מנגנון מולקולרי של הידרוקסיל חריע צהוב A בדלקת מפרקים ניוונית בברך באמצעות אפנון אוטופגיה באמצעות עיכוב מסלול HIF-1α/BNIP3

כמצב אורטופדי כרוני נפוץ, דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) משפיעה על אנשים בגיל העמידה וקשישים, ומשפיעה באופן משמעותי על איכות חייהם ^1,2. למרות הופעתו הנרחבת, האטיולוגיה המדויקת והמנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס KOA נותרו לא מובנים לחלוטין. יתר על כן, הן למניעה והן לטיפול מרפא מדגיש את הדחיפות לחשוף את היסודות הפתולוגיים המורכבים של מצב זה. תחום אחד של עניין מתעורר הוא תפקידה של אוטופגיה בהומאוסטזיס סחוס, עם עדויות מצטברות המצביעות על כך שאוטופגיה מופחתת בתוך רקמת הסחוס תורמת לניוון שלה ב-KOA ^3,4.

לאוטופגיה, תהליך פירוק תאים החיוני לשמירה על הומאוסטזיס תאי, יש חשיבות רבה בתחזוקה ותיקון של סחוס. במיקרו-סביבה ההיפוקסית הנפוצה בתוך סחוס מפרקי, מסלול האיתות של גורם היפוקסיה 1α (HIF-1α)/אדנו-וירוס E1B 19 kDa אינטראקציה חלבון 3 (BNIP3) מתגלה כמווסת מרכזי של אוטופגיה. ביטוי מוגבר של HIF-1α נצפה בחולי KOA, מה שמצביע על כך שחוסר ויסות של מסלול זה עשוי לתרום לפגיעה באוטופגיה ולניוון הסחוס לאחר מכן ^5,6,7.

דיקור, מוקה, צמחי מרפא ועיסוי הן ארבע שיטות קלאסיות של הרפואה הסינית המסורתית לטיפול בדלקת מפרקים בברך. הטיפולים הנוכחיים, כגון תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות, זריקות חומצה היאלורונית וניתוח מפרקים, הוכחו כמועילים אך קשורים גם^{לתופעות} לוואי מסוימות. יתר על כן, אין טיפול שגרתי מומלץ לדלקת מפרקים ניוונית בברך. עם הזמן, כטיפול משלים נפוץ ל-KOA, הרפואה הסינית המסורתית (TCM) פיתחה תרופות צמחיות רבות המבטיחות בטיפול ב-KOA⁹. בין אלה, הידרוקסיל חריע צהוב A זכה לתשומת לב משמעותית בשל תכונותיו האנטי דלקתיות ומווסתות האוטופגיה^10,11. עם זאת, המנגנונים המדויקים שבאמצעותם HSYA מפעיל את השפעתו הטיפולית על דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA), במיוחד במונחים של ויסות אוטופגיה דרך מסלול HIF-1α/BNIP3, נותרו לא ברורים. לכן, אנו חוקרים את מנגנון ההשפעות הטיפוליות של HSYA ב-KOA על ידי התמקדות בהשפעתו על אוטופגיה של כונדרוציטים והאינטראקציה שלו עם מסלול HIF-1α/BNIP3. אנו משערים כי HSYA מפחית דלקת מפרקים ניוונית בברך על ידי שיפור האוטופגיה וההתפשטות של כונדרוציטים תוך דיכוי אפופטוזיס ודלקת באמצעות עיכוב מסלול HIF-1α/BNIP3.

כל ההליכים הכוללים דגימות אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים העממי המרכזי של ג'נג'יאנג (אישור מס. KY-YS-2021-09). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המשתתפים לפני איסוף הדגימה. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. מטופלים ועיצוב המחקר

גויסו שלושים חולים שאובחנו עם דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) ועברו ניתוח מפרק ברך מלא. הקבוצה כללה 14 גברים ו-16 נשים, בגילאי 52-75 שנים (ממוצע ± SD: 64.3 ± 12.6 שנים), כולם עומדים בקריטריונים של הקולג' האמריקאי לראומטולוגיה^{KOA 12}. מטופלים לא נכללו אם קיבלו תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות או סטרואידים תוך שבועיים לפני הניתוח או זריקות תוך מפרקיות תוך חודש אחד.

