הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל קו-קולטורה מתקדם של מחסום נוזל דם-מוח-שדרה אנושי לניתוח נפרד של אקסוס כורואיד, אפיתליום ואנדותליום

429 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/69275

⸱

28 בנובמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

במאמר זה

סיכום

הוקמה קו-קולטורה של תאי אפיתל ותאי אנדותל אנושיים של מקלעת הכורואיד ליצירת מודל מתקדם במבחנה של מחסום נוזל הדם-מוח-שדרה. אנו מתארים את הבידוד הנפרד של אפיתל ואנדותל להכנת RNA וניתוח שעתוק בתנאים נבחרים.

תקציר

הפלקסוס הכירואידי (CP), הממוקם במערכת החדר של המוח, מורכב ממספר רכיבים מבניים, כולל אפיתל קובייתי ואנדותליום מחובר, והוא מיקום מחסום הנוזל הדם-מוח-שדרה (BCSFB). כדי לחקור את ה-CP במבחנה, ניתן להעלות על הדעת מספר מערכות תרביות תאים שונות. מודל מסנן תרבית תאים הפוכה עם פונקציית מחסום חזקה, המבוסס על תאי פפילומה CP אפיתלית אנושית (HIBCPP), הוקם במעבדתנו ומשמש בהרחבה. לאחרונה הצלחנו ליצור קו תאי אנדותל של CP אנושי יציב ומונצח (iHCPEnC). בשילוב שני קווי התאים, הרכבנו מודל מתקדם מסוג תאים דו-תאיים שפיתח פונקציית מחסום מוגברת יותר בהשוואה לתאי HIBCPP בלבד. מכיוון שמודל זה מייצג גם את האפיתל של CP וגם את האנדותליום, הוא מאפשר לחקור את האינטראקציה בין שני סוגי התאים בתנאים מסוימים, כגון זיהום, דלקת או אחרים. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטות להקמת מודל דו-תאי זה עם הפרדה מאוחרת של תאי האפיתל והאנדותל לניתוחים שעתוקיים. אנו מתארים פריימרים של PCR ייחודיים לאפיתל ואנדותליום, אשר משמשים לזיהוי זיהום צולב אפשרי בין שני סוגי התאים. כדי לחקור השפעה אפשרית של אנדותליום CP על האפיתל במודל זה בתנאים דלקתיים, נותחו רמות הביטוי של גנים נבחרים בהקשר של טיפול בליפופוליסכרידים (LPS) בחלק התאים של HIBCPP. המודל המתקדם של CP במבחנה והאפשרות לנתח בנפרד תגובות אפיתליות ואנדותליות מהווים עניין משמעותי במחקר על תהליכים תאיים הכוללים פונקציות ביולוגיות ופתולוגיות של ה-CP.

מבוא

מקלעת הכורואיד (CP) היא קונגלומרט כלי דם מאוד של אוכלוסיות שונות של תאים הממוקמים בכל ארבעת חדרי המוח. בין שאר הפונקציות הוא משמש כמחסום פיזיולוגי, המחסום הנוזלי הדם-מוח-שדרה (BCSFB), בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) לדם, ומונע מהמוח, למשל, חומרים זיהומיים שמסתובבים בדם. ה-CP מורכב מסוגי תאים שונים, כולל תאים אפיתל מקוטבים, המכילים חיבורים הדוקים והדביקות, וכן דסמוזומים, היושבים על ממברנה בסיסית. פני תאי האפיתל מוגדלים על ידי נוכחות מיקרוווילים על פני השטח הלומינליים. נימי אנדותל מחובנים, מוקפים ברקמות חיבור כמו פיברובלסטים ותאי חיסון, ממוקמים מתחת לממברנת הבסיס 1,2,3. לאחרונה דווח שתאי אנדותל של CP מסוגלים לשפר את שלמות ה-BCSFB יחד עם תאי האפיתל ולכן עשויים למלא תפקיד בהגנה על המוחבמהלך תהליכים דלקתיים.

