מאמר שיטה

אפיון הפרשת וזיקולה חוץ-תאית שמקורם באדיפוציטים באמצעות מודל עכבר CD63-GFP Reporter In vivo ו-In Vitro

DOI:

10.3791/69670

⸱

5 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול משתמש בקו עכבר דיווח CD63-GFP ספציפי לדיפוציטים כדי להמחיש ולכמת את הפרשת הוזיקולות החוץ-תאיות (EVs) שמקורן בשומן ולהראות את קליטן על ידי תאי אבות, תוך חשיפה של מסלול פרקריני בתוך רקמת השומן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיפוציטים מוכרים יותר ויותר כתאים אנדוקריניים פעילים שמפרישים כמויות משמעותיות של אנוקרינים מועשרים בחלבונים, ליפידים וחומצות גרעין. עם זאת, המנגנונים השולטים בהפרשת EV והדינמיקה של שחרור EV בהקשרים ביולוגיים שונים אינם מובנים במלואם. כדי להתמודד עם הפער הזה, יצרנו קו עכבר חדשני ספציפי לשומן CD63-GFP, שבו ביטוי של CD63 עם תגית GFP מונע על ידי פרומוטר האדיפונקטין, מה שמאפשר תיוג ומעקב סלקטיבי אחרי AdEVs ב-vivo. באמצעות מודל הדיווח הזה, בחנו את הפרשת ה-AdEVs ואת העברתם ל-APCs בתוך רקמות השומן. הדמיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה חשפו כי AdEVs נקלטים באופן פעיל על ידי APCs, מה שמדגיש מנגנון תקשורת פרקריני שלא היה מוערך מספיק בעבר בתוך מיקרו-סביבת השומן.

כדי להשלים את מחקרי ה-in vivo , הוקם מערכת במבחנה , שאפשרה ניטור ישיר של הפרשת EV משומנים מובחנים. APCs בודדו מרקמות שומן לבנות תת-עוריות של עכברי המדווח והושרו להתמיין לשומנים בוגרים. בתאים אלו, אותות CD63-GFP נצפו כפנקטות בדידות והועשרו בקרום הפלזמה כאשר הפרשת EV עוכבה, בהתאם להצטברות ווסיקולות בעת שחרור חסום. בתנאי גדילה רגילים, ה-EVs שהופרשו לתוך תרבית התרכזו וטוהרהו לאחר מכן באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל, מה שאפשר ניתוחים פונקציונליים וביוכימיים במורד הזרם.

פלטפורמה זו יכולה להיות מיושמת על APCs שמקורם במאגרי שומן אחרים, כגון רקמת שומן אפידידימלית לבנה וחומה, או על ידי הבחנה שלהם לדיפוציטים ספציפיים לדפו, ובכך לאפשר השוואות של הפרשת EV בין סוגי שומן שונים.

