור פלואורופור יחיד ומעל 15-20 עבור החלקיקים הבהירים ביותר. שונות זו נובעת מהמיקום בקרן הגירוי ומה-DOL המתואר בפרוטוקול שלב 2.

בתוך קובץ ה-XML שנוצר, העמודות המעניינות הן J, K, L ו-M, המתאימות למזהה מספר החלקיק, המסגרת שבה זוהה החלקיק, מיקום X של החלקיק ומיקום Y של החלקיק בהתאמה (ראו קובץ משלים 6). בגיליון השני של הקובץ, מחושבים התפלגות גודל הצעד ומקדם הדיפוזיה הממוצע, כאשר גדלי הצעדים הם המרחקים שחלקיק נע בין מסגרות, והדיפוזיה הממוצעת ניתנת על ידי משוואה 3:

(3)

כאשר D_ave הוא מקדם הדיפוזיה הממוצע, ו-Δt הוא קצב הפריימים. משוואה זו מניחה תנועה בראוניאנית, אשר בדרך כלל תקפה עבור הזזות קטנות וניתן לאשרה על ידי ניתוח תזוזה ממוצעת בריבוע לעומת תג זמן מדגימה של מסלולים בודדים ^3,30,31.

היסטוגרמה של גדלי צעדים מציגה התפלגות של חלקיקים המתפזרים, שניתן לייחס לכך ש-OAPs בגדלים שונים (איור 5).

איור 1: מתקן ייבוש שומן. המכשיר מורכב מבקבוק עגול תחתית בנפח 10 מ"ל עם מחבר זיקוק ואקום. חנקן נכנס בלחץ נמוך דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרון עם מחט המחוברת למכסה סינתזה צהוב, שמחובר למחבר זיקוק ואקום. הלחץ משתחרר דרך צינור טייגון המחובר למזרק עם מחט חתוכה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: התפלגות צפויה של תוויות פלואורסצנטיות על כל יחידת AQP4 באמצעות משוואה 2. המספר הסביר ביותר של פלואורופורים הוא 4, ו-98% מכלל ה-AQP4 יהיו בעלי תווית פלואורסצנטית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: הרכבת מחזיק דגימה. המכלול עשוי מצינור עדשה SM1 בקוטר 1 אינץ', כאשר ההברגות הזכריות מוסרות ומשופעות כדי למנוע הפרעות למטרת המיקרוסקופ. כולל כיסוי קוורץ ואטם פרפילם. כל ההרכבה מאובטחת עם טבעת תמך SM1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: מיקרוסקופ. בצד ימין יש דיאגרמה מפושטת של המיקרוסקופ; הקו הירוק מראה את אור העירור שמגיע מהלייזר. מתחילים מימין, אור הלייזר עובר דרך צלחת גל של רבע מ"מ, ואז ממוקד על ידי עדשה בקוטר 300 מ"מ. האור מוחזר על ידי מראה דיכרואית ארוכה אל האובייקטיבי, שם הוא ממוקד בצמצם האחורי. באמצעות מראת תרגום להזזת קרן העירור, הקרן ממוקמת בקצה פתח המטרה, ויוצרת שדה מתחמק בדגימה. האור הנפלט בפוקוס נאסף על ידי המטרה ומיוצג על ידי הקו האדום. האור הנפלט עובר לאחר מכן דרך המסנן הדיקרואי, ואז דרך מסנן מעבר ארוך, וממוקד על ידי עדשה בקוטר 300 מ"מ אל המצלמה, המספקת הגדלה אופטית פי 1.7 (הגדלה כוללת של 170 פעמים מהעדשה האובייקטיבית ושל העדשה). בצד שמאל יש תמונה של המיקרוסקופ. יש לשים לב שמשתמשים במראות מסתובבות נוספות כדי למקם נכון את הלייזר. במקביל, זרוע הגילוי מסודרת כך שתמקסם את איסוף הפוטונים מחלבוני הממברנה המסומנים פלואורסצנטית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: היסטוגרמה של גדלי צעדים. הקו הכחול עם העיגולים האדומים הוא היסטוגרמה של כל גדלי הצעד. הקו השחור מתאים למקדמי דיפוזיה מרובים. התפלגות ההסתברות בגודל הצעד ניתנת על ידי: כאשר f_i היא האוכלוסייה השבריתית של כל סוג של חלקיק מפזר, בהנחה שכל אחד מהם עובר תנועה בראוניאנית. ההיסטוגרמה וההתאמה מציגים התפלגות הטרוגנית של חלקיקים נעים לאט ומהיר, המיוחסים להתפלגות של מספר גדלי OAP. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

