Name: עובריים, נגזר גזע לתאי אנדותל לטיפול איסכמיה Hindlimb (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למדו כיצד להזריק תאי אנדותל נגזרים מתאי גזע עובריים לרגל אחורית איסכמית בעכברים. השיטה כוללת מעקב לא פולשני באמצעות דימות ביולומינסנציה להערכת יעילות הטיפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים אנדריאה Axtell, סטושי Itoh, MD, ג&#39;ף Velotta, MD, גרנט הויט, רוברט ג רובינס, MD, יו ג&#39;ין, MD, טים דויל, PhD, והדמיה הקטן סטנפורד בעלי חיים Core לקבלת סיוע טכני. המחברים גם להודות