מאמר שיטה

מידול מחלות מיטוכונדריאליות באמצעות אורגנואידים במוח: התמקדות באנצפלומיופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ

DOI:

10.3791/69303

⸱

10 באוקטובר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים במוח משמשים כמודל רב ערך למחקרי אנצפלומיופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ (MELAS), מציעים תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה הבסיסית שלהם ומספקים פלטפורמה לסינון תרופות. אורגנואידים שמקורם בקווי תאים עם רמות שונות של הטרופלזמיה של גנים גורמי מחלות מציגים הבדלים פנוטיפיים משמעותיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנצפלומיופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ (MELAS) הן הפרעות מיטוכונדריאליות הנגרמות לרוב על ידי וריאנט m.3243A>G ב-tRNALeu המיטוכונדריאלי. כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של MELAS, יצרנו אורגנואידים במוח מקווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מרובים (iPSC) שמקורם בחולה עם MELAS הנושא את גרסת m.3243A>G. קווים אלה חולקים רקע גנטי גרעיני זהה אך נבדלים ברמות ההטרופלזמה שלהם הכוללות את וריאנט m.3243A>G. ראינו הבדלים משמעותיים בגודל האורגנואידים, המורפולוגיה ויעילות האינדוקציה העצבית, אשר היו בקורלציה עם מידת ההטרופלזמה. נוירונים מנותקים מהאורגנואידים הועברו למערכת תרבית דו-ממדית, שהיא נוחה ומתאימה לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה. האורגנואידים הראו גם הבדלים משמעותיים בהיווצרות רשתות עצביות, בהתאם לרמות ההטרופלזמה. התוצאות שלנו מצביעות על כך שמודלים אורגנואידים מבוססי iPSC שמקורם בחולה מייצגים פלטפורמה שימושית לחקר מנגנוני MELAS ולבדיקת תרופות. סרטון זה מציג שיטות מקיפות וידידותיות למשתמש, כולל פרוטוקולים ליצירת אורגנואידים והערכת פנוטיפים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיופתיה מיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ (MELAS) הן מחלות מיטוכונדריאליות המאופיינות בתפקוד נוירולוגי לקוי, אפיזודות דמויות שבץ ותסמינים מערכתיים שונים. הסיבה השכיחה ביותר היא וריאנט m.3243A>G בגן tRNA לאוצין מיטוכונדריאלי MT-TL11. מאמינים כי וריאנט זה פוגע בשינוי הטאורין באנטיקודון, ובכך מפחית את יעילות תרגום הלאוצין ותורם לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה ב-MELAS 2,3,4. יש לציין כי דווח על שיפורים בתסמינים לאחר מתן טאורין במינון גבוה 5,6. עם זאת, נוכחותם של לא מגיבים מצביעה על כך שמנגנונים פתופיזיולוגיים נוספים, שעדיין לא זוהו, עשויים לתרום למחלה אצל אנשים המכילים את וריאנט m.3243A>G.

כדי להבהיר את מנגנוני המחלה הנגרמים על ידי וריאנטים גנטיים, אידיאלי להשתמש במודלים ניסיוניים שבהם כל המשתנים זהים למעט הווריאנט הסיבתי, מה שמאפשר השוואות פנוטיפיות מדויקות. קווי תאים ערוכים בגנום ומודלים של בעלי חיים עם וריאנטים מתוקנים משמשים לעתים קרובות כבקרות להפרעות גנטיות גרעיניות. עם זאת, תיקון וריאנטים של mtDNA נותר מאתגר מבחינה טכנית, אפילו עם טכנולוגיות מתקדמות לעריכת גנום7. לכן, הקמת מודלים ניסיוניים עם רקע גרעיני זהה נותרה מאתגרת. כדי לטפל בבעיה זו, השתמשנו בשני קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) שמקורם באותו חולה עם MELAS הנבדלים רק ברמות ההטרופלזמה שלהם (כלומר, שיעור ה-DNA המיטוכונדריאלי הנושא את MT-TL1 m.3243A>Gגרסה 8), ויצרנו אורגנואידים במוח כמודל מחלה. למרות שרמות ההטרופלזמה יכולות להשתנות במהלך מעבר או התמיינות של תאים, מה שעלול להשפיע על פנוטיפים ולגרום לשונות מאצווה לאצווה בתוצאות הניסוי, תאים שמקורם בחולה הנושאים וריאנטים של גנים מיטוכונדריאלים נשארים בעלי ערך לחקירת פתוגנזה של מחלה.