עד כה, התרבית ההפוכה של תאי פפילומה אפיתל של CP (HIBCPP) היא המודל הנפוץ ביותר במבחנה לחיקוי BCSFB אנושי עם ערכי התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית גבוהים (TEER) ופונקציית מחסום חזקה. כדי להבין טוב יותר את תפקודי התאים ולהימנע מניסויים בבעלי חיים, חשוב להפיק כמה שיותר מידע מניסויים במבחנה. קו התאים האנדותליאלי האנושי הראשון (iHCPEnC) הוקם לאחרונה במעבדתנו 6,7. בעזרת תאי HIBCPP ו-iHCPEnC אנו מסוגלים להרכיב מודל קו-קולטורה במבחנה המדמה את BCSFB בצורה מתקדמתיותר. באמצעות מודל דו-תאי זה, יכולנו להראות כי הקו-קולטורה של תאי HIBCPP ו-iHCPEnC מובילה לעלייה בערכי TEER בהשוואה לתאי HIBCPP בלבד. חשוב לציין ש-iHCPEnC לבדו אינו מפתח TEER 7,8. הכנה נפרדת וניתוחים נוספים של שני סוגי התאים המשמשים במודל זה יאפשרו לנו לחקור את האינטראקציה שלהם בתנאים בריאים וחולים.

כאן אנו מתארים שתי גישות שונות להשגת מטרה זו. הבסיס הוא שבשני המקרים הגישה מבוססת על מודל תרבית התאים ההפוכה של תאי HIBCPP (איור 1). שיטה 1, שיטת "קו-קולטורה ישירה", כוללת את שני התאים על הכנסת מסנן אחת. תאי HIBCPP גדלים בצורה הפוכה לפני זריעת iHCPEnC בצורה סטנדרטית 7,8. שיטה 2, תרבית "ממברנה-בהכנסה", כאן הוספנו ממברנה נפרדת עם אותן תכונות כמו זו שבאינסרטים המסננים. הממברנה הנוספת הזו מוכנסת לתוך סינון שבו תאי HIBCPP כבר גדלים בתרבות הפוכה. iHCPEnC מוזרעים על הממברנה הנוספת באופן תרבית סטנדרטי.

הפרדה מאוחרת של התאים לצורך ניתוח RNA מאפשרת תובנות לגבי התגובה השעתוקית של אפיתל CP ואנדותליום בתנאים נבחרים. אנו מתארים פריימרים של PCR ספציפיים לתאי HIBCPP ו-iHCPEnC שמאפשרים אישור של הפרדה מוצלחת ונקייה של שני סוגי התאים. לאחר טיפול בליפופוליסכריד (LPS), אנו משתמשים במודלים המתוארים כדי לחקור את התגובות השונות של אפיתל ה-CP בנוכחות האנדותליום בתנאים דלקתיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תאי HIBCPP

הערה: להלן אנו מתארים את התרבית והתחזוקה של תאי HIBCPP, וכן את הכנת מסנני תרבית תאים הפוכה עם תאי HIBCPP. פרוטוקול זה נועד לצמיחת תאי HIBCPP על מסנני תרבית תאים של 12 בארות. פרוטוקול מפורט עם וידאו נלווה לתרבית תאי HIBCPP על מסנני תרבית תאים עם 24 בארות פורסם בעבר9.