ביחד, גישות אלו מציגות כלי גנטי חזק ומערכת משלימה במבחנה לניתוח הדינמיקה של הפרשת ומיקוד AdEV. התקדמות זו מאירה את התקשורת התאית התוך-שומנית ומניחה את היסודות להבנת ההשפעה המטבולית הרחבה יותר של AdEVs בבריאות ובמחלות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת השומן מוכרת יותר ויותר כאיבר אנדוקריני דינמי עם תפקידים מרכזיים בהומאוסטזיס אנרגטי הגוף הכולל 1,2,3,4,5. מעבר לתפקידו הקלאסי כמחסן אחסון ליפידים, שומנים מווסתים את הרגישות הסיסטמית לאינסולין, והפרעות במסת השומן – בין אם עודפת או חסרה – קשורות להתנגדות לאינסולין ולמחלות מטבוליות 6,7,8,9. מנגנון שהוצע לתרום ליכולת רגולטורית זו הוא תקשורת בין-תאית באמצעות גורמים מופרשים. בעוד שאדיפוקינים מבוססים היטב כאותות אנדוקריניים מרכזיים מרקמת שומן 10,11,12,13,14,15,16,17,18, שדיפוציטים משחררים גם מספר משמעותי של שלחיצות חוץ-תאיות (EVs), חלקיקים קשורים לממברנה המכילים ליפידים, חלבונים, חומצות גרעין ומטבוליטים. האם רכבים חשמליים המופרשים על ידי שומן (AdEVs) נושאים גם גליקנים, כמו סוגים אחרים של רכבים חשמליים, עדיין לא ברור 19,20,21,22,23,24. הוכח כי אדיפוציטים הם מקור עיקרי ל-EVs, שכן כ-80% ממיקרו-RNA אקזוזומליים בסיבוב מקורם בשומניות במודלים של עכברים, כפי שהודגם בעכברי Dicer ייחודיים לשומן תחת תנאים בסיסיים25. התפקידים של AdEVs במטבוליזם, דלקת, רגישות לאינסולין ואדיפוגנזה דווחו, אך עדיין לא מובנים במלואם 26,27,28,29. פונקציות פוטנציאליות נוספות, במיוחד בתיווך דיבור חוצה עם סוגי תאים ואיברים אחרים, עדיין ברובן לא ידועות. שפע26 של EVs מרמז שהם יכולים למלא תפקידים חשובים הן באיתות מקומי והן במערכת מערכתית, אך המשמעות הביולוגית ומנגנוני הפעולה של AdEVs כמעט לא נחקרו. פער ידע זה מדגיש את הצורך בשיטות חזקות ומיוחדות לחקר הפרשה ותפקוד של AdEV.

כדי להשלים פער זה, יצרנו עכברי CD63-GFP ספציפיים לדיפוציטים (AdipCD63-GFP) על ידי הכלאה של עכברי אדיפונקטין-קר עם עכברי Stopfl/fl/CD63-GFP (זן#:036865, JAX). שימשו לחלקימשא fo fl/fl/CD63-GFP, שלא הביעו CD63-GFP בהיעדר Cre, כבקרה. זן הדיווח CD63-GFP שימש בהצלחה למעקב אחר EVs ספציפיים לסוג תאים ב-vivo, כולל EVs שמקורם באנדותליה ובנוירונים 30,31. מכיוון שאדיפונקטין מתבטא רק בדיפוציטים בוגרים ולא בתאי אב קדמונים של הדיפוציטים (APCs)32,33, ו-CD63 הוא סמן של EVs34, ניתן לזהות את ה-GFP+ EVs שזוהו במחזור הדם וברקמות כ-AdEVs. לכן, במחקר זה, GFP+ EVs שזוהו בתוך APCs מפורשים כ-AdEVs שנלקחו על ידי תאי אב אלו. מערכת דיווח זו מאפשרת ניטור ישיר של שחרור וזיקולות ואינטראקציות פוטנציאליות למטרות ב-vivo וב-in vitro, ומאפשרת חקר AdEVs בתוך סוגי תאים אחרים של רקמת שומן. חשוב לציין ש-AdEVs עשירים במיוחד בשומנים בהשוואה לרכבים חשמליים מסוגי תאים אחרים, מה שהופך אותם לצפים, שבריריים ומאתגרים יותר לשיקום בשיטות אולטרה-צנטריפוגציה מסורתיות 35,36,37. כוחות צנטריפוגליים גבוהים עלולים להזיק לוזיקולות אלו או לגרום לאובדן דגימות וזיהום משמעותיים, מה שמסבך את הניתוח במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלות אלו, אופטימיזציה של תהליך עבודה המשלב שלבים רבים של צנטריפוגציה במהירות נמוכה עם כרומטוגרפיה של החרגת גודל, שממזערת מאמץ גזירה, שומרת על שלמות הווסיקולות ומשפרת את הטוהר והתפוקה, ומאפשרת כימות מדויק ומחקרים פונקציונליים. ביחד, מערכת CD63-GFP וצינור הבידוד האופטימלי הזה מספקים גישה נגישה וניתנת לשחזור לחקירת הפרשת ותפקוד AdEV בשיחת צולב של רקמת השומן ובוויסות מטבולי מערכתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתאם להנחיות טיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה, עכברים זכרים חולקו בקבוצה בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 30-70% במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, סיפקו גישה חופשית למזון ולמים, ונשמרו על רקע C57BL/6J.