קובץ משלים 1: מחשבון גיליון אלקטרוני המשמש לקביעת הרכבי mol%, כמויות שומן כוללות, ורכיבי פלואורסצנט/FRAP אופציונליים להכנת SUV. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 2: ערימת תמונות גולמיות של מיקרוסקופ פלואורסצנציה חד-מולקולי בשימוש במעקב מסלול (קובץ מקור למדריך TrackMate). אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 3: תצוגה מונפשת של נתוני פלואורסצנציה גולמיים של מולקולה אחת המציגה עוצמה ורקע לפני העיבוד. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 4: אנימציה של מסלולי חלקיקים מסוננים (לאחר סף) המציג מסלולי AQP4 מייצגים לאורך זמן. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 5: שכבת אנימציה המציגה מעקב מלא אחרי חלקיקים של מולקולות AQP4 באמצעות פלט TrackMate. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

קובץ משלים 6: גיליון אלקטרוני המציג את קואורדינטות המסלול שחולצו והתפלגויות גודל צעד מחושבות המשמשות לניתוח דיפוזיה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

Discussion

במאמר זה אנו מציגים שיטת מעקב של חלקיק יחיד לצפייה ישירה בחלבוני ממברנה בודדים כאשר הם נעים דרך ממברנת ליפידים דו-שכבתית הנתמכת על ידי מוצק ומתקשרים זה עם זה. AQP4 נבחר כדוגמה מייצגת בשל יכולתו ליצור הרכבות עצמיות דינמיות המוסדרות על ידי איזופורמות שונות 32,33,34. לעיל, אנו מציגים שיטה אמינה להכנת דגימה ופרמטרים מרכזיים למעקב אחר חלבוני ממברנה בודדים בטווחי זמן של מילישניות. השלבים כוללים: (1) הכנת רכבי שטח, (2) קביעת רמת התיוג הפלואורסצנטי המתאימה, (3) הכנת תומכים מוצקים, (4) יצירת דגימות חלבון טרנסממברנלי בתוך שכבה דו-צדדית נתמכת על ידי שומנים מוצקים, (5) הכנת סוכני אנטי-פייד, (6) בניית מיקרוסקופ מולקולה בודדת פשוט, (7) איסוף נתוני מעקב של מולקולה אחת, ו-(8) ניתוח נתוני המעקב באמצעות ImageJ.

השיטה המתוארת שלב אחר שלב היא פשוטה מבחינה רעיונית; עם זאת, לכל שלב קריטי יש מלכודות ומגבלות משלו. מבין אלה, הכנת הדוגמאות היא המאתגרת ביותר (שלבים 1-5). לכן, יש לזכור כמה פרטים. הראשונה היא כיצד ליצור שכבת ליפידים מוצקה עם תמיכה מוצקה. ישנן שלוש שיטות עיקריות: (1) לנגמייר-בלודג'ט (LB), (2) מיזוג וקרע של רכבי שטח, ו-(3) ציפוי סיבוב 35,36,37,38,39. לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות. לדוגמה, שיטת לנגמייר-בלודג'ט מספקת שליטה רבה יותר על התכונות וההרכב הכימי של שכבות בילו, כולל הרכבים אסימטריים בין שני העלים, ומאפשרת יצירת רב-שכבות באופן מבוקר. עם זאת, שימוש ב-LB-trough הוא טכנית תובעני, גוזל זמן ויקר להשגת³⁵. ציפוי ספין הוא טכניקה פשוטה יחסית ליצירת דו-שכבות שומן; עם זאת, הוא נוטה לייצר רב-שכבות ודורש עודף גדול של חומר, לעיתים כמות לא מעשית³⁹. היתוך וקרע של ווסיקולות הם תהליכים פשוטים שדורשים רק כמות קטנה של חומר. עם זאת, יצירת משטח הידרופילי היא קריטית, וחלק מהרכבי הליפידים יוצרים דו-שכבות דרך מיזוג וזיקולות בקלות רבה יותר מאחרות (למשל, במעבדתנו מצאנו ששלכוניות עם מטען שלילי נטו יוצרות דו-שכבות דרך מיזוג ווסיקולות רק עם הוספת קטיון דו-ערכיים וזמני דגירה מוארכים)⁴⁰. מלבד הקמת משטח הידרופילי (שלב 3), שיקולים חשובים נוספים בעת יצירת שכבה דו-צרימתית נתמכת על ידי מוצק באמצעות מיזוג ווסיקולות כוללים שטיפת השכבה הבילית החדשה לפני ואחרי שילוב חלבון הממברנה. שטיפה לפני ההחדרה מסירה עודפי SUV וווסיקולות רב-למלריות גדולות (MLVs), בעוד שהשטיפה הסופית לאחר הכנסת הממברנה מנקה חלבון לא משולב. שטיפה לא מספקת עלולה לגרום לאותות רקע במהלך מחקרי מעקב.