  1. לקיחת תאי HIBCPP לתרבית
    1. הפשרה של בקבוקון תאי HIBCPP בטמפרטורת החדר (RT).
    2. החזירו את תכולת הבקבוקון עם 10 מ"ל מדיום DMEM/HAMS-F12 המכיל 10% סרום שוק עוברי (FCS) ו-5 מיקרוגרם אינסולין למ"ל של מדיום מחומם מראש (10% מדיום HIBCPP).
    3. הכניסו את תאי ה-HIBCPP שהוחזרו לתוך בקבוק תרבית תאים T75 ודגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.
    4. שנה את המדיום של הבקבוקון כדי להסיר את ה-DMSO 24 שעות אחרי הזרעה של התאים.
    5. תרב את התאים עד ל-90% התנגשות, שלב זה לוקח בערך שבועיים. החלף את המדיום פעמיים בשבוע.
  2. תרבית רציפה של תאי HIBCPP
    הערה: לתרבית רציפה, חלקו תאי HIBCPP ביחס 1:3 לבקבוקי תרבית תאים T75 חדשים.
    1. הסר את מדיום התרבות מהבקבוקון T75.
    2. שטוף תאים פעם אחת עם 10 מ"ל של PBS.
    3. הסר את ה-PBS.
    4. נתק תאי HIBCPP בעזרת 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-אדטה. שלב זה נמשך כ-10-20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הבקבוקון בינתיים כדי להבטיח כיסוי מלא של שכבת התא ב-Trypsin-EDTA.
    5. הוסיפו 7 מ"ל של מדיום HIBCPP וצנטריפוגה ב-50 x גרם למשך 10 דקות ב-RT.
    6. החזירו את כדור התא ל-30 מ"ל של מדיום HIBCPP 10% והתפשטו ל-3 בקבוקי T75 חדשים.
    7. תרב את התאים עד 90% קונפלוקציה; התאים יגיעו למפגש תוך כשבוע.
    8. החלף את המדיום פעמיים בשבוע.
      הערה: תאי HIBCPP אינם מעוכבים גדילה; לכן, הבקבוקון יהפוך למזל, והתאים ימשיכו לגדול וליצור רב-שכבות.
  3. זריעה של תאי HIBCPP בתרבות הפוכה
    1. הסר את מדיום התרבות מהבקבוקון T75.
    2. שטוף תאים פעם אחת עם 10 מ"ל של PBS.
    3. הסר את ה-PBS.
    4. נתק תאי HIBCPP בעזרת 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-אדטה. שלב זה נמשך כ-10-20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הבקבוקון בינתיים כדי להבטיח כיסוי מלא של שכבת התא ב-Trypsin-EDTA.
    5. בינתיים, הכן את תוספות המסנן. הפוך מסננים עם 12 בארים בכיוון הפוך לפלטת תרבית תאים עם 6 בארות בעזרת מלקחיים ומלא אותן במדיום HIBCPP מחומם מראש עם 10%. הרטיב מראש את הממברנה עם טיפה של מדיום מעל כל מסנן.
    6. החזירו תאים טריפסיניים עם 17 מ"ל של מדיום HIBCPP של 10%.
    7. צנטריפוגה ב-50 x גרם למשך 10 דקות ב-RT וכוון את תאי HIBCPP לריכוז של 1 ×10 6 תאים/מ"ל.
      הערה: תאי HIBCPP נוטים ליצור אגלומרטים קטנים. אין צורך להמיס אותם לחלוטין לפני הזרעה על מסננים. ודא ש-90% מהתאים הם יחידים.
    8. זרעי HIBCPP תאי HIBCPP הפוך על מסננים עם 12 בארות בצפיפות של 4 ×-105 תאים להכנסה.
    9. חכו עד שהמתלה של התא ייספג על ידי הממברנה. סגור את המכסה של לוח תרבית התאים עם 6 בארות.
    10. הכניסו את הלוחות עם ההוספות ההפוכות לתוך האינקובטור.
    11. 24 שעות לאחר הזריעה, סובבו את ההכנסות בעזרת מלקחיים לכיוון הנכון לפלטת תרבית תאים חדשה עם 12 בארים. שים 2 מ"ל של 10% HIBCPP בתא התחתון ו-1 מ"ל לתא העליון.
    12. השאירו את התאים ל-5 עד 6 ימים ללא שינוי בינוני, והתחילו בקביעת TEER והקמת קו-קולטורציה.

2. קביעת TEER

הערה: קביעת ערכי TEER מתבצעת בעזרת MilliCell ERS2 ואלקטרודת אכילה. מדידת ריק מהקלטות מסנן תרבית תאים במדיום ללא תאים (אוהםריק) נדרשת לחישוב.