1. גילוי ב-vivo של AdEVs מופרשים באמצעות קליטה על ידי נגמ"שים

  1. הכנת בופר
    1. בופר עיכול: הכינו DMEM מבוקר HEPES על ידי הוספת 0.5 מ"ל של 1 מיליון HEPES ו-0.5 גרם אלבומין סרום בקר דל בחומצות שומן (BSA) ל-50 מ"ל DMEM. מערבבים עד שהם נמסים.
    2. בופר שטיפה: הכינו PBS עם 2.5 מ"מ אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) וסרום בקר עוברי (FBS) של 4%.
    3. הכינו את מלאי ליבראז ו-DNase 1 ב-5 מ"ג/מ"ל וב-5 KU/מ"ל. אחסנו בטמפרטורה של -20°C. הפשרה מיד לפני השימוש.
  2. איסוף ועיכול רקמת השומן המפשעית
    הערה: עכברי בקרה בני ארבעה חודשים AdipCD63-GFP ו-CD63-GFP הושמתו באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני.
    1. כריתת רקמות שומן בטכניקת סטרילית ומניחה 1 גרם רקמה ב-0.5 מ"ל של בופר עיכול, וטחנה רקמה דק עם מספריים סטריליות לחתיכות בגודל לא גדול מ-1 מ"מ.
    2. השעינו את הרקמה הטחונה ב-10 מ"ל של בופר מעוכל המכיל 0.5 מ"ג/מ"ל ליבראז ו-50 U/mL DNase 1.
    3. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי (100 סל"ד) למשך 30-60 דקות. ערבבו בעדינות את הרקמה על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים במהלך הדגירה. כאשר התמיסה נראית עכורה ואין שברי רקמה נראים לעין, העיכול נחשב שלם.
  3. בידוד נגמ"שים
    1. מדלל את המתלה בשני נפחים של בופר העיכול והפוך בעדינות את הצינור 3-4 פעמים.
    2. עברו דרך מסנן סטרילי של 100 מיקרון כדי להסיר רקמות לא מעוכלות.
    3. צנטריפוגה את הסינון ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. השליכו את החלק הסופרנטנטי של הדיפוציטים וסמנו את הכדור כחלק הווסקולרי סטרומלי (SVF).
    5. הכינו בופר טרי של 1× תאי דם אדומים (RBC) עם מים סטריליים. לפרק את תאי הדם האדומים ב-SVF על ידי דגירה על קרח למשך 5 דקות, מוגנים מאור.
    6. הוסף שני נפחים של בופר שטיפה, ואז סינון בצנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. עקבו אחר פרוטוקול ערכת בידוד רקמת השומן (עכבר), החזירו את ה-SVF לבופר של 80 מיקרוליטר (PBS, pH 7.2, 0.5% BSA, 2 mM EDTA) לכל גרם רקמה.
    8. הוסף 20 מיקרוליטר של קוקטייל התרוקנות של אבות לא-שדיפוציטים לכל גרם רקמה.
    9. ערבבו ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס בחושך.
    10. העבר את הדגימה דרך עמודת LS ואסף את ה-flow-through.
