סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, הופכים אותו לכלי אידיאלי ללימוד ביטוי גנים במוח, בצינור העצבי, somite היווצרות primordia לב. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בהר 2 צבעים שלם הכלאה באתרו, ראשית, העובר גזור מן הביצה ואת קבוע paraformaldehyde. שנית, העובר עיבוד עבור prehybridization. העובר היא הכלאה אז עם שתי בדיקות שונות, אחת יחד לחפור, ואף אחד מצמידים את FITC. בעקבות הכלאה בין לילה, העובר הוא מודגרות עם נוגדנים בשילוב לחפור. תגובת צבע על מצע DIG מבוצע, ואת האזור של עניין נראה כחול. העובר הוא מודגרות אז בשילוב עם נוגדנים FITC. העובר מעובד לתגובת צבע עם FITC, ואת האזור של עניין נראה אדום. לבסוף, העובר מקובע ומעובד phtograph ואת חתך. מדריך לפתרון בעיות מוצג גם.
פרוטוקול
חלק 1: תיקון העוברים
- מלאו צלחת דיסקציה עם קרח קר depc-PBS. שמור על הקרח. פתח את הביצה על ידי הקשה על פגז עם מלקחיים ולהסיר חתיכות הקליפה.
- הסר עבה אלבומין עם מלקחיים. הטיה שק חלמון עם מלקחיים גס כל כך העובר הפונה כלפי מעלה.
- בעזרת מספריים לחתוך ריבוע של שק חלמון סביב העובר.
- בעזרת כף, להסיר העובר מן החלמון ומניחים על קרח קר depc-PBS.
- מתחת למיקרוסקופ, להסיר ממברנות חלמון ולהעביר לצלחת קיבעון.
- הצמד מטה, להסיר depc-PBS. החלף PFA 4% ב-PBS depc ולתקן O / N ב 4 ° C.
- הסר מקבע. החלף עם קרח קר depc-PBS. באמצעות מחט סוף בוטה microcapillary או סכין microdissection, לחרר את מערכת העצבים ואת החללים בלב, כדי למנוע השמנה של בדיקה.
- לשטוף 2x 10 mn depc-PBS עם 0.1% Tween-20 (PBT). מייבשים 10 mn כל אחד 25%, 50%, 75% מתנול PBT. מייבשים עוברים פעמיים מתנול 100%. חנות ב -20 מעלות צלזיוס מתנול.
חלק 2: Prehybridization
- רעננותם עוברים 10 mn כל אחד 75%, 50% מתנול 25% PBT. לשטוף 2x 10 mn ב PBT.
- בינתיים, להכין מקבע קרים (paraformaldehyde 4% PBT). החלף PBT עם פתרון K proteinase (3 מ"ל / בקבוקון; [? 5 גרם / מ"ל] הסופי PBT). ודא את הבקבוקון כולו חשוף הפתרון K proteinase ידי בעדינות מגלגלים את הבקבוקון, ראה פתרון בעיות עבור זמני חשיפה.
- באמצעות RNase חינם פיפטה פסטר להסיר proteinase K ולהוסיף מקבע (2 מ"ל). מיד מקום על קרח בדיוק 20 mn.
- שוטף כל RT מבוצעות על nutator. לשטוף 2x 10 mn ב PBT, ו 1x 10mn ב PBT המכילות חיץ הכלאה של 50%.
- לשטוף 1x במאגר הכלאה. לדגור על 65 מעלות צלזיוס חוצץ 2 מ"ל הכלאה של 4-5 שעות.
חלק 3: עוברים להכליא עם בדיקות
- לחפור FITC סינתזה בשילוב בדיקה מתואר בנספח. החללית צפויה לתת איתות חזק, צריך להיות עם synhesized FITC המכילים נוקלאוטידים; בדיקה חלש צריך להיות מסונתז עם עם DIG המכילים נוקלאוטידים.
- בדיקות Prewarm במאגר הכלאה (500 ng / ml כ"א) באמצעות בקבוקון 2 מ"ל. מיד להחליף את החיץ הכלאה עם פתרון בדיקה. אל תתנו עוברים יבש. דגירה של 16 שעות ב 65 ° C.
- החלף בדיקה עם חיץ הכלאה, 2 שוטף, כל 30 mn ב 65 ° C. שטפי 15 mn במאגר הכלאה / MABT (1 / 1 v / v /) בשעה 65 ° C.
חלק 4: הדגירה DIG נוגדן וצבע תגובה
- לשטוף 2x20 mn ב MABT. שטפי 1 שעות ב 2% BBR / MABT. לשטוף 5 שעות ב -2% BBR/20% היס / MABT (חסימת חיץ). דגירה של נוגדנים DIG 1:2000 מדולל חיץ חסימה, O / N ב 4 ° C על nutator.