  1. שמור את אלקטרודת הצ'ופסטיק יבשה. לפני תחילת המדידה, שים את האלקטרודה ב-80% אתנול למשך 10 דקות לחיטוי.
  2. לאחר מכן, שטוף את האלקטרודה עם PBS.
  3. התחלת המדידה: הכניסו את הקצה הארוך של האלקטרודה לתוך הבאר ואת הקצה הקצר של האלקטרודה לתוך הכנסת המסנן המכיל את התאים הזרועים.
  4. רשום את ערך האוהם של מסנן תרבית תאים עם 12 בארות (דגימת אוהם).
  5. חשב את ה-TEER כך: אוהם·ס"מ2 = (דגימת אוהם -אוהם ריק) × 1.1 ס"מ2.
  6. לאחר סיום המדידה, שוטפים את האלקטרודה ב-80% אתנול ואז שמרו יבש.
    הערה: בין מדידות של תנאים ניסיוניים שונים או מדידות של קווי תאים שונים, יש לחטא ולשטוף את אלקטרודת הצ'ופסטיק באמצעות PBS כדי למנוע זיהום צולב.

3. iHCPEnC

  1. הכנסת iHCPEnC לתרבות
    1. הפשיר בקבוקון של iHCPEnC ב-RT.
    2. החזירו את תכולת הבקבוקון עם 5 מ"ל מחוממים מראש של מדיום אנדותליאלי קלאסי מלא (מדיום iHCPEnC).
    3. צנטריפוגה ב-500 גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    4. בינתיים, ציפוי בקבוק תרבית תאים T25 ב-2 מ"ל של גורם חיבור למשך כדקה. שאפו את פקטור ההתקשרות והשאירו את הבקבוקון עד לזריעת ה-iHCPEnC.
    5. החזירו את כדור התא עם 5 מ"ל מדיום iHCPEnC והכניסו אותו לבקבוק תרבית תאים T25 מוכן.
    6. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 למשך שבוע ללא שינוי מדיום.
  2. תרבית רציפה של iHCPEnC
    הערה: לתרבית רציפה, חלק iHCPEnC 1:4 לבקבוקי תרבית תאים T25 חדשים.
    1. הסר את מדיום iHCPEnC ושוטף תאים פעם אחת עם 3 מ"ל PBS. היזהר להימנע מניתוק תאים.
    2. שאפו את ה-PBS.
    3. נתק את ה-iHCPEnC המשולב בעזרת 1 מ"ל של טריפסין-EDTA. השלב הזה לוקח בערך 3-5 דקות ב-RT.
    4. החזירו את התאים ל-5 מ"ל של מדיום iHCPEnC.
    5. צנטריפוגה ב-500 גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    6. בינתיים, ציפוי 4 בקבוקי T25 חדשים עם 2 מ"ל פקטור חיבור לכל בקבוקון.
    7. החזירו את כדור התא עם 20 מ"ל מדיום iHCPEnC.
    8. חלק 5 מ"ל מתליית התא לכל אחד מארבעת הבקבוקים המוכנים.
    9. שוב, תרב את התאים למשך שבוע ללא שינוי במדיום. הם יגיעו למפגש תוך שבוע.
      הערה: תאי iHCPEnC מעכבים גדילה; לכן, הבקבוקון יהפוך למפגש אחד עם זה, והתאים הנותרים יצפו.

4. הכנות לניסויי קו-קולטורה

  1. שיטה 1: עבור "קו-קולטורציה ישירה" (גידול האפיתל ותאי האנדותל משני צידי הכניסה אחת), אין להכין דברים נוספים.
  2. שיטה 2: בשיטת "ממברנה בהכנסה", בצע את השלבים הבאים:
    1. להוציא ממברנות בגודל של מסנן תרבית תאים באורך 12 בארות בעזרת ברזל מחורר מס' 11 (בקוטר 11 מ"מ) מממברנת Din-A-4 נפרדת.
    2. שים ממברנות מנוקבות לתוך צלחת פטרי.
    3. חטא ממברנות מנוקבות למשך 60 דקות באמצעות אור אולטרה סגול (UV-C, 254 ננומטר).
      הערה: ממברנות בגודל של מסנן תרבית תאים של 12 בארות מנוקבות ומעוטרות יכולות להיות מוכנות מראש ומאוחסנות בתנאים סטריליים.

