$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
רזולוציה גבוהה נקה Native ג'ל Electophoresis (hrCNE) עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי In-Gel פעילות מבחני
בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נשמרו על monolayer של C-שטופלו fibroblasts ˠ מוקרן או mitomycin עכבר עובריים (MEFs), אחר כך עברו על צמיחה Matrigel במשך 5 ימים במדיום MEF ממוזג באמצעות תנאים סטנדרטיים. כדי להסיר זיהום MEFs, hESCs היו מחדש מצופה על Matrigel גדל במדיום MEF ממוזג עבור 3 ימים נוספים. מיקרוסקופיה immunofluorescence עבור סמנים pluripotency אוקטובר-4 ו SSEA-4 שימש כדי לאשר את חוסר בידול hESC.
- לשטוף עם תאים חמים 1x PBS, pH 7.4, ואחריו trypsinization (1ml של 1x טריפסין היטב לכל צלחת 6-באר) במשך 5 דקות.
- הוסף נפח שווה של מעכבי טריפסין טריים (ב 1mg/ml 1x PBS, pH 7.4). קציר תאים צנטריפוגות ב 200 גרם, 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
- מחק את התאים pelleted supernatant ו resuspend ב 0.8 - 1.7ml (מבוסס על גודל תא גלולה) של קרח קר חיץ בידוד המיטוכונדריה (83mM סוכרוז; 6.6mM imidazole / HCl, pH 7.0) עם המוכן טרי קוקטייל "מעכבי פרוטאז 1. לדגור על הקרח במשך 10 דקות.
- Dounce תאים עם homogenizer (~ 40-50 משיכות). הכתם aliquot של תאים dounced עם trypan כחול כדי לבדוק השלמות של homogenization באמצעות מיקרוסקופ אור.
- צנטריפוגה ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להשיג גולמי המיטוכונדריה גלולה שמכיל גם גרעינים ושברי תאים גדולים יותר. למזוג וזורקים supernatant ולשקול גולמי זירז המיטוכונדריה גלולה. גלולה יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C בעקבות הקפאה מיידית של חנקן נוזלי אם זו נקודת עצירה.
הערה: צנטריפוגה דיפרנציאלי או שיפוע מבוססי הליכים יכול לשמש לבידוד איסוף חלק טהור קרום המיטוכונדריה. ראו נ"צ. 4 לקבלת פרטים. גישה חלופית זו תניב את פעילות המיטוכונדריה מורכבים לכל מיליגרם של חלבון המיטוכונדריה במקום פעילות מורכבת לכל מיליגרם של משקל תא או מספר תאים. ריכוז של חלבונים במיטוכונדריה יהיה צורך נקבע לאחר טיהור לעשות את ההשוואה הזאת. כמו כן, חיץ בידוד שונים עשויים להידרש לגישה זו. עבור solubilization של חלק קרום טהור המיטוכונדריה, ראה את ההערה הבאה לשלב 6 למטה.
- Solubilize הגולמי המיטוכונדריה גלולה על הקרח ידי vortexing עם חיץ קרים solubilization (NaCl 50mm, 50mm imidazole / HCl pH 7.0, 1mm EDTA, 2mm 6-aminohexanoic חומצה). חומצה 6-aminohexanoic יכול להיות מוחלף עם קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x. השתמש 35μl של חיץ solubilization לכל 20mg משקל גלולה. הוסף 20μl של 10% w / v digitonin לכל 20mg משקל גלולה ומערבבים ידי מצליף את הצינורית. דגירה של 50-10 דקות על הקרח. Dodecyl-BD-maltoside או טריטון X-100 ניתן להחליף digitonin כדי solubilize את החלבונים. הבחירה של חומר ניקוי וכמותו עלול להשפיע על היווצרות supercomplexes או צורות multimeric של קומפלקסים המיטוכונדריה. לקבלת מידע נוסף, ראה ref.1.
הערה: כמות של חומר הניקוי הנדרש solubilize שבריר טהור קרום המיטוכונדריה המתאים יחס כביסה / חלבון משקל החל 2-6g / g. יחס אופטימלי solubilize ממברנות המיטוכונדריה היא 2.5G / g dodecyl-BD-maltoside, 3G / g טריטון X-100, ו - 6 גרם / g digitonin.
- צנטריפוגה גלולה solubilized ב 100.000 גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. אסוף את supernatant ברור.
- הוסף טעינה חיץ גליצרול הסופי w / v 5% ו 0.01% w / v Ponceau S (שימוש של 50% w / v גליצרול, 0.1% w / v החיץ טעינה S Ponceau פתרון המלאי).
- טען בארות ג'ל עם נפח המכיל 20-40 מג של המיטוכונדריה גולמי גלולה לכל נתיב. השתמש שיפוע acrylamide ג'ל (4 -13%) עם 3.5% לערום ג'ל.