    11. צנטריפוגה את הזרימה (שלילית ל-CD31, CD45, Ter119) ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לקבל את ה-APCs למחקר.
  4. זיהוי AdEVs מופרשים באמצעות קליטת APC באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
    1. זרעו 250 מיקרוליטר של APCs מבודדים (1 ×10 4 תאים/מ"ל) מעכברי AdipCD63-GFP או CD63-GFP על מעליות תא 8 בארות מצופות קולגן ואפשרו לתאים להיצמד למשך כ-6 שעות.
    2. תקבע את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות כדי לשמור על מבני התאים וה-EV להדמיה.
      הערה: במבחנים אלו, אותות GFP מסמנים את ה-AdEVs, והזיהוי שלהם בתוך APCs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מצביע על קליטת AdEVs על ידי תאי אב אלו.
    3. שטוף את השקופיות שלוש פעמים עם PBS, התקן עם מדיום אנטי-פייד, ותפס אותות GFP באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרת טבילה בשמן בקוטר 63×. רכוש תמונות כערימות סדרה z עם גודל צעד של 0.5 מיקרון, תוך שימוש בלייזר 488 ננומטר לעירור GFP וזיהוי פליטה ב-500-550 ננומטר.
  5. זיהוי AdEVs המופרשים באמצעות קליטת APC באמצעות ציטומטריית זרימה
    1. ספירת APCs ודילול צבעי חיוניות (למשל, Zombie) ב-1:1000 ב-1X PBS. תלו תאים ב-1 × 106 ל-100 מיקרוליטר. דגרו במשך 20 דקות על קרח, מוגנים מאור.
    2. שטוף תאים פעם אחת עם בופר שטיפה. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. תלו תאים בבופר צביעה מרהיב ב-1 ×-106 תאים ל-100 מיקרוליטר.
    4. חסום קשירה לא ספציפית עם תגובת חסימת קולטני Fc (למשל, אנטי-CD16/CD32) 1:100 על קרח למשך 10 דקות.
    5. נוגדן Sca-1 לפני סיבוב ב-6,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מוסיפים 1 מיקרוליטר של נוגדן Sca-1 לצינור ה-APC ולדגר במשך 20 דקות על קרח, תוך שמירה על הצינור מכוסה בנייר כסף.
    6. שטוף פעמיים עם 1 מ"ל בופר שטיפה, צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    7. תלו תאים בבופר שטיפה בסביבות 1 ×-10עד 6 תאים ל-500 מיקרו לצורך מיון ציטומטריית זרימה. אסוף נתונים לתאי Sca1+ ו-GFP+ על ציטומטר זרימה ספקטרלי המצויד בלייזר סגול 405 ננומטר (פילטר 450/50 ננומטר ל-Pacific Blue) ולייזר כחול 488 ננומטר (מסנן 530/30 ננומטר ל-GFP). נתחו את הדגימות באמצעות תוכנת ההפעלה של המכשיר, כאשר תאי Sca1+ מגודרים, ותת-הקבוצה של GFP+ באוכלוסייה זו מנותחת, כפי שמוצג באיור 2.