5. הקמת הקו-קולטורה

הערה: בשלב זה, תאי HIBCPP כבר מוכנים למודל תרבית חוץ-גופית מסוג שני תאים. תאי HIBCPP גדלו במשך 5 עד 6 ימים (השווה שלבים 1.3.8-1.3.12). תאי HIBCPP אמורים להתחיל לפתח TEER (כ-20 אוהם·ס"מ 2).

  1. לשניהם, שיטה 1 ("קו-קולטורציה ישירה") ושיטה 2 ("ממברנה-בהכנסה"), מחליפים את מדיום 10% HIBCPP ב-1% HIBCPP. למטרה זו, יש להכניס 2 מ"ל מדיום HIBCPP 1% לבאר של לוח תרבית תאים של 12 בארות.
  2. רוקן את התרבית ההפוכה המכילה את המכנס המסנן בעזרת פיפטה ומלקחיים, והכניסו את המכנס לכיוון סטנדרטי בתוך באר 12 המוכנה.
  3. לשיטה 2 ("ממברנה בהכנסה"), הכינו את הכנסות המסנן כך:
    1. הכניסו את הממברנה המחוררת והמעוקרת לתוך מסנן מוכן עם 12 בארות עם תאי HIBCPP בתרבות הפוכה בעזרת מלקחיים.
  4. החזר את לוחות תרבית התאים לאינקובטור לצורך טריפסיניזציה של iHCPEnC (מתואר בשלב 6).

6. זריעה וגידול של iHCPEnC בקו-קולטורה

הערה: בסעיף הבא מתוארת הקמת קו-קולטורה של תאי HIBCPP ו-iHCPEnC על מסנני תרבית תאים עם 12 בארות. פרוטוקול מפורט לקו-קולטורציה של תאי HIBCPP ו-iHCPEnC על מסנני תרבית תאים עם 24 בארות תואר קודם לכן8. לפני ניתוק iHCPEnC, חשב כמה תאים נדרשים לביצוע הקולטורטורה. בקבוק תרבית תאים T25 אחד מספק כמות משוערת של 5 ×-10-5 תאים.

  1. הסר את המדיום של בקבוק T25 שמכיל iHCPEnC.
  2. שטוף iHCPEnC עם 3 מ"ל PBS. הימנע מניתוק התאים.
  3. הסר את ה-PBS.
  4. נתק את ה-iHCPEnC המשולב בעזרת 1 מ"ל של טריפסין-EDTA. השלב הזה לוקח בערך 3-5 דקות ב-RT.
  5. החזירו את התאים לבקבוק של 5 מ"ל/T25 עם מדיום iHCPEnC.
  6. ספר את התאים בתא נויבאואר.
  7. צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  8. החזירו את כדור התא לריכוז סופי של 1 × 105 תאים/מ"ל במדיום iHCPEnC.
  9. גם שיטה 1 ("קו-קולטורציה ישירה") וגם שיטה 2 ("ממברנה בהכנסה"): זרע 700 מיקרוליטר iHCPEnC (7x105 תאים) בתוספת מסנן עם 12 בארות.
  10. יש לעקוב לראשונה אחרי ערכי TEER של הקו-קולטורה ושל הביקורת (כלומר, תרביות תאי HIBCPP ותרביות iHCPEnC בלבד) לראשונה 24 שעות לאחר זריעת iHCPEnC ולאחר מכן ביום.

7. טיפול ב-LPS

הערה: תרביות משותפות אמורות להציג ערכי TEER גבוהים יותר בהשוואה לתרביות תאי HIBCPP בלבד (גורם מומלץ: 1.5 ומעלה).