2. תרבית כונדרוציטים ראשונית

הסחוס המפרקי נאסף בתנאים סטריליים מיד לאחר הניתוח והוכנס ל-PBS קר. באמצעות אזמלים סטריליים, הסחוס נחתך לשברים של ~1 מ"מ מעוקב על לוח זכוכית קר כקרח והועבר לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA. הצינור הודגר באמבט מים רועד של 37 מעלות צלזיוס ב-80 סל"ד למשך 30 דקות והפך בעדינות כל 5 דקות כדי להקל על העיכול. הסופרנטנט נשאב, וכדור הרקמה נשטף פעם אחת עם PBS וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן הכדור הושעה מחדש ב-10 מ"ל של 0.02% קולגנאז מסוג II ועוכל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות עם טלטול. המתלים הועברו למעלה ולמטה כל 30 דקות כדי לקדם דיסוציאציה, הועברו דרך מסננת של 70 מיקרומטר, וצנטריפוגה שוב ב-200 × גרם למשך 5 דקות. הגלולה שהתקבלה הושעתה מחדש ב-DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ונזרעה לתוך צלוחיות T25. התאים הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂, המדיום הוחלף כל 2-3 ימים, ותאים ממעברים 1-2 שימשו לניסויים. קבוצות הניסוי כללו בקרה תקינה, מודל ריק, HSYA (100 מיקרומול/ליטר), מעכב HIF-1α YC-1 (10 מיקרומול/ליטר), רפמיצין (10 ננומול/ליטר), HSYA + YC-1 ו-HSYA + רפמיצין.

3. נוקדאון HIF-lα בתיווך siRNA, BNIP3

כונדרוציטים ראשוניים נזרעו בצלחות של 6 בארות ב-2-5 ×-10⁵ תאים לבאר ותורבו ב-37 מעלות צלזיוס עד שהגיעו למפגש של 30%-50%. עבור כל באר, 5 מיקרוליטר של 20 מיקרומטר siRNA דולל ב-250 מיקרוליטר Opti-MEM, ו-5 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים דולל בנפרד ב-250 מיקרוליטר Opti-MEM. שתי התמיסות עורבבו בעדינות והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות ליצירת קומפלקסים. מדיום התרבית הוחלף ב-1.5 מ"ל DMEM טרי עם 10% FBS, וקומפלקס ה-siRNA-ליפידים (500 מיקרוליטר) נוסף טיפה לאורך דופן הבאר עם מערבולת עדינה. התאים הודגרו במשך 6 שעות, המדיום הוחלף במדיום שלם, והתרבית נמשכה 48-72 שעות. יעילות הנוקדאון אומתה על ידי qRT-PCR וכתם מערבי לפני טיפולים נוספים.

4. אליסה

סופרנטנטים של תרבית תאים נאספו, צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות, ודוללו 1:2 במאגר הבדיקה בעת הצורך. ערכות ELISA עבור IL-1β, TNF-α ו-IL-6 שימשו על פי פרוטוקול היצרן. תקנים, ריקים ודוגמאות הופעלו בשלוש עותקים. לאחר תגובת המצע, הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות תוך 15 דקות.

5. בדיקת MTT

כונדרוציטים נזרעו לתוך צלחות של 96 בארות ב-5,000 תאים/באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום שלם והודגרו במשך 0 שעות, 24 שעות, 48 שעות או 72 שעות. בכל נקודת זמן, 20 מיקרוליטר של תמיסת MTT (5 מ"ג/מ"ל ב-PBS) נוספו ישירות לכל באר, והצלחות הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שגבישי פורמאזאן סגולים נראו בתחתית הבארות. הסופרנטנט נשאף בזהירות מבלי להפריע לגבישים, 150 מיקרוליטר של DMSO נוספו לכל באר, והצלחות הונחו על שייקר ב-100 סל"ד למשך 10 דקות כדי להמיס את הגבישים לחלוטין. הספיגה נמדדה ב-490 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. זמן הדגירה הקצר נבחר כדי למנוע רוויית אותות בתאים פעילים מאוד מבחינה מטבולית.