2. גילוי וניתוח של ה-AdEVs המופרשים במבחנה

  1. התמיינות של APCs לדיפוציטים בוגרים
    הערה: כל התרביות נשמרות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 8%CO2 אלא אם צוין אחרת.
    1. יום 0: ציפוי כלים עם 0.2% ג'לטין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT), שאיפה, וזרע זרעים של APCs מבודדים טריים ב-DMEM/F12 + 15% FBS + 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) + 0.1% פרימוצין כדי להגיע ל-100% חיבור לפני ההבדלה.
    2. ימים 1-8: החלף במדיום התמיינות אדיפוגני MesenCult (50 מ"ל בסך הכל: 45 מ"ל בסיס + 5 מ"ל תוסף + 0.5 מ"ל גלוטמקס + 50 מיקרוליטר פרימוצין), החלף למדיום התמיינות טרי ביום 4.
    3. יום 9: שוטפים את הדיפוציטים פעמיים עם PBS, ואז החליפו במדיום תרבית שומנים בוגר (DMEM +1% BSA + 0.2% פרימוסין) ושומרים במשך 16 שעות.
  2. בידוד וטיהור של AdEV
    1. העבירו תרבית שומנים של 15 מ"ל שנוצרה לעיל, תחילה דרך מסנן של 40 מיקרון ואז מסנן של 30 מיקרון.
    2. צנטריפוגה את הסינון ב-500 × גרם למשך 5 דקות, ואז 2,000 × גרם ל-10 דקות כדי להסיר שאריות תאים ופסולת.
    3. העבר את הסינון דרך פילטר של 0.8 מיקרון, ואז ריכז את המדיום מ-15 מ"ל ל-0.5 מ"ל באמצעות יחידת אולטרה-פילטרציה חיתוך של 100 קילו-דלטון (נפח דגימה של 15 מ"ל) על ידי צנטריפוגה ב-4,000 × גרם למשך 15 דקות.
    4. טעינת דגימה על עמודות כרומטוגרפיית הדרה בגודל (SEC) עם קולקטור שברים אוטומטי ואיסוף שברים F1-8.
    5. ריכזו את חלקי ה-EV שנאספו באמצעות יחידת אולטרה-פילטרציה של חיתוך של 100 קילו-דלטון (נפח דגימה 4 מ"ל) והתקדמו לאימות תכולת ה-EV בכל חלק באמצעות Western Blot, מכשיר ניתוח מעקב ננו-חלקיקים ומיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM).
  3. אימות, כימות והערכת גודל/מורפולוגיה של AdEV
    1. ניתוח כתם מערבי של סמנים חשמליים
      1. מרוכזים כל חלק מ-400 מיקרוליטר עד 25 מיקרוליטר, ואז מוסיפים 50 מיקרוליטר של בופר רדיואימונופרציפיטציה (RIPA) בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז. דנאטורציה של הדגימות על ידי הוספת 2× נתרן דודציל סולפט (SDS) ופתרון חלבונים על ג'ל טריס-גליצין 4-12%.
    2. ניתוח גודל, ריכוז ואיכותה של רכב חשמלי באמצעות מכשיר ניתוח מעקב ננו-חלקיקים.
      1. לפני הניתוח, דיללו את דגימות ה-EV ב-PBS מסונן סטרילי של 0.1 מיקרון ביחס 1:1000, כדי להבטיח שריכוז החלקיקים נמצא בטווח הגילוי האופטימלי (כ-107-10 9 חלקיקים למ"ל). ערבבו בעדינות את הדגימות המדוללות כדי למנוע היווצרות בועות.
      2. טעינו את הדגימה למכשיר המצויד במצלמת sCMOS (sCMOS) מדעית משלימה למחצה, מודול לייזר ירוק של 532 ננומטר, וסף גילוי של 10 ננומטר (עד 1,000 ננומטר)/106 עד10 9 חלקיקים למילילטר.
      3. בצע הדמיה וכימות באמצעות חבילת התוכנה NS Xplorer, המיישמת אלגוריתם ריכוז דינמי מבוסס נפח תצפית.
    3. בדיקת מורפולוגיה של EV באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרוני העברת (TEM)
      1. יש להגיש 50 מיקרוליטר של רכבים חשמליים, שנאספו לפני הריכוז, למתקן הליבה לצורך צביעה שלילית של רכבים חשמליים. הניחו רכבים חשמליים על רשתות נחושת של 400 רשתות פחמן בלבד שעברו ניקוי פלזמה עם מנקה פלזמה.
      2. לאחר ספיחה קצרה, שטפו את הרשתות במים מזוקקים, צבעו בשלילית ב-1% אורניל אצטט, והסירו את הכתמים העודפים בנייר סינון לפני הייבוש באוויר. לאחר מכן, דמיינו את הרשתות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת חשמל הפועל ב-120 קילו-וולט.