  1. למדוד ולרשום ערכי TEER של תרביות תאים שהוקמו לניסויים.
  2. הכינו תערובת מאסטר המכילה 5 מיקרוגרם/מ"ל LPS במדיום HIBCPP של 1%.
  3. הכינו לוחות חדשים עם 12 בארות המכילות 2 מ"ל מדיום HIBCPP 1% לכל באר.
  4. רוקן את התוספות בעזרת מלקחיים ופיפטינג.
  5. הניחו תוספות בתוך הבארות המוכנות.
  6. הוסף 1 מ"ל של תערובת ה-LPS הראשית או 1% מדיום HIBCPP, בהתאמה (בקרה שלילית).
  7. דגרו במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  8. למדוד ולרשום ערכי TEER לפני המעבר לסעיף 8.

8. בידוד RNA מתאי HIBCPP ו-iHCPEnC לניתוח שעתוק מאוחר יותר

הערה: כדי להשיג שני חלקי תאים נפרדים ולמנוע זיהום צולב מתאים שגודלו במודל הקו-קולטורציה, מגרדים בזהירות את חלקי התא מההוספה בנפרד. בצע את כל שלבי בידוד ה-RNA עבור כל הכנסת מסנן ללא הפסקה (האינסרטים אינם מורשים להתייבש).

  1. שטוף מסננים פעם אחת עם PBS. למטרה זו, יש להכין לוחות תרבית תאים של 12 בארות המכילים 1.5 מ"ל PBS לבאר.
  2. רוקן את מסנני תרבית התאים בעזרת פיפטה ומלקחיים. הניחו את התוספות לפלטת תרבית תאים 12 בארות הממולאת ב-PBS.
  3. הוסף 1 מ״ל PBS לתוך האינסרטים.
  4. להכנת תאי iHCPEnC ו-HIBCPP לשיטה 1 ("קו-קולטורציה ישירה"), יש לבצע את השלבים הבאים:
    1. הסר את ה-PBS מהאינסרט והנח אותו בלוח תרבית תאים ריק ויבש עם 12 בארים.
    2. בעזרת קצה פיפטה ופיפטור של 10-20 מיקרוליטר PBS, ה-iHCPEnC מנותקים מהאינסרט על ידי גירוד.
    3. הניחו את חלק התא הזה בצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 350 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA. פיפט למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים כראוי עם בופר הליזה של ה-RNA.
    4. לאחר סיום הקציר של שבר iHCPEnC, הפוך את התוספת כלפי מעלה אל תוך מכסה צלחת תרבית התאים.
    5. הוציאו תאי HIBCPP מהממברנה בדיוק כמו שבר iHCPEnC, והניחו אותם בצינור מוכן בנפח 1.5 מ"ל המכיל 350 מיקרוליטר של RLT-β-מרקפטואתנול.
      הערה: אם מוכנים מספר קו-תרביות למצב אחד, יש לקחת 350 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA לכל הכניסה וחלק של התא. חלקי תא מוכנים בודדים של מצב מסוים מסוים מטוהרים ברצף על אותה עמודה.
  5. כדי להכין תאי iHCPEnC ו-HIBCPP לשיטה 2 ("ממברנה בהחדה"), יש לבצע את השלבים הבאים:
    1. הוציאו את הממברנה הנוספת בעזרת מלקחיים והכניסו אותה למכסה יבש של צלחת תרבית תאים עם 12 בארים. פיפט 100 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA על הממברנה לצורך פירוק iHCPEnC.
    2. הניחו את 100 מיקרוליטר ליזאט זה בצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 250 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA וערבבו היטב.
    3. הסר את ה-PBS מהפילטר והנח אותו כלפי מטה לתוך המכסה של פלטת תרבית תאים עם 12 בארים. הוסיפו 100 מיקרוליטר של בופר ליסיס RNA אל ממברנת ההכנסה ומחלקים את חלק תא ה-HIBCPP.
    4. הניחו את הליזאט של 100 מיקרוליטר לצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 250 מיקרוליטר של בופר ליזיס RNA.
  6. בצע בידוד RNA בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  7. מדוד את כמות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
  8. בצע שעתוק הפוך וניתוח qPCR של דגימות RNA כפי שתואר על ידי היצרן.
    הערה: מכיוון שהתרביות המשותפות מכילות כמויות קטנות יותר של iHCPEnC בהשוואה לתאי HIBCPP, נדרשות מספר מסננים של 12 בארות לבידוד מספיק RNA מ-iHCPEnC, בהתאם לניתוח הבא. יש לאגד את הליזטים של האינסרטים השונים של המסננים. ניתן לבצע שעתוק הפוך ו-qPCR כפי שתואר קודם6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את היצירה שלב אחר שלב של מודל דו-תאי של ה-CP האנושי הכולל אפיתל (תאי HIBCPP) ואנדותל (iHCPEnC) על מסנני תרבית תאים, כפי שמוצג סכמטית באיור 1. במערכת מודל זו, תאי HIBCPP גדלים בצורה הפוכה בצד התחתון של המסנן, בעוד ש-iHCPEnC זורעים או בצד העליון של המסנן של האינסרט או במסנן שני המונח מעל הממברנה של האינסרט.