במחקר זה, יצרנו אורגנואידים במוח מ-iPSCs שמקורם בחולה עם MELAS וחקרנו את הפתופיזיולוגיה שלהם כדי להבין טוב יותר את מנגנוני המחלה. באמצעות שני קווי iPSC עם רמות הטרופלזמה גבוהות ונמוכות, ראינו הבדלים משמעותיים ביעילות האינדוקציה העצבית, אשר היו בקורלציה עם מידת ההטרופלזמה. הממצאים שלנו מצביעים על כך שאורגנואידים במוח מבוססי iPSC שמקורם בחולה מספקים פלטפורמה רבת ערך להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס MELAS ולהקלה על בדיקת תרופות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שני קווי ה-iPSC (2-6 ו-2-8) נגזרו מאותם פיברובלסטים של מטופל MELAS בשיטות מבוססותהיטב 8. הם נבדלים זה מזה רק ברמות ההטרופלזמה שלהם. קו 414C2 iPSC שנוצר מאדם בריא שימש כביקורת. הפרוטוקול ששימש במחקר זה פעל בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קיטסאטו (#G22-02).

1. תרבית תאים

  1. הפשרת מלאי תאים קפואים
    1. הכינו צלחות 6 בארות על ידי ציפוי בלמינין על פי הוראות היצרן.
    2. יש לחמם את מדיום התרבית עבור iPSCs ללא מזין המכילים מעכב ROCK של 10 מיקרומטר ל-37 מעלות צלזיוס.
    3. הוציאו את בקבוקון ה-iPSC הקפוא ממיכל החנקן הנוזלי (LqN2) והפשירו במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    4. העבירו את המתלה המופשר ל -10 מ"ל של מדיום שחומם מראש. צנטריפוגה בחום של 120 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס).
    5. הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה בעדינות את הגלולה על ידי הקשה על הצינור. הוסף תאי מדיום וזרע טריים לצלחות של 6 בארות מצופות מראש בלמינין. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה עם 5% CO2.
  2. שינוי בינוני
    1. החלף את המדיום (ללא מעכב ROCK) כל 1-2 ימים.