3. מידע על בטיחות ופסולת

  1. לטפל בפרפורמלדהיד ובאצטט אורניל בתוך מכסה אדים עם ציוד מגן אישי (PPE), כי שניהם רעילים. אסוף פסולת אורניל אצטט במיכלים מסוכנים מסומנים.
  2. לטפל בכל הדגימות הביולוגיות כיכולות להיות מדבקות ולהיפטר מהחומרים בהתאם למדיניות ופרוטוקולים של בטיחות ביולוגית מוסדית שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות פרוטוקול זה של זיהוי AdEVs באמצעות קליטת APC במיקרוסקופיה קונפוקלית, בידדנו APCs מרקמות השומן המפשעיות של עכברי AdipCD63-GFP ו-Stopfl/fl/CD63-GFP וצובעים אותם ב-DAPI לצורך המחשת הגרעין. כאשר נבדקו במיקרוסקופיה קונפוקלית, APCs מעכבריStop fl/fl/CD63-GFP לא הראו נקטה GFP ניתנת לזיהוי (איור 1A). לעומת זאת, APCים שבודדו מעכברי AdipCD63-GFP הראו נקודות GFP מובחנות רבות לאורך הציטופלזמה (איור 1B). אות ה-GFP מדגים את קליטת AdEVs על ידי APCs...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר ממלא פער מתודולוגי חשוב בכך שהוא מספק מערכת חזקה וניתנת לשחזור לבידוד ואפיון AdEVs וקליטתם על ידי APCs. בהשוואה לרכבים חשמליים ממקורות אחרים, ה-AdEVs עשירים יותר בשומנים וצפים, מה שהופך את טכניקות הבידוד הקלאסיות המבוססות על אולטרה-צנטריפוגה, לפחות יעילות,35. עם זאת, רוב הפרוטוקולים שפורסמו לטיהור AdEV עדיין תלויים באולטרה-צנטריפוגה, שיכולה להשפיע על מורפולוגיית הווסיקולות, להוביל לאגרגטים של EV ולגרום לזיהום חלבונים37,44