ערכי TEER של מודל מסוג שני תאים
לאחרונה הראינו כי קו-קולטורציה של תאי HIBCPP עם iH...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ה-CP האנושי מורכב ממספר סוגי תאים שונים, כולל אפיתל יוצר מחסום ואנדותליום של כלי הדם המורחבים3. למרות שתאי האנדותל של ה-CP מסודרים, מחקרים עדכניים הוכיחו את תרומתם לתפקוד המחסום ב-BCSFB 4,7. כדי לחקור את האינטראקציות המורכבות בין האנדותל לאפיתל באיברים כ-CP, נדרשים מודלים מתקדמים במבחנה המאפשרים ניתוח של שני סוגי התאים2.

כאן אנו מתארים פרוטוקול ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ביניהם ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies 25200056
12 באר לוחית תרבית תאים StarLabCC7682-7512
12 מסנני באר (3 ומיקרו; M נקבוביות)גריינר ביו וואן665631
צלחת תרבית תא 24 באר StarLabCC7672-7524
הוספת מסנן 24 בארות  (0.4 ומיקרו; M נקבוביות)גריינר ביו וואן662641
תוספת מסנן 24 בארות (3 ומיקרו; M נקבוביות)גריינר ביו וואן662631
צלחת תרבית תאים 6 באר  StarLabCC7682-7506
ערכת סינתזת cDNA של AffinityScript (סינתזת cDNA)אג'ילנט600559
גורם ההיקשרותמערכות תאים4ZO-500חלק מהערכת הבינונית האנדותלית הקלאסית המלאה.
Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (PCR בזמן אמת)אג'ילנט600828
אלקטרודת צ'ופסטיקמיליפורMERSSTX01מוצר זה הופסק.
מדיום אנדותל קלאסי מלא (מדיום iHCPEnC)מערכות תאים4ZO-500ערכה, המכילה מדיום, תוספים ופקטור חיבור לציפוי.
DMEM/F-12 (1:1) עם פנולרד (10% HIBCPP בינוני)תרמו פישר31330-038
DMEM/F-12 (1:1) ללא פנולרד (1% HIBCPP בינוני)תרמו פישר11039-021
סרום עגל עוברי (FCS) (1% ו-10% HIBCPP בינוניים)תרמו פישר10270-106
אינסולין (1% ו-10% HIBCPP בינוניים)סיגמאI9278
ליפופוליסכריד (LPS)סיגמאL3024
MilliCell ERS2 מיליפורMERS00002מוצר זה הופסק.
ננודרופ (ספקטרופוטומטר)תרמו-סיינטיפיקND1000מוצר זה הופסק.
ברזל מחורר מס' 11Wü rth880223211
PBSLife Technologies 14190169
כלי עיצוב פריימרNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
מקדמים סיגמאVC00021
Qiagen RNeasy microקיאגן74004
RLT+b-ME (חלק מערכת המיקרו של Qiagen Rneasy)קיאגן74004
בקבוק תרבית תאים T25סארסטדט AG & Co KG83,39,10,002
בקבוק תרבית תאים T75סארסטדט AG & Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 סמ"ק (ממברנה נפרדת)סאבוSK4580
אור UVקארל רות'H469.1