6. ציטומטריית זרימה

התאים נקטפו על ידי טריפסיניזציה, צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות, ונשטפו פעמיים עם PBS קר. הם הושעו מחדש ב-500 מיקרוליטר של מאגר קשירה ב-~1 ×-10⁶ תאים/מ"ל, ונוספו 5 מיקרוליטר Annexin V-FITC ו-5 מיקרוליטר PI. לאחר ערבוב עדין, התאים הודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הדגימות נותחו על ציטומטר זרימה, עם לפחות 10,000 אירועים שנאספו לכל דגימה (עירור 488 ננומטר, פליטה FITC 530/30 ננומטר, PI > 600 ננומטר). תאים אפופטוטיים כומתו באמצעות תוכנה סטנדרטית.

7. כתמים מערביים

התאים נשטפו פעמיים עם PBS קר ועברו ליזה במאגר RIPA של 200 מיקרוליטר המכיל מעכבי פרוטאז על קרח למשך 30 דקות. התאים גורדו עם מגרד פלסטיק, צנרתו למעלה ולמטה כדי להפחית את הצמיגות, וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. סופרנטנטים נאספו, וריכוזי החלבון נמדדו באמצעות בדיקת BCA. כמויות שוות של חלבון (30 מיקרוגרם) עורבבו עם 5× מאגר העמסה, חוממו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, והופרדו על ג'ל 10%-12% SDS-PAGE. אלקטרופורזה הופעלה ב-80 וולט לערימה ו-120 וולט להפרדה, וחלבונים הועברו לממברנות PVDF ב-300 mA למשך 90 דקות. הממברנות נחסמו בחלב דל שומן 5% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר והודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים (1:1,000). לאחר שלוש שטיפות עם TBST, הממברנות הודגרו עם נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP (1:5,000) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. רצועות החלבון הודגמו עם מצע ECL וצולמו באמצעות מערכת זיהוי כימילומינסנציה עם חשיפה של 30-120 שניות. עוצמות הלהקה כומתו באמצעות ImageJ, ו-GAPDH שימש כבקרת הטעינה.

8. צביעת Monodansylcadaverine (MDC)

פתרון עבודה של 50 מיקרומטר MDC הוכן מתמיסת המלאי מיד לפני השימוש. התאים קובעו עם 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, נשטפו פעמיים עם PBS והודגרו עם תמיסת עבודה של 500 מיקרוליטר MDC למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר שתי כביסות עם PBS, הכיסויים הותקנו עם מדיום הרכבה נגד דהייה ונצפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור 355 ננומטר, פליטה 512 ננומטר).

9. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)

התאים נקצרו ונאספו על ידי צנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן קובעו ב-2% גלוטרלדהיד ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הדגימות נשטפו שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחת וקובעו לאחר מכן בטטרוקסיד אוסמיום 1% למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס במכסה אדים. ההתייבשות בוצעה באמצעות סדרת אצטון מדורגת של 30%, 50%, 70%, 90% ו-100% למשך 10 דקות כל אחת. הדגימות הוחדרו עם שרף אצטון/אפוקסי 1:1 למשך שעה ולאחר מכן עם שרף טהור למשך הלילה. ההטבעה בוצעה בשרף טרי ופולימריזציה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. קטעים אולטרה-דקים של 50-70 ננומטר נחתכו עם אולטרה-מיקרוטום, הורכבו על רשתות נחושת של 200 רשת, הוכתמו ב-2% אורניל אצטט למשך 30 דקות ולאחר מכן ציטראט עופרת למשך 15 דקות, נשטפו במים מזוקקים, יובשו באוויר ונבדקו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה ב-80 קילו-וולט. כהערת בטיחות, גלוטראלדהיד ואוסמיום טטרוקסיד הם רעילים ונדיפים ויש לטפל בהם רק במכסה אדים עם כפפות ומשקפי מגן. יש להשליך פסולת למיכלים מסוכנים ייעודיים בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות המוסדיים.

10. ניתוח סטטיסטי

כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD. המובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק LSD, כאשר P < 0.05 נחשב מובהק.