הערה: הכנת ג'ל אלקטרופורזה ותנאים:
להכנת ג'ל, השתמש acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 לערבב כדלקמן: 48g של acrylamide ו 1.5g של bisacrylamide (49.5% T, 3% ג T איפה הוא ריכוז מוחלט של AA ו bisAA ו-C הוא אחוז crosslinker (bisAA) כדי מונומר סה"כ).
ג'ל חיץ (3 '): 6-1.5M aminohexanoic חומצה; imidazole 75mm, pH 7.0
| צבע ג'ל: | 4% | 13% | הערמה ג'ל: | 3.5% |
| AA / bisAA לערבב 3 | 2 מ"ל | 6.5 מ"ל | | 0.6 מ"ל |
| ג'ל חיץ 3 " | 8.3 מ"ל | 8.3 מ"ל | | 2.7 מ"ל |
| גליצרול | | 5 גרם | | |
| H 2 O | 14.7 מ"ל | 5 מ"ל | | 4.7 מ"ל |
| סך נפח | 25 מ"ל | 25 מ"ל | | 8 מ"ל |
| 10% APS | 139 μl | 125 μl | | 67 μl |
| TEMED | 14 μl | 12.5 μl | | 6.7 μl |
חיץ האנודה: 25mm imidazole / HCl, pH 7.0
חיץ קטודה: Tricine 50mm, 7.5mM imidazole / HCl, 0.02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0.05% w / v deoxycholate, pH 7.0
יוצקים ולהפעיל ג'לים בחדר קר (4-7 מעלות צלזיוס). המתח הראשוני נעשה שימוש הוא 100V. כאשר המדגם נכנס ג'ל הערמה, המתח עולה עד 500V עם מוגבלות הנוכחית 15mA (0.15 עבור "14" 14 ס"מ ג'ל). אלקטרופורזה היא נעצרה לאחר 3-4 שעות, כאשר קו חד של צבע אדום Ponceau S גישות הקדמי ג'ל. לחלופין, ג'ל ניתן להפעיל ולינה 70-100V עם מתח קבוע.
- In-ג'ל פעילות מבחני. זמן הדגירה של assay כל תלוי היעילות של solubilization חלבון כמות החומר טעון בכל טוב. תסביכים אני, IV ו-V בדרך כלל תשואה אותות חזקים יותר מתחמי II ו-III.
אני קומפלקס (CI)
דגירה את הפרוסה עם ג'ל CI חיץ (5mm טריס-HCl, pH 7.4, 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.
CI חיץ: הוסף לכל 100 מ"ל של 5mm טריס-HCl, pH 7.4:
0.01g NADH
0.25g NBT
תקן את ג'ל מתנול 50% חומצה אצטית 10% דק '15-45. הג'ל קבוע נשמרת חומצה אצטית 10%.
קומפלקס II (כת"ש)
דגירה את הפרוסה עם ג'ל CII חיץ (נתרן 20mm succinate; methasulfate phenazine 0.2mM; 2.5mg/ml NBT, 5mm טריס-HCl pH 7.4) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.
כת"ש חיץ: הוסף לכל 100 מ"ל של 5mm טריס-HCl, pH 7.4:
200μl נתרן 1M succinate
80μl methasulfate phenazine (PMS 250mm מומס DMSO)
0.25g NBT
תקן את ג'ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני
קומפלקס III (CIII)
דגירה את הפרוסה עם ג'ל CIII חיץ (סודיום פוספט 50mm, pH 7.2, 0.05% 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.
CIII חיץ: הוסף לכל 100 מ"ל של pH נתרן פוספט, 50mm 7.2:
50 מ"ג tetrahydrochloride diaminobenzidine
תקן את ג'ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני
קומפלקס IV (CIV)
דגירה את הפרוסה עם ג'ל CIV חיץ (סודיום פוספט 50mm, pH 7.2, 0.05% 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), לב 50μM סוס ציטוכרום c) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.
CIV חיץ: הוסף לכל 100 מ"ל של pH נתרן פוספט, 50mm 7.2:
50 מ"ג tetrahydrochloride diaminobenzidine
לב 0.1g סוס ציטוכרום c
תקן את ג'ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני
קומפלקס V (CV)
דגירה הפרוסה ג'ל עם קורות חיים חיץ (35mm טריס בסיס, גליצין 270mM, pH 8.3 במהירות של 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0.2% w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות.
קורות חיים למאגר: 100 מ"ל לכל פתרון להוסיף:
| טריס בסיס | 0.424g |
| גליצין | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
אין צורך להתאים את ה-pH (צריך להיות 8.3) - לא להשתמש חומצה או בסיס. סנן ולהוסיף
תקן את ג'ל מתנול 50% למשך 30 דקות ומעבירים למים.