מקורות

  1. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiol Rev. 93 (4), 1847-1892 (2013).
  2. Schwerk, C., Schroten, H. In vitro models of the choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier: advances, applications, and perspectives. Hum Cell. 37 (5), 1235-1242 (2024).
  3. Ghersi-Egea, J. F., et al. Molecular anatomy and functions of the choroidal blood-cerebrospinal fluid barrier in health and disease. Acta Neuropathol. 135 (3), 337-361 (2018).
  4. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  5. Carloni, S., Rescigno, M. Unveiling the gut-brain axis:structural and functional analogies between the gut and the choroid plexus vascular and immune barriers. Semin Immunopathol. 44 (6), 869-882 (2022).
  6. Denzer, L., et al. Transcriptome and functional comparison of primary and immortalized endothelial cells of the human choroid plexus at the blood-cerebrospinal fluid barrier. Int J Mol Sci. 26 (4), 1779(2025).
  7. Muranyi, W., et al. Immortalized human choroid plexus endothelial cells enable an advanced endothelial-epithelial two-cell type in vitro model of the choroid plexus. iScience. 25 (6), 104383(2022).
  8. Herold, R., et al. Protocol for the setup and use of a human choroid plexus endothelial-epithelial two-cell-type in vitro model. STAR Protoc. 3 (4), 101816(2022).
  9. Dinner, S., et al. A choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side. J Vis Exp. (111), e54061(2016).
  10. Herold, R., et al. Capsule-dependent impact of MAPK signalling on host cell invasion and immune response during infection of the choroid plexus epithelium by Neisseria meningitidis. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 53(2021).
  11. Bernd, A., et al. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plexus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. 32 (9), 2973-2982 (2015).
  12. Dabbagh, F., Schroten, H., Schwerk, C. In vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier and their applications in the development and research of (neuro)pharmaceuticals. Pharmaceutics. 14 (8), 1729(2022).
  13. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nat Rev Neurosci. 16 (8), 445-457 (2015).
  14. Zhang, W. Y., Liu, Y., Zhang, H. Extracellular matrix: an important regulator of cell functions and skeletal muscle development. Cell Biosci. 11 (1), 65(2021).
  15. Clark, A. J., et al. Functional imaging in microfluidic chambers reveals sensory neuron sensitivity is differentially regulated between neuronal regions. Pain. 159 (7), 1413-1425 (2018).
  16. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  17. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: from descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), eaal2379(2017).
  18. Furtado, A., et al. Circadian rhythmicity of amyloid-beta-related molecules is disrupted in the choroid plexus of a female Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci Res. 101 (4), 524-540 (2023).
  19. Borkowski, J. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving IκBζ in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  20. Wiatr, M., et al. Distinct migratory pattern of naive and effector T cells through the blood-CSF barrier following Echovirus 30 infection. J Neuroinflammation. 16 (1), 232(2019).
  21. Speidel, A., et al. Transmigration of Trypanosoma brucei across an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier. iScience. 25 (4), 104014(2022).
  22. Haas, J., et al. The choroid plexus is permissive for a preactivated antigen-experienced memory B-cell subset in multiple sclerosis. Front Immunol. 11, 618544(2020).
  23. Nishihara, H., et al. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 3(2020).
  24. Erb, U., Schwerk, C., Schroten, H., Karremann, M. Review of functional in vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier in leukaemia research. J Neurosci Methods. 329, 108478(2020).
  25. Ho, K. H., et al. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 27 (1), 106-122 (2025).
  26. Wagenaars, F., et al. Characterization of thyroid hormone transport in a human choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP) as an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier model. Mol Cell Endocrinol. 597, 112449(2025).
  27. Di Tommaso, N., Santopaolo, F., Gasbarrini, A., Ponziani, F. R. The gut-vascular barrier as a new protagonist in intestinal and extraintestinal diseases. Int J Mol Sci. 24 (2), 1470(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אנדותל הפלקסוס כורואידליתאי HIBCPPתאים אנדותליאליים מומתריםתפקוד מחסוםמודל אין ויטרוניתוח ביטוי גניםטיפול בליפופוליסכריד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.