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרס כלכלי להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל-Einstein Flow Cytometric Core עבור FACS, ול-Analytical Imaging Facility על כל ניתוח התמונה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המכון הלאומי לבריאות DK128839 ומענקי תמיכה של מרכזי הסרטן של ה-NCI P30CA013330.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTA, pH 8.0פישרAM9260Gדילול פי 500
10x PBSפישר סיינטיפיק70-013-0321000x דילול עם מים
1 M HEPESגיבקו15630080דילול פי 1000
ערכת בידוד רקמת שומן, עכברMiltenyi biotec30-106-639מוכן לשימוש
מסנן Amicon Ultra Centrifugal, 100 kDa MWCOסיגמאUFC9100נפח דגימה של 15 מ"ל
מסנן Amicon Ultra Centrifugal, 100 kDa MWCOסיגמאUFC9100נפח דגימה של 4 מ"ל
BSAסיגמאA6003מוכן לשימוש
נוגדן קלנקסיןקלנקסיןab22595דילול פי 1000
נוגדן CD63אבקאםAB217345דילול פי 500
CD81טכנולוגיית איתות סלולרישנות 10037דילול פי 500
קורנינג  BioCoat  מגלשית תרבות קולגן IסיגמאCLS354630מוכן לשימוש
קורנינג  מסננת תאיםסיגמאCLS43175040 & mu; גודל נקבוביות M
קורנינג  מסננת תאיםסיגמאCLS431752100 & mu; גודל נקבוביות M
נוגדן COX IVטכנולוגיית איתות סלולרי4844דילול פי 1000
DMEMגיבקו11965092מוכן לשימוש
DMEM/F-12, תוסף GlutaMAXתרמופישר10565018מוכן לשימוש
Dnase 1סיגמאD45135 KU/ml במלאי בטמפרטורה של מינוס 20 & דרגה; C
תוסף GlutaMAXגיבקו35050061דילול פי 100
Halt&Trade; קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז (100X)תרמופישר78444מוכן לשימוש
נוגדן HSP70אבקאםab181606דילול פי 1000
Invitrogen eBioscience 10X Rbc Lysis Buffer (רב-מיני)פישר סיינטיפיק50-112-974310 פעמים דילול במים
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPפישר סיינטיפיקNC2042225מוכן לשימוש
מיקרוסקופ קונפוקלי LEICA STELLARIS 8מיקרוסקופים של לייקהלא זמין
דרגת מחקר ל-TM ליבראזסיגמאLIBTM-ROהמלאי 5 מ"ג/מ"ל ב-20 ו-20 דרגה; C
מסנן מזרק Millex MCEסיגמאSLAA0250.8 & mu; גודל נקבוביות M
NanoSight Proמלוורן אנליטילא זמין
ג'לים חלבון מיני Novex Tris-Glycine, 4– 12%,תרמופישרXP04120BOXמוכן לשימוש
בופר דגימות Novex Tris-Glycine SDS (2x)תרמופישרLC2676מוכן לשימוש
נוגדן אנטי-עכבר Pacific Blue Ly-6A/E (Sca-1)ביולג'נד108119דילול פי 25
תמיסת פאראפורמלדהיד (16%)פישר סיינטיפיק50-980-487לדלל ל-4% עם PBS
pluriStrainer S / 30 ומיקרו; m (מסננת תאים)פישר סיינטיפיקNC092245930 & mu; גודל נקבוביות M
פתרון Ponceau SסיגמאP7170-1Lמוכן לשימוש
פרימוסיןאינויווגןNC9141851דילול פי 500
ProLong Gold Antifade Reagent עם DAPIטכנולוגיית איתות סלולרי8961Sמוכן לשימוש
נוגדן אנטי-עכבר מטוהר CD16/32ביולג'נד101301דילול פי 100
RIPA buffer פישר סיינטיפיקPI8990010 פעמים דילול במים
ציטומטר זרימה ספקטרלי (Aurora 3)סיטק ביוסיינססלא זמין
נוגדן סינטקסין 4מערכות סינפטיות110042דילול פי 5000
Tecnai 20 (מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר)FEIלא זמין
טרגאו-EMPIE Scientific LLCלא זמין
נוגדן וינקוליןאבקאםab18508דילול פי 5000