- לשטוף 3x 10 mn כל MABT, ואת שעות 3x 1 כל MABT.
- לשטוף 2x 20 mn ב NTMT. הוסף NBT / BCIP המצע 200ul כדי NTMT 10 מ"ל. מיד להסיר NTMT מבקבוקון ולהחליף חיץ 1-2 NBT / BCIP מ"ל. מקום חשוך. צג התגובה צבע אחרי 20 mn, ובו 20 מרווחי mn לאחר מכן.
- בעקבות התגובה צבע (אמור להופיע כחול), להתרחץ PBS עבור 10 mn, להצמיד על צלחת קיבוע מלא PBS, ולהחליף פתרון עם PFA 4% ב-PBS. תקן O / N ב 4 ° C.
- העברה בקבוקון scintillation חדש. שטפי ב PBST (PBS עם 1% Tween-20) 2x10 mn. שטפי ב MABT 2x 10 mn.
- מדגירים את MABT 30 mn ב 63 ° C.
חלק 5: הדגירה נוגדן FITC וצבע תגובה
- לשטוף 2x 10 mn ב MABT, 1 שעות ב 2% BBR / MABT, 5 שעות במאגר חסימת
- דגירה של אלקליין phosphatase מצמידים אנטי FITC-נוגדן (1:500) O / N ב 4 ° C.
- לשטוף 3x 10 mn כל MABT, ואת שעות 3x 1 כל MABT.
- שטפי ב 2x 20 mn ב TBS pH 8.45% עם 0.1 Tween-20 (TBST).
- הכן וקטור האדום פתרון עובד (5 מ"ל) ב TBST באמצעות ריאגנטים 1,2 ו 3 המסופק בערכה. מיד להסיר TBST מבקבוקון ולהחליף חיץ האדום וקטור. מקום חשוך. צג התגובה צבע אחרי 40 mn, ובו 30 מרווחי mn לאחר מכן.
- צבע בעקבות התגובה (אמור להופיע אדום), עוברי העברה PBS.
חלק 6: קיבוע ועיבוד
- העברה צלחת קיבעון המכיל PBS, ולתקן PFA ב -4% במשך 20 mn ב RT או O / N ב 4 ° C.
- שטפי ב-PBS, 2x 10 mn. כדי תהליך הצילום, להעביר גליצרול 20% PBS (זו יהפכו את העוברים שקוף). כדי ליצור חדר, לחתוך 2 רצועות של סרט PVC, להרכיב אותם בשקופית. גזור ריבוע במרכז באמצעות להב. הסר את מלקחיים באמצעות מרובע.
- כדי תהליך חתך שעווה, להעביר בחזרה PBS, לשטוף 2x 10 mn, מייבשים בסדרה מדורגת של מתנול (25%, 50%, 75% ו 100% ב-PBS, 10 mn כל אחד).
- החלף propanol, 3mn. החלף 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, ואחריו 20 mn ידי Histoclear (2x 1 שעות). החלף histoclear / שעווה 01/01 (v / v) 60 ° C עבור 1 שעה. החלף בשעווה תהליךעבור היסטולוגיה.
חלק 7: פתרונות
חיץ הכלאה, בכל חנות -20 מעלות צלזיוס פלקון, 50 מ"ל: 25 מ"ל לפוראמיד; 3.25 מ"ל (20xSSC); 0.5 מ"ל (EDTA 0.5m); 1 מ"ל (10% Tween-20); 2.5 מ"ל (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA). 100ul (50 מ"ג / מ"ל הפרין) MABT, להכין חומצה maleic 100mm; pH עד 7.5 עם NaOH כדורי. הוסף 150mm NaCl ו - 0.1% Tween-20.
NTMT (עשה רק לפני השימוש), 50 מ"ל: 1ml (NaCl 5M); 2.5 מ"ל (טריס-2M HCl pH9.5); 1.25 מ"ל (2M MgCl 2); 5 מ"ל (10% Tween-20).
TBST: טריס-HCl 0.1M, 0.15M NaCl, pH 8.45, 0.1% Tween-20.