בדקנו אבקים רבים כדי לקבוע אם הם מתאימים להחדרת חלבון טרנסממברנלי לתוך שכבות ליפידים תומכות מוצק, כולל C12E9, Tween-20, TritonX-100 ועוד רבים. הדטרגנט המועדף עלינו הוא DOTM כי הוא קל להסרה והוא הכי עדין על הממברנה (פחות סביר שיפגע בשלמות הממברנה). כמות החלבון שמוסיפה היא קריטית. יותר מדי, ויהיה בלתי אפשרי לצפות בקטעים בודדים. כאשר מתאימים את ההליך לחלבוני ממברנה אחרים, יש להתאים את הכמות באמצעות ניסוי וטעייה. עם זאת, הכמויות הניתנות בתהליך זה הן נקודת התחלה מצוינת. כמות חומר הניקוי חייבת להישמר בריכוז המיסלרי הקריטי או מתחת לו; אחרת, השכבה הדו-שכבתית תמוסס ותוסר מהמצע הקוורץ.

הכנסת חלבוני ממברנה לשכבת הליפידים הנתמכת צריכה להיות מותאמת לכל קבוצת תנאים ניסיוניים. עם זאת, קיימות כמה שיטות נפוצות להשגת זאת, כולל שימוש בפרוטאוליפוזומים ושילוב ישיר של חלבוני ממברנה בשכבה דו-שכבתית⁴¹ מוקדמת. פרוטאוליפוזום הוא ליפוזום, כמו SUV, שבו חלבון מוטמע. פרוטאוליפוזומים אלו יכולים להתמזג עם שכבת ליפידים מוצקה שנוצרה מראש או להשתלב בו-זמנית עם רכבי השטח במהלך יצירת שכבות⁴². המיזוג גורם לקרע, ומשחרר את החלבון אל הממברנה. זה פשוט ליישום, אך הוא גורם לכיוון אקראי של חלבוני הממברנה. זה יכול להוביל לאינטראקציות חזקות עם התמיכה המוצקה, מה שמוביל לתכונות דיפוזיה שונות בהתאם לכיוון החלבון³. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת בשילוב ישיר, ומניבה העדפה אוריינטלית לחלבוני AQP4 וחלבוני ממברנה אחרים עם דומיינים הידרופיליים גדולים בצד אחד של החלבון 2,5,43,44.