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23, 631-637 (2017).
  5. Sakers, A., De Siqueira, M. K., Seale, P., Villanueva, C. J. Adipose-tissue plasticity in health and disease. Cell. 185 (3), 419-446 (2022).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Czech, M. P. Mechanisms of insulin resistance related to white, beige, and brown adipocytes. Mol Metab. 34, 27-42 (2020).
  8. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840-846 (2006).
  9. Feng, D., et al. SNAP23 regulates BAX-dependent adipocyte programmed cell death independently of canonical macroautophagy. J Clin Invest. 128 (9), 3941-3956 (2018).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372, 425-432 (1994).
  12. Scherer, P. E., Williams, S., Fogliano, M., Baldini, G., Lodish, H. F. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem. 270 (45), 26746-26749 (1995).
  13. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med. 334, 292-295 (1996).
  14. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: Direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  15. Steppan, C. M., et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature. 409, 307-312 (2001).
  16. Yang, Q., et al. Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature. 436, 356-362 (2005).
  17. Tilg, H., et al. Adipokines: Masterminds of metabolic inflammation. Nat Rev Immunol. 25, 250-265 (2025).
  18. Clemente-Suarez, V. J., et al. The role of adipokines in health and disease. Biomedicines. 11 (5), 1290(2023).
  19. Hallal, S., et al. Understanding the extracellular vesicle surface for clinical molecular biology. J Extracell Vesicles. 11 (10), e12260(2022).
  20. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  21. Le Lay, S., Scherer, P. E. Exploring adipose tissue-derived extracellular vesicles in inter-organ crosstalk: Implications for metabolic regulation and adipose tissue function. Cell Rep. 44 (6), 115732(2025).
  22. Shimoda, A., et al. Exosome surface glycans reflect osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: Profiling by an evanescent field fluorescence-assisted lectin array system. Sci Rep. 9, 11497(2019).
  23. Albuquerque, P. C., et al. A Paracoccidioides brasiliensis glycan shares serologic and functional properties with cryptococcal glucuronoxylomannan. Fungal Genet Biol. 49 (11), 943-954 (2012).
  24. Li, Y., Tang, X., Gu, Y., Zhou, G. Adipocyte-derived extracellular vesicles: Small vesicles with big impact. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (7), 149(2023).
  25. Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
  26. Crewe, C., et al. An endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708.e13 (2018).
  27. Flaherty, S. E. 3rd, et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  28. Clement, E., et al. Adipocyte extracellular vesicles carry enzymes and fatty acids that stimulate mitochondrial metabolism and remodeling in tumor cells. EMBO J. 39, e102525(2020).
  29. Kulaj, K., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles increase insulin secretion through transport of insulinotropic protein cargo. Nat Commun. 14, 709(2023).
  30. McCann, J. V., et al. Reporter mice for isolating and auditing cell type-specific extracellular vesicles in vivo. Genesis. 58 (7), e23369(2020).
  31. Men, Y., et al. Exosome reporter mice reveal the involvement of exosomes in mediating neuron to astroglia communication in the CNS. Nat Commun. 10, 4136(2019).
  32. Jeffery, E., et al. Characterization of Cre recombinase models for the study of adipose tissue. Adipocyte. 3 (3), 206-211 (2014).
  33. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603, 926-933 (2022).
  34. Krylova, S. V., Feng, D. The machinery of exosomes: Biogenesis, release, and uptake. Int J Mol Sci. 24 (2), (2023).
  35. Crewe, C. The challenges of interrogating adipose tissue extracellular vesicle functions in physiology. Commun Biol. 5, 581(2022).
  36. Blandin, A., et al. Lipidomic analysis of adipose-derived extracellular vesicles reveals specific EV lipid sorting informative of the obesity metabolic state. Cell Rep. 42 (3), 112169(2023).
  37. Matilainen, J., et al. Increased secretion of adipocyte-derived extracellular vesicles is associated with adipose tissue inflammation and the mobilization of excess lipid in human obesity. J Transl Med. 22, 623(2024).
  38. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  39. Olson, A. L., Knight, J. B., Pessin, J. E. Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are functional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes. Mol Cell Biol. 17 (5), 2425-2435 (1997).
  40. Oh, E., Miller, R. A., Thurmond, D. C. Syntaxin 4 overexpression ameliorates effects of aging and high-fat diet on glucose control and extends lifespan. Cell Metab. 22 (3), 499-507 (2015).
  41. Merz, K. E., et al. Enrichment of the exocytosis protein STX4 in skeletal muscle remediates peripheral insulin resistance and alters mitochondrial dynamics via Drp1. Nat Commun. 13, 424(2022).
  42. Yu, X., et al. Involution of brown adipose tissue through a syntaxin 4 dependent pyroptosis pathway. Nat Commun. 15, 2856(2024).
  43. Verweij, F. J., et al. Quantifying exosome secretion from single cells reveals a modulatory role for GPCR signaling. J Cell Biol. 217 (3), 1129-1142 (2018).
  44. Arora, A., Sharma, V., Gupta, R., Aggarwal, A. Isolation and characterization of extracellular vesicles derived from ex vivo culture of visceral adipose tissue. Bio Protoc. 14 (11), e5011(2024).
  45. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Sci Rep. 7, 15297(2017).
  46. Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine. 11 (4), 879-883 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesEV SecretionStromal Vascular FractionAdipocyte Progenitor CellsSize Exclusion ChromatographyFlow CytometryConfocal MicroscopyNanoparticle Tracking

מאמרים קשורים