השפעת HSYA על ביטוי ציטוקינים פרו-דלקתיים של כונדרוציטים (IL-1β, TNF-α, IL-6)
בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה, כל הקבוצות האחרות הראו רמות גבוהות משמעותית של ציטוקינים מעודדי דלקת (IL-1β, TNF-α ו-IL-6) (P < 0.05, טבלה 1, איור 1A-G). טיפול ב-HSYA, מעכב HIF-1α, משרה אוטופגיה, מעכב HSYA + HIF-1α, או HSYA + משרה אוטופגיה הפחית משמעותית את רמות הציטוקינים ביחס לקבוצת המודל הריק (P < 0.05). בין אלה, הטיפולים המשולבים (מעכב HSYA + HIF-1α או HSYA + משרה אוטופגיה) הפחיתו עוד יותר את ביטוי הציטוקינים, עם ירידה של כ-35%-40% בהשוואה לקבוצת המודל (P < 0.05). בניסויי הפרעות גנים (איור 1H-J), הפלת siRNA של HIF-1α או BNIP3 הובילה להפחתה של ~25%-30% ברמות הציטוקינים בהשוואה למודל + הקבוצה הריקה. טיפול HSYA שיפר עוד יותר את ההשפעות הללו. באופן ספציפי, רמות הציטוקינים בקבוצת siHIF-1α + HSYA היו נמוכות ב~20% מאשר בקבוצת siHIF-1α + ריק, והרמות בקבוצת siBNIP3 + HSYA היו נמוכות ב-~22% מאשר בקבוצת siBNIP3 + ריק (P < 0.05).

השפעת HSYA על התפשטות כונדרוציטים
קבוצת הביקורת הרגילה הראתה פעילות התפשטות בסיסית, בעוד שקבוצת המודל הריק הראתה ירידה משמעותית (P < 0.05, איור 2A). ההתרבות שוחזרה חלקית לאחר טיפול ב-HSYA, מעכב HIF-1α או משרה אוטופגיה, ושופרה באופן ניכר על ידי שילוב של מעכב HSYA + HIF-1α או טיפולים משולבים של משרה HSYA + אוטופגיה (P < 0.05). בניסויי siRNA (איור 2B), הפלה של HIF-1α או BNIP3 קידמה התפשטות ב~25% בהשוואה לקבוצת הביקורת של המודל. טיפול HSYA שיפר עוד יותר את ההתפשטות, וכתוצאה מכך התפשטות גבוהה יותר של ~40% בהשוואה לקבוצת המודל (P < 0.05).

השפעת HSYA על אפופטוזיס וביטוי חלבון הקשור לאוטופגיה בכונדרוציטים
ניתוח כתמים מערביים חשף הבדלים משמעותיים בביטוי החלבון בין הקבוצות (טבלה 2). קבוצת המודל הריק הראתה ויסות ניכר של HIF-1α וביטוי מופחת של LC3, P62, Beclin1 ו-BNIP3 בהשוואה לביקורת (P < 0.05). טיפול ב-HSYA, מעכב HIF-1α או משרה אוטופגיה הגדיל את ביטוי LC3, P62, Beclin1 ו-BNIP3 והפחית את רמות HIF-1α (P < 0.05). הטיפולים המשולבים עם מעכב HSYA + HIF-1α או HSYA + משרה אוטופגיה יצרו את השינויים הגדולים ביותר, כאשר רמות LC3 ו-Beclin1 כמעט הוכפלו בהשוואה לקבוצת המודל הריק. למרות ש-P62 מופחת בדרך כלל כאשר מופעלת אוטופגיה, כאן רמותיו עלו בעקבות טיפול HSYA. זה עשוי להצביע על הצטברות מוגברת של אוטופאגוזומים או שטף לא שלם, תופעה שדווחה גם במחקרים קודמים של אוטופגיה של כונדרוציטים.

השפעת HSYA על שיעורי האפופטוזיס בכונדרוציטים
ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי קבוצת המודל הריק הציגה שיעור אפופטוזיס גבוה משמעותית מקבוצת הביקורת הרגילה (P < 0.05, איור 3A,B). HSYA, מעכב HIF-1α ומשרה אוטופגיה הפחיתו כל אחד את האפופטוזיס, בעוד שהטיפולים המשולבים (מעכב HSYA + HIF-1α או HSYA + משרה אוטופגיה) הניבו את שיעורי האפופטוזיס הנמוכים ביותר, עם הפחתה של ~45%-50% בהשוואה לקבוצת המודל הריק (P < 0.05). בניסויי siRNA, האפופטוזיס הופחת גם על ידי הפלה של HIF-1α או BNIP3, והופחת עוד יותר על ידי טיפול ב-HSYA.