תצפית ישירה היא כלי עוצמתי המשמש בגילויים מדעיים. הדמיה דינמית של מולקולה בודדת חשובה במיוחד בביופיזיקה של ממברנה-חלבון, שבה תצפית על תנועה ואינטראקציות של חלבונים בודדים משמשת לבחינת השערות או ליצירת השערות חדשות שמתארות טוב יותר כיצד חלבון מתנהג. הפרוטוקול והשיטות המתוארים כאן אידיאליים לדו-ממדיות דו-ממדיות הנתמכות על ידי שומנים מוצקים, אך ניתן להרחיב אותם לסביבות מורכבות יותר עם רכיבים^{מרובים 2}, תאים חיים 34,45,46,47, ותלת-ממדים⁴⁸. מעקב במולקולה בודדת פותח דלת לניסויים רבים נוספים, כולל מעקב דו-צבעי עם מולקולה^{אחת 49}, FRET^50,51 חד-מולקולי, ודימות דינמי ברזולוציה על-דינמית כגון מיקרוסקופיית שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ו-Point Accumulation Imaging Nanoscale Topography (PAINT). על ידי הרחבת המכשיר לכלול בקרת טמפרטורה, ניתן גם לחקור את התכונות התרמודינמיות של חלבוני ממברנה 26,43,52.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4 גל	Thorlabs	WPQ05M-633	תוודא להתאים את הלייזר
מטרה נפט 100X	אולימפוס	12-563-659	1.45 N/A אפוכרומטי
16:0-18:1 PC	ליפידים פולריים של Avanti	850457	פוספוליפידים של POPC
18:0 PEG2000 חינוך גופני	ליפידים פולריים של Avanti	880210	מלח אמוניום
עדשת 300 מ"מ	Thorlabs	AC254-300-A-ML
633 ננומטר He:Ne לייזר	מלס גריוט	05-LHP-927	ניתן לשנות אותו למקורות אחרים, ולאורכי גל אחרים
מסנן פס 633nm	כרומה טק	633/10X	התאמה ללייזר שבו משתמשים
מסנן מעבר ארוך 655nm	כרומה טק	ET655lp	שינוי כדי להתאים לאורכי הגל של הצבע/לייזר
אנדור סוליס הראשון	אנדור	אנדור סוליס הראשון	תוכנה ללכידת תמונות
ATTO 655	אטו-טק	655 לספירה	שינוי NHS-Ester, ניתן להשתמש בכל צבע עם שינוי המתאים לעבודה על מולקולה בודדת. מומלץ להשתמש ב-ATTO אך ניתן להשתמש ב-Cy5/7
שרף SM-2 Bio-beads	BioRad	1523922
כלוריד סידן	מיליפור סיגמא	C4901
קטלאז	סיגמא-אלדריץ'	C3155-50MG	מכבד בקר, המסה מימית, ≥ 30,000 יחידות למ"ג
כלורופורם	פישר סיינטיפיק	C547-1	HPLC או דרגת ספקטרוסקופית
כולסטרול	סיגמא-אלדריץ'	C8667-500MG
כיסויי כיסוי	ESCO אופטיקס	R525000	קוורץ 25 מ"מ
מפצל קרן דיכרואי	סמרוק	FF545/650-Di01-25x36	שינוי כדי להתאים לאורכי הגל של הצבע/לייזר
מצלמת EMCCD	אנדור	iXon Ultra 888
צינורות פלקון 15 מ"ל	גריינר ביו-וואן	188261	צינורות תרבית תאים של סלסטאר
גלוקוז אוקסידאז	סיגמא-אלדריץ'	G2133-50KU	מ-Aspergillus niger, טיפר VII, ועוד; 100000 יחידות/גרם מוצק (ללא תוספת חמצן)
אקדח חום	הארבור פריט	56434	בשימוש בחימום הפרפילם, בדרך כלל ניתן להשתמש בכל אקדח חום
HEPES	ביוריאגנטים של פישר	BP310-500
שמן אוטופלואורסצנציה נמוכה	Thorlabs	MOIL-30
מתונל	פישר סיינטיפיק	A452-1	HPLC או דרגת ספקטרוסקופית
צינור מיקרו צנטריפוגה	VMR	525-1126	1.5 מ"ל
מיקרו פיפטרים	אפנדורף		מגוונים; 1000 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L ו-10 ומיקרו; L מומלץ
Ø צינורות עדשה בקוטר 1.5"	Thorlabs	SM1.5L10	החוט החיצוני מגולח לצורך הכנת דגימה
טבלה אופטית	ניופורט	RPR Reliance	גודל הטבל תלוי במרחב הזמין
רקמות אופטיות	Thorlabs	MC-50E	ניקוי רכיבים שונים
פאראפילם	מיליפור סיגמא	P7669	לוודא שאין פלואורסצנט מגזים במהלך התהליך
מפעיל פיזו	ניופורט	PZA12
מבודדי רטט פנאומטיים	ניופורט	סדרת I-2000	משמש לייצוב הטבלה האופטית לכל אי-אחידות
אמבטיה מקוררת	פישר סיינטיפיק	איזוטמפ 3016
בקר תריס	Thorlabs	SC10	מקושר לתוכנת ההדמיה
כלוריד נתרן	מיליפור סיגמא	S988
מסנן סטריטופ	מיליפור סיגמא	S2GPT05RE
דרייבר ובקר תיבת מתגים	ניופורט	PZC200	בקר במה
מסנן מזרק	ג'יי.טי. בייקר	SF01-98	PES 25 מ"מ 0.2 ומיקרו; M
אלמנט TEC	Thorlabs	TEC3-2.5	משמש לחיבור משאבת החום של פלטיר למחזיק הדגימה ולקולר המטרה
קונטלר טמפרטורה	מירסטטר הנדסה	TEC-1091
גלאי טמפרטורה	Thorlabs	TH100PT
תרמיסטור	Thorlabs	TH10K
Tube-O-Dialyzer	G Biosciences	786-611	4K MWCO
מנקה אוזון UV	נובסקן	PSDP_UV	סדרת פרו - דיגיטלית
זום אופטיקס	Thorlabs	SM1NR1