פיתחנו את תגובת חזותית-Motor כדי לכמת את הפלט המוטורי של דג הזברה הזחל בתגובה במרווחים ו decrements אור. בחנו גם מוטנטים דג הזברה חזון, כולל לא optokinetic (NRC) מוטנטים בתגובה, אשר נחשבו עיוור לחלוטין, כאשר נבדק על ידי assay אחר חזון, רפלקס optokinetic.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור
במאמר זה
סיכום
תקציר
רפלקס optokinetic (OKR) היא של Visual Basic רפלקס הוצגו על ידי רוב בעלי החוליות ואת ממלא תפקיד חשוב בייצוב עין יחסית למקום חזותית. עם זאת, OKR מחייב חיה לזהות פסים נעים יתכן כי דגים אינם תערוכה OKR לא יכול להיות עיוור לחלוטין. דג הזברה מוטציה אחת, תשובה ג optokinetic (NRC) אין OKR בכל תנאי אור נבדק נמסר להיות עיוור לחלוטין. בעבר הראינו כי OFF-הגנגליון פעילות התא יכול להיות מוקלט מוטנטים אלו. כדי לקבוע אם דגים מוטנטים עם OKR אין כמו מוטציה NRC יכול לזהות במרווחים של אור פשוט decrements פיתחנו את assay חזותי מנוע התנהגותיות (VMR). ב assay זה, זחלים דג הזברה יחיד ממוקמים היטב בכל צלחת 96-היטב המאפשר ניטור סימולטני של הזחלים באמצעות מערכת אוטומטית, מעקב וידאו. התגובות של תנועה של כל זחל עד 30 דקות אור ו -30 דקות את האור הוקלטו לכימות. דגים WT יש עלייה קצרה של פעילות מוטורית על האורות דולקים, המכונה תגובת בהלה, ואחריו לחזור נמוכה מאשר פעילות המחקר, שנקרא להקפיא. דגים WT גם להגביר את הפעילות של תנועה חדה שלהם מיד לאחר כיבוי האורות, ורק בהדרגה (מעל מספר דקות) לחזור לפעילות בסיסית של תנועה. מוטנטים NRC להגיב באופן דומה אור OFF כמו דג WT, אבל התערוכה ירידה קלה בפעילות הממוצעת שלהם לעומת דגים WT. פעילות מוטורית בתגובה אור ב NRC מוטנטים מתעכב ועכור. יש זמן עלייה איטית של התגובה NRC מוטציה לאור ON לעומת אור WT על התגובה. תוצאות המחקר מראות כי דגים NRC אינם עיוורים לגמרי. מכיוון teleosts יכול לזהות אור דרך אי - רשתית רקמות, אנו אישר כי תגובות התנהגותיות מיידית אור עוצמת השינויים דורשים עיניים שלם באמצעות (chk) מוטנטים chokh, אשר לחלוטין חוסר העיניים החל מהשלבים המוקדמים של הפיתוח. ב assay VMR שלנו, מוטנטים chk התערוכה אין תגובת בהלה לאור או כבוי, מראה כי בעיני לרוחב לפשר התנהגות זו. Assay VMR המתואר כאן משלים את assay ומבוססת OKR, אשר אינו לבחון את היכולת של הזחלים דג הזברה להגיב לשינויים בעוצמות אור. בנוסף, אוטומציה של assay VMR ניתנת ההקרנה תפוקה גבוהה עבור פגמים עוצמת אור מונע תגובות חזותית.
פרוטוקול
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים כדי לבצע את תגובת חזותי מוטורי זחלים של דג הזברה כדי במרווחים ו decrements אור במעבדה שלך. דג הזברה הם מערכת מודל נהדר עבור מחקרים התנהגותיים. הם קל לשמור, הם גדלים המצמד גדולים, הם מתפתחים מהר. לדוגמה, עיניו של דג הזברה הזחלים מגיבים לאור יום 3 הפיתוח בו בזמן הם מפגינים תגובת בהלה.
חלק 1: ציפוי דגים בודדים לתוך צלחת 96 היטב
- לגדל זחלים WT תחת מחזור....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוצדורות אנחנו מראים בסרט הם כל נציג של דגים WT. עם זאת, הניסויים הללו ניתן לעשות זאת באנלוגיה על דגים מוטנטים, כמו גם (ראה סעיף נציג תוצאה). אנו ממליצים על צלחת דגים WT דגים מוטנטים על הצלחת באותו מתווה לוח דמקה למטרות שליטה אופטימלית.
בעת שימוש דגים מוטנטים בצלחת כמו דג WT לוודא שאתה כותב איזה סוג של דג היה מצופה היטב כל אחד. הנה הצעה כיצד לעקוב אחר הדג מצופה בכל טוב (הצג הספר פתק עם גיליון נתונים).
כמו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים EY0081 ו 5T32UY07145 ועל ידי קרן האבירים הטמפלרים העין. ג'ייסון Rihel הוא עמית Bristol-Squibb של מדעי החיים Research Foundation.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| מכשירי מיקרופלטה | כלי | Whatman, GE Healthcare | 7701-1651 | |
| פיפטות העברה | כלי | VWR international | 202205 | |
| מי דגים | ריאגנט | עיינו במקור מס' 4 | ||
| תאי הקלטה (Zebrabox) | כלי | Viewpoint Lifesciences | ||
| תוכנת Videotrack | כלי | Viewpoint Lifesciences |
מקורות
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