השפעת HSYA על שיעורי האפופטוזיס והיווצרות שלפוחית אוטופאגית בכונדרוציטים
צביעת MDC והדמיית TEM חשפו הבדלים ברורים בהיווצרות שלפוחית אוטופאגית בין קבוצות (איור 4A-D). קבוצת המודל הריק הריקה הראתה התפלגות דלילה של שלפוחית, בעוד שטיפולי HSYA, מעכב HIF-1α או משרה אוטופגיה הגדילו את מספר השלפוחיות. הטיפולים המשולבים (מעכב HSYA + HIF-1α או HSYA + משרה אוטופגיה) הניבו את השיפור הבולט ביותר, עם בערך פי שניים יותר שלפוחיות שנצפו על ידי TEM בהשוואה לקבוצת המודל. בהתאם לממצאים אלה, שיעורי האפופטוזיס שנמדדו על ידי זרימה ציטומטרית (איור 5A-E) היו הנמוכים ביותר בקבוצות הטיפול המשולבות.

זמינות נתונים:
כל הנתונים שנוצרו במחקר זה מסופקים בקובץ משלים 1.

איור 1: הביטוי של ציטוקינים פרו-דלקתיים כונדרוציטים (IL-1β, TNF-α, IL-6) בכל קבוצה (n = 3). (א-ג) רמות ביטוי החלבון של IL-1β, TNF-α ו-IL-6 זוהו על ידי Western Blotting (WB). (ח-י) התוכן של IL-1β, TNF-α ו-IL-6 נמדד על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA) (P < 0.05). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השוואה של פעילות התפשטות כונדרוציטים בכל קבוצה (n = 3). (A) הקבוצות המטופלות, ו-(B) קבוצות הנוקדאון HIF-1α ו-BNIP3, P< 0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השוואה של שיעור האפופטוזיס של כל קבוצה (n = 3). (A) 1, קבוצה נורמלית; 2, קבוצת מודל; 3, קבוצת HSYA; 4, קבוצת מעכבי HIF-1α; 5, קבוצת אוטופגיה; 6, קבוצת מעכבי HSYA + HIF-1α; 7, קבוצת HSYA + משרה אוטופגיה. (B) קבוצות הנוקדאון של הגנים HIF-1α ו-BNIP3. בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה, *P < 0.05. בהשוואה לקבוצת הדגמים הריקים, #P< 0.05. בהשוואה לקבוצת מעכבי HSYA + HIF-1α, & P< 0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמיית TEM של היווצרות השלפוחית האוטופאגית במיטוכונדריה. (א) דגם ריק. (ב) קבוצת HSYA. (C) קבוצת מעכבי HIF-1α. (D) קבוצת מעודדי אוטופגיה. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: השפעת HSYA על שיעורי האפופטוזיס של התאים בכל קבוצה (n = 3). (א) דגם ריק. (ב) קבוצת HSYA. (C) קבוצת מעכבי HIF-1α. (D) קבוצת מעודדי אוטופגיה. (E) הניתוח הכולל של כל קבוצה, בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה, **P< 0.01. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: השוואה בין רמות הציטוקינים הפרו-דלקתיים בכל קבוצה. בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה, *P < 0.05. בהשוואה לקבוצת הדגמים הריקים, #P< 0.05. בהשוואה לקבוצות שטופלו ב-HASY, מעכב HIF-1α ומשרה האוטופגיה, & P< 0.05.

טבלה 2: השוואה בין החלבונים בקבוצות השונות. בהשוואה לקבוצת הביקורת הרגילה, *P< 0.05. בהשוואה לקבוצות שטופלו ב-HSYA, מעכב HIF-1α ומשרה האוטופגיה, #P< 0.05.

קובץ משלים 1: הנתונים הגולמיים שנוצרו במהלך המחקר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.