2. יצירת אורגנואידים מוחיים

  1. התחלת התמיינות (יום 0)
    1. הסר את המדיום מצלחות התרבית iPSC (~70-80% קונפלואנט). שטפו תאים עם PBS.
    2. מוסיפים תמיסת אנזים ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הוסף מדיום כדי לעצור את התגובה. העבירו תאים לצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה בחום של 190 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס).
    4. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום התמיינות המכיל מעכב ROCK של 30 מיקרומטר, SB431542 של 5 מיקרומטר ו-2.5 מיקרומטר IWP-2.
      הערה: המדיום הבסיסי זהה לזה ששימש בשלב 1.1.2.
    5. ספור את התאים. זרע 3 × 103 תאים ב -100 מיקרוליטר לבאר בלוחות בצורת U, 96 בארות, עם חיבור נמוך. דגירה במשך 6 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  2. שינוי בינוני (יום 6)
    1. העבירו אורגנואידים (משלב 2.1.5) מצלחת של 96 בארות לצלחת של 10 ס"מ באמצעות פיפטה רחבת קידוח. הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום (DMEM/F12 עם 1% N2, 1% תחליף גלוטמין 1% NEAA, 2.5 מיקרומטר IWP-2, 5 מיקרוגרם/מ"ל הפראן סולפט ו-1% PS) לכל באר של צלחת חדשה של 96 בארות.
      הערה: השתמש בפיפטות רחבות קידוח לאורך הניסויים בעת העברת אורגנואידים כדי למנוע שיבוש המבנה התלת-ממדי שלהם. בנוסף, פיפטות בעלות 8 ערוצים מועילות לביצוע ניסויים במהירות ובדייקנות.
    2. אוספים אורגנואידים לצינורות של 2 מ"ל. הסר בזהירות את המדיום כדי לא לשאוב את האורגנואידים והוסף 1.5 מ"ל DMEM/F12. חזור על הפעולה 3 פעמים כדי לשטוף את האורגנואידים.
    3. הסר את המדיום והוסף 500 מיקרוליטר של מדיום טרי לצינורות עם אורגנואידים. מעבירים את כל האורגנואידים לתבנית בגודל 10 ס"מ, ואז מוסיפים 5 מ"ל בינוני כדי להקל על איסוף כל אורגנואיד.
    4. הרם אורגנואיד בודד באמצעות מיקרופיפטה המותאמת ל -50 מיקרוליטר והעביר אותו לבאר אחת של צלחת 96 בארות. חזור על הפעולה עד שכל האורגנואידים מועברים לצלחת 96 הבארות (נפח סופי 100 מיקרוליטר). דגירה למשך 3 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  3. שינוי בינוני (יום 9)
    1. (אופציונלי) העבירו אורגנואידים לכלי בגודל 10 ס"מ בעת שימוש בפיפטות בעלות 8 ערוצים. דלג על שלב 2.3.1 בעת שימוש במיקרופיפטות חד-ערוציות והמשך לשלב 2.3.2.
    2. אוספים אורגנואידים לצינורות של 2 מ"ל. שטפו 3x עם DMEM/F12 כשלב 2.2.2.
    3. השהייה במדיום התמיינות (1:1 DMEM/F12 ונוירו-בזאלי) המכיל 1% N2, 2% B27 ללא ויטמין A, 100 מיקרומטר 2-מרקפטואתנול (ME), 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 1% תחליף גלוטמין, 0.5% NEAA ו-1% תמצית ממברנת הבסיס.
      הערה: הכינו כמויות קטנות של תמצית קרום הבסיס לשימוש חד פעמי ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד הצורך. מפשירים את התמצית ב-4 מעלות צלזיוס מבלי לאפשר לה לעלות על 8 מעלות צלזיוס, ואז מערבבים אותה למדיום קר ומחממים את המדיום בטמפרטורת החדר למשך כ-30 דקות.
    4. מעבירים ~ 10 אורגנואידים לבאר לצלחת של 6 בארות. התאם את הנפח הסופי של המדיום למשך 1 באר עד 2 מ"ל. תרבית סטטית במשך 6 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  4. שינוי בינוני (יום 15)
    1. אוספים אורגנואידים לצינורות של 15 מ"ל. השאירו את הצינור ללא הפרעה עד שכל האורגנואידים התייצבו. הסירו את הסופרנטנט והוסיפו מדיום התמיינות טרי (זהה לשלב 2.3.3 אך עם B27 + ויטמין A).
      הערה: בדרך כלל, אורגנואידים מתיישבים בתחתית הצינור ללא צנטריפוגה. עם זאת, אורגנואידים קטנים שמקורם ב-iPSCs של מטופלים עשויים שלא לשקוע ביעילות. במקרה כזה, צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 120 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את האורגנואידים.
    2. מעבירים ~ 10 אורגנואידים לבאר לצלחת של 6 בארות. תרבית סטטית במשך 15 יום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    3. יש להחליף את המדיום כל 5-7 ימים עד ליום ה-30.

3. דיסוציאציה של אורגנואידים מוחיים לתרבית דו-ממדית (יום 30)

  1. ציפוי לוחות עם פולי-L-אורניתין (PO)
    1. הכן תמיסת מלאי PO על ידי המסת 10 מ"ג PO ב-66.7 מ"ל של H2O והכין מכסות קטנות לשימוש חד פעמי. אחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    2. יש לדלל את תמיסת מלאי ה-PO 1:5 עם H2O ולצפות את צלחות התרבית בתמיסה המדוללת. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  2. ציפוי למינין
    1. הסר את PO ושטוף בארות 3 x 5 דקות עם PBS.
    2. יש להוסיף למינין (1:1,000 ב-PBS) ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות או למשך הלילה.
      הערה: תמיסת המלאי של למינין היא 1 מ"ג/מ"ל. מכינים מנות קטנות ושומרים בחום של -80 מעלות צלזיוס עד הצורך.
  3. דיסוציאציה לנוירונים בודדים
    1. יש להפשיר את תמיסת הדיסוציאציה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני השימוש.
    2. העבירו אורגנואידים לצינור של 15 מ"ל והשאירו את הצינור ללא הפרעה עד שכל האורגנואידים התייצבו. יש להסיר את ה-supernatant ולהוסיף 5 מ"ל PBS לשטיפת אורגנואידים.
    3. לאחר הסרת PBS, יש להוסיף 1 מ"ל תמיסת אנזים ופיפטה בעדינות פי 1-2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; פיפטה מספר פעמים. במידת הצורך יש לדגור למשך 2-3 דקות נוספות. פיפטה שוב לדיסוציאציה מוחלטת.
    4. צנטריפוגה בחום של 200 × גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מ"ל של תמיסת פיזור ופיפטה.
    5. תמיסת בידוד שכבות מתחת וצנטריפוגה ב -200 × גרם למשך 5 דקות.
    6. מוסיפים 1 מ"ל של מדיום עצבי (נוירובזאלי עם 1% B27, 0.25% תחליף גלוטמין, 1% PS) ומערבבים. העבירו את המתלה דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל.
    7. ספור את התאים. תאי זרעים בגודל 1 × 105 תאים/סמ "ר על צלחות מצופות PO/laminin. יש להחליף את המדיום כל 4-7 ימים עד ליום ה-60.