חלק 8: פתרון בעיות
| בעיה | לגרום | תרופה |
|---|---|---|
| העובר מכורבלת | התייבשות התייבשות מספיק / | שמור על 10 מרווחי mn במהלך התייבשות / התייבשות צעדים רצופים |
| אין אות בדיקה | בדיקה נפגעת זיהום RNase בבקבוקון | הפעל בדיקה על 1% agarose ג'ל ודא את הבקבוקון כולו חשוף הפתרון K proteinase בשלב 2 |
| בדיקה היא תוויות חללים הלב בצינור העצבי | בדיקה לכוד | בשלב 2, ודא חללים כל microdissection מחורר באמצעות סכין או microcapillary |
| העובר התפרקה הכלאה הבא (שלב 3) | צעד proteinase K שמאל טמפרטורה הכלאה זמן רב מדי הוא גבוה מדי | Proteinase K אסור להשאיר יותר 1mn (שלבים 3 + ו 4), 2 mn (שלב 5 עד 7), 3 mn (שלב 80-10), 4 mn (שלב 11-13) אל להכליא ב T o גבוה מ 65 מעלות צלסיוס |
חלק 9: תוצאות נציג
עוברים נציג מוצגים להלן: (א) העובר (בשלב HH7) התווית בדיקה DIG-סוקס (כחול) לבין FITC-delta-1 בדיקה (אדום). (ב) העובר (בשלב HH8) התווית בדיקה DIG-Pax6 (כחול) בדיקה FITC-ששש (אדום). NF, עצביים לקפל, ANP, צלחת עצביים PSM הקדמי, והמזודרם presomitic, n, notochord, nt, בצינור העצבי). בדיקה מתנות במעבדות של בני הזוג. ג תבין, מ Goulding, ד אנריקה, וג' בריסקו. 
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הר 2 צבעים כולו בשיטת הכלאה באתרו משמש כדי לקבוע הן תבניות במרחב ובזמן של ביטוי גנים, תוך שימוש באחד או שני גנים של עניין. היישומים כוללים הערכת דפוסי ביטוי גנים של גנים הרומן (למשל 1,2, כמו גם שינויים עלבון גן הביטוי הבא (מניפולציות עובריים 3, 4 חרוזים, ו electroporation של רנ"א או דנ"א בונה 5).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין הצהרות על ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| ביצים | חיה | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| סטריאומיקרוסקופ | מיקרוסקופ | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| אינקובטור אוטומטי Marsh | כלי | Lyon | RX | |
| אינקובטור להיברידיזציה | כלי | Hybaid | Micro-4 | |
| מערבל אורביטלי Adams Nutator | כלי | Fisher Scientific | 14-062 | |
| פינצטה מעוקלת (1) | כלי | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| מספריים עדינים | כלי | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| כף | כלי | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| פיפטה קפילרית של פסטור | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| צינור מיקרוקפילרי | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | מתיחה באמצעות מושך מיקרופיפטות אנכי; קהיית הקצה באמצעות פינצטה עדינה | |
| סכין מיקרו-דיסקציה | Fine Science Tools | 10056-12 | משמש לניקוב חללים לפני היברידיזציה in situ | |
| סיכות Minuten בקוטר 0.2mm | Fine Science Tools | 26002-20 | שמירה על הסיכות יחד באמצעות בוחש מגנטי; | |
| סוכן הקשחה ובסיס סיליקון אלסטומר Sylgard 184 | ריאגנט | Dow Corning | 0001986475 | ערבוב של חלק אחד מסוכן ההקשחה ו-9 חלקים מהבסיס; הקשחה למשך הלילה ב-37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | ריאגנט | Acros Organics | 10025025 | הוספת 1ml depc ל-1l PBS; ניעור; אוטוקלאב |
| 16% PFA | ריאגנט | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | ריאגנט | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | מלאי בריכוז 10 mg/ml ב-depc-H2O באליקוטות של 10ul. אחסון ב-20C- | |
| Formamide, דה-יוניזציה | ריאגנט | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | ריאגנט | Invitrogen | 15401-011 | מלאי בריכוז 20 mg/ml ב-depc-H2O באליקוטות של 125ul. אחסון ב-20C- |
| מלח נתרן של Heparin | ריאגנט | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | מלאי בריכוז 50 mg/ml ב-depc-H2O באליקוטות של 100ul. אחסון ב-20C- |
| SSC x20 pH5.5 | ריאגנט | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | ריאגנט | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| חומצה מאליאית | ריאגנט | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | ריאגנט | Roche Group | 11096176001 | שימוש בריכוז 2% ב-MABT. להכנה, חימום עם MABT למשך 20 דקות ב-60C. ניתן להכין מלאי ולאחסן באליקוטות של 1-5 ml ב-20C |
| סרום כבשים שעבר אינאקטיבציה תרמית | ריאגנט | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | המסה ב-10 ml H2O; חימום ב-550C, 30 דקות. חלוקה לאליקוטות של 1ml, ב-20C- |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | ריאגנט | Roche Group | 11093274910 | |
| תמיסת מלאי NBT/BCIP | ריאגנט | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | ריאגנט | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| ערכה למצע Alkaline Phosphatase מסוג Vector Red | ריאגנט | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | ריאגנט | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | בתוך מ !='')ך |
מקורות
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
