בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג'ל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
המיטוכונדריה הם אברונים cytoplasmic שיש להם תפקיד מרכזי במטבוליזם הומאוסטזיס הסלולר, הרגולציה של הרשת התא איתות, ועל מוות תאים מתוכנת. המיטוכונדריה לייצר ATP, להסדיר את המדינה חמזור cytoplasmic ו Ca2 + איזון, catabolize חומצות שומן, לסנתז heme, נוקלאוטידים, הורמונים סטרואידים, חומצות אמינו, לעזור להרכיב ברזל גופרית אשכולות בחלבונים. המיטוכונדריה יש גם תפקיד חיוני בייצור חום. מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי הגורם מספר סוגים של ההפרעה האנושית. הצטברות של מוטציות mtDNA בקורלציה עם הזדקנות חשוד יש תפקיד חשוב בהתפתחות סרטן. בשל תפקיד חשוב ביותר שלהם בכל סוגי תאים, הפונקציה של המיטוכונדריה חייב גם להיות קריטי עבור בתאי גזע. ההתקדמות מפתח נעשו הבנתנו הכדאיות גזע תאים, התפשטות, ויכולת הבחנה. אבל את הפעילות התפקודית של בתאי גזע, מעמד מסוים האנרגיה שלהם, עדיין לא נחקרו בפירוט. כמעט דבר אינו ידוע על המאפיינים של המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) והצאצאים שלהם מבשר מובחן. אחת הדרכים להבין ולהעריך את התפקיד של המיטוכונדריה בתפקוד hESC ואת הפוטנציאל ההתפתחותי היא למדוד ישירות את הפעילות של מתחמי הנשימה במיטוכונדריה. כאן אנו מתארים ברזולוציה גבוהה ברור יליד ג'ל אלקטרופורזה ובעקבות ב להדמיה ג'ל הפעילות כשיטה לניתוח חמשת מתחמי שרשרת הנשימה של hESCs.
פרוטוקול
רזולוציה גבוהה נקה Native ג'ל Electophoresis (hrCNE) עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי In-Gel פעילות מבחני
בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נשמרו על monolayer של C-שטופלו fibroblasts ˠ מוקרן או mitomycin עכבר עובריים (MEFs), אחר כך עברו על צמיחה Matrigel במשך 5 ימים במדיום MEF ממוזג באמצעות תנאים סטנדרטיים. כדי להסיר זיהום MEFs, hESCs היו מחדש מצופה על Matrigel גדל במדיום MEF ממוזג עבור 3 ימים נוספים. מיקרוסקופיה immunofluorescence עבור סמנים pluripotency אוקטובר-4 ו SSEA-4 שימש כדי לאשר את חוסר בידול hESC.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בסרטון הזה, שתיארנו החילוץ של קומפלקסים חלבונים מן המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים, הפרדה שלהם על ידי אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה ברור ג'ל יליד (hrCNE), וכן על ידי ניתוח לאחר מכן ב-ג'ל מבחני פעילות קטליטית. hrCNE פותר המיטוכונדריה חלבון מתחמי ממברנה ברזולוציה דומה לזה של כחול ג'ל אלקטרופורזה יליד עדיפה שכן ג'ל מבחני פעילות. טכניקה זו יכולה להיות מועסק לא רק לכמת המיטוכונדריה מתחמי הנשימה IV אלא גם לנתח את הרכב למקטע של כל חלבון מורכב קרום המיטוכונדריה הן hESCs והן נגזרות הצאצאים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים כיום על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לד"ר קרלה קוהלר (UCLA) ואנשי מעבדה קוהלר למתן עצות ותובנות אלה ומחקרים נוספים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | כוון pH ל-8.0 באמצעות NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M Sodium succinate | Fisher Scientific | S413-500 | |
| בופר Sodium phosphate 0.1M, pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 and BP329-1 | ערבב 68.4 ml של 1M Na2HPO4 ו-31.6 ml של 1M NaH2PO4 להכנת בופר sodium phosphate בריכוז 0.1M עם pH 7.2 בטמפרטורה של 25 C |
| 1M Tricine, pH 7.0 (כוון באמצעות NaOH) | EMD Millipore | 9010 | שמור ב-4 C |
| 1M imidazole/HCl, pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | שמור ב-4 C |
| 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (משקל/נפח) dodecyl-b-D-maltoside (DDM) | Fluka | 44205-500MG | מומס במים. שמור אליקוטים של 1 ml בטמפרטורה של –20 C. |
| 10% (משקל/נפח) digitonin (>50% טוהר, נעשה שימוש ללא גביש מחדש) | Fluka | 37008-1G | מומס במים. שמור אליקוטים של 0.1–1 ml בטמפרטורה של –20 C. יש לחמם ל-95 C לפני השימוש. |
| 2M 6-aminohexanoic acid | Fluka | 07260-100G | שמור ב-4 C |
| תמיסת מלאי 10x Ponceau S/glycerol | Sigma-Aldrich | P-3504 and G6279-1L | 0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (משקל/נפח) במים. |
| 10% משקל/נפח sodium deoxycholate | Fluka | 30970-25G | מומס במים. יש להגן מאור. כוון pH ל-7.0 באמצעות HCl, סנן ושמור בטמפרטורת החדר. |
| 250 mM phenazine methasulfate (PMS) | TCI America | P0083 | מומס ב-DMSO וחולק לאליקוטים. שמור בטמפרטורה של –20 C. |
| Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Grade I, מינימום 99% |
| beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) בצורה רדוקטית | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrome c מלב לב סוס | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitor cocktail) | Sigma-Aldrich | P8340 | שמור בטמפרטורה של – 20 C. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| צבע Trypan blue 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x Trypsin (0.5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| מעכב Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
מקורות
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Pr....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