4. קצירת תאים ואורגנואידים לאנליזה תאית ומולקולרית

  1. קיבוע אורגנואיד לאימונופלואורסצנציה (יום 30)
    1. קציר אורגנואידים (שלב 2.4.3) למיקרו-צינורות.
    2. הסר את המדיום בזהירות כדי לא לשאוב אורגנואידים, והוסף 1 מ"ל PBS לשטיפת אורגנואידים.
    3. הסר PBS בזהירות כדי לא לשאוב אורגנואידים, והוסף 4% פרפורמלדהיד (PFA) לקיבוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. שטפו 3 פעמים עם PBS.
    5. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. איסוף אורגנואידים עבור RT-qPCR (יום 30)
    1. העבר אורגנואידים (שלב 2.4.3) למיקרו-צינורות. שטפו עם PBS כמתואר בשלב 4.1.2.
    2. הוסף מאגר ליזה והקפיא בחנקן נוזלי (LqN2). יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. קיבוע תאים לאימונופלואורסצנציה (יום 60)
    1. הסר את מדיום התרבות והוסף PBS לשטיפת תאים.
    2. יש לקבע ב-4% PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הסר PFA והוסף PBS לשטיפת תאים. חזור על שלב זה 3 פעמים.
    4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

5. RT-qPCR

  1. חלץ RNA כולל מאורגנואידים לפי הוראות יצרן הערכה.
  2. סנתז cDNA מ-1 מיקרוגרם של סך RNA שהוכן בשלב 5.1 על פי הוראות יצרן הערכה בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר.
  3. בצע PCR כמותי באמצעות הפריימרים הבאים: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. הגדר את הריכוז הסופי עבור כל תגובה באופן הבא: תערובת מאסטר פלואורסצנטית 1x, פריימר קדימה 0.25 מיקרומטר, פריימר הפוך 0.25 מיקרומטר. נפח התגובה הכולל הוא 15 מיקרוליטר, כולל 0.2 מיקרוליטר cDNA משלב 5.2. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
  4. נרמל את ביטוי FOXG1 ל-ACTB כבקרה הפנימית.

6. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. דגרו אורגנואידים (יום 30) ב-10% סוכרוז למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 30% סוכרוז למשך ≥3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. הרכיבו אורגנואידים במדיום הטבעה והכינו קריוסטט (10 מיקרומטר) באמצעות קריוסטט. אחסן חלקים על כוסות החלקה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. הסר את אמצעי ההטבעה על ידי שטיפת PBS (2 x 5 דקות).
  4. חדיר ב-0.3% PBST למשך 10 דקות. שטפו עם PBS.
  5. יש לחסום 10% סרום עיזים רגיל ב-0.1% PBST למשך שעה. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים: anti-FOXG1 (1:200), anti-TUBB3 (1:500-1:1,000). שטפו 3 פעמים עם PBS.
  6. דגירה עם נוגדן משני (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) למשך שעה. שטפו 3 פעמים עם PBS.
  7. הר והתבונן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

7. ניתוח הטרופלזמה

  1. קצרו iPSCs באמצעות מגרדי תאים והעבירו למיקרו-צינורות. הוסף 0.5 מ"ל PBS וצנטריפוגה בחום של 100 × גרם למשך 5 דקות. הסירו את ה-supernatant והמשיכו לשלב 7.2.
  2. חלץ את ה-DNA הכולל לפי הוראות יצרן הערכה.
  3. הגדר את הריכוז הסופי עבור כל תגובת PCR: תערובת מאסטר פלואורסצנטית 1x, פריימר קדימה 0.25 מיקרומטר, פריימר הפוך 0.25 מיקרומטר. נפח התגובה הכולל הוא 15 מיקרוליטר, כולל 50 ננוגרם של ה-DNA הכולל משלב 7.2. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. רצפי פריימר הם כדלקמן: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ חלוץ: gccaggaggtcttcgctgta; FBXO15_ הפוך: aatgcacggctagggtcaaaa.
  4. השתמש בערכי מחזור סף כדי לחשב את מספר עותק ה-DNA המיטוכונדריאלי (מוטנטי לעומת סוג בר).
  5. מנרמל למספר עותק הגן הגרעיני FBXO15 .

8. הערכת גודל וצורת האורגנואידים

  1. צלם תמונות של אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ בפורמט TIFF.
  2. מדוד גודל ומעגליות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח. פתח את קבצי ה-TIFF שנשמרו בשלב 8.1 על-ידי לחיצה על קובץ | פתח ובחר את הקובץ. בחר בחירות ביד חופשית ועקוב אחר האורגנואיד. לאחר מכן לחץ על נתח | למדוד. ערכי השטח והמעגליות בתוצאות שימשו לניתוח בשלב 8.3.
  3. נתח את הנתונים על ידי ביצוע מבחן t כדי להעריך אם ישנם הבדלים משמעותיים בהשוואה לקווי הבקרה באמצעות תוכנה סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצרנו אורגנואידים במוח וערכנו תרביות עצביות דו-ממדיות באמצעות פרוטוקול פשוט יחסית עם שינויים קלים המבוסס על Nakamura et al.9 (איור 1). בפרוטוקול הקודם נעשה שימוש בלוחות 96 בארות בצורת V, ואילו במחקר זה השתמשנו בלוחות חיבור נמוכים בצורת U עם 96 בארות כדי לאפשר לתאים להצטבר באופן טבעי במרכז כל באר. באמצעות קו iPSC בקרה בריא 414C2, הצלחנו לגרום לאורגנואידים במוח שמכילים תאי עצב חיוביים ל-FOXG1 ביום ה-30 (איור 2A,D,E) ורש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים המושרים מתאי גזע עובריים אנושיים (ESCs) / iPSCs מייצגים מודלים מבטיחים של מחלות עקשניות נדירות, בעוד שיצירת אורגנואידים במוח דורשת בדרך כלל תקופות תרבית ממושכות הנמשכות מספר חודשים10 ושימוש בציוד יקר, כגון מיכל מהונדס המערבב ללא הרף את מדיום התרבית ושומר על תנאים יציבים לתרבית תאים תלת מימדית ארוכת טווח. במחקר זה, ביססנו אורגנואידים במוח תוך פרק זמן קצר באמצעות ציוד תרבית תאים סטנדרטי. באמצעות iPSCs שמקורם בחולה עם MELAS הנושא את וריאנט ה-DNA המיטוכונד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

414C2 iPSCs התקבלו מ-RIKEN BRC. התמיכה במימון ניתנה על ידי JSPS KAKENHI (24H00648 ל-M.F., 23K08971 ל-CS) ו-AMED Translational Research Network Program (25yf0126001j002 ל-M.F). עבודה זו נתמכה על ידי מלגה של שירות החילופין האקדמי הגרמני (DAAD) ל-F.B.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית תאים באורך 10 ס"מקורנינג353003
משטח חיבור נמוך במיוחד עם לוח 6 בארותקורנינג3471
70 & mu; מסננת תא Mקורנינג352350
אקוטאזנקלאי טסקה12679-54אנזימים המשמשים לפירוק iPSCs
תוספת B27תרמופישר סיינטי17504001
תוסף B27 ללא ויטמין Aתרמופישר סיינטי12587010
β-מרקפטואנול (2-ME)סיגמאM3148להשליך לפי כללי המוסד.
לוחות מרובי לוחות באר 6 של Cell Culture 6קורנינג353046
טיפ לחיסכון תאיםBMBio ECOBMT-200Wקצה פיפט רחב-קוטר
מגרדי תאיםסומיטומו בקליטקו, בע"מ.MS-93100
מיקרוסקופ קונפוקליצייסLSM710
קריוסטטלייקהCM3050
עכבר תרבות למינין 1R& D3400-010-02משמש לציפוי לוחות לתרביות דו-ממדיות של נוירונים מפורקים
DMEM/F12פוג'יפילם וואקו פיור כרמיקל קו.042-30795
מדיום הרכבה פלואורסצנטידאקוS302380-2מדיום הרכבה
נוגדן FOXG1אבקאםab196868
גלוטמקסתרמופישר סיינטי35050061
נוגדן משני נגד עכבר IgG (H+L) עם ספיג מוצלב מאוד, אלקסה פלואר פלוס 488תרמופישר סיינטיA32723
נוגדן משני מסוג עז אנטי-ארנב IgG (H+L) עם ספיג מוצלב מאוד, Alexa Fluor Plus 555תרמופישר סיינטיA32732
סולפט הפארן (HS)סיגמאH7640
ערכת RNA ל-cDNA בקיבולת גבוההתרמופישר סיינטי4387406משמש לסנתזת cDNA מ-RNA
Hoechst 33258תרמופישר סיינטיH3569
ImageJגרסה 1.52aמשמש למדידת גודל ומעגליות של אורגנואידים
משי iMatrix-511Takara Bio Inc.892021ציפוי לצלחות לתרבות iPSC
אינסוליןפוג'יפילם וואקו פיור כרמיקל קו.  090-06481
IWP2Tocris Bioscience3533
קיינס BZ-X810קיינסBZ-X810משמש לצילום תמונות עבור איור 3A
LSM710קרל צייס AGמיקרוסקופ קונפוקלי
LSM980קרל צייס AGמיקרוסקופ קונפוקלי
LUNA Universal qPCR Master Mixניו אינגלנד ביולאבסM3003
מטריג'לקורנינג354277
תוספת N2תרמופישר סיינטי17502001
מדיום נוירובסיסיתרמופישר סיינטי21103049
פתרון דיסוציאציה של נוירונים פוג'יפילם וואקו פיור כרמיקל קו.291-78001
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)נקלאי טסקה06344-56
סרום רגיל של עזJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
נונקלון ספרה 96-באר, מיקרופלטה בצורת U שטופלה בספרה של נונקלוןתרמופישר סיינטי174929
פאראפורמלדהיד (PFA)נקלאי טסקה09154-85להשליך לפי כללי המוסד.
PBSנקלאי טסקה14249-24
PBSנקלאי טסקה27575-31
פניצילין/סטרפטומיצין (PS)נקלאי טסקה26253-84
פולי-אל-אורניתין (PO)סיגמאP3655
פוליאוקסיאתילן(10) אוקטילפניל אתר (טריטון)פוג'יפילם וואקו פיור כרמיקל קו.168-11805
PRISM GraphPadגרסה 9.5.0
ערכת מיני-DNA של QIAamp QIAGEN51304משמש לחילוץ DNA מלא
ערכת מיני RNeasyQIAGEN74104משמש להפקת RNA מלא
SB-431542קיימן כימיקל13031
משקפי סליידMATSUNAMICRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02Nמדיום המשמש לתרבות של iPSCs לא מובחנים ומהתמיינות מיום 0 עד יום 6
סוקרוזהפוג'יפילם וואקו פיור כרמיקל קו.196-00015
Tissue-Tek O.C.T. תרכובתסאקורה פינטק יפן בע"מ.4583מדיום הקפאה
נוגדן TUBB3פרומגהG712A
Y27632פוג'יפילם וואקו פיור כרמיקל קו.030-24021מעכב סלעים
זןקרל צייס AG2.3SP1 (מהדורה שחורה)תוכנה לניתוח התמונות שצולמו   עם מיקרוסקופ קונפוקלי (LSM710)
זןקרל צייס AG2.6 (מהדורה כחולה)תוכנה לניתוח התמונות שצולמו   עם מיקרוסקופ קונפוקלי (LSM980)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
  6. Ohsawa, Y., et al. Taurine supplementation for prevention of stroke-like episodes in MELAS: a multicentre, open-label, 52-week phase III trial. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 90 (5), 529-536 (2019).
  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
  9. Nakamura, M., et al. Pathological progression induced by the frontotemporal dementia-associated R406W tau mutation in patient-derived iPSCs. Stem Cell Rep. 13 (4), 684-699 (2019).
  10. Pagliaro, A., Artegiani, B., Hendriks, D. Emerging approaches to enhance human brain organoid physiology. Trends Cell Biol. 35 (6), 483-499 (2025).
  11. Kodaira, M., et al. Impaired respiratory function in MELAS-induced pluripotent stem cells with high heteroplasmy levels. FEBS Open Bio. 5, 219-225 (2015).
  12. Homma, K., et al. Taurine rescues mitochondria-related metabolic impairments in the patient-derived induced pluripotent stem cells and epithelial-mesenchymal transition in the retinal pigment epithelium. Redox Biol. 41, 101921(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MELASRT qPCR

מאמרים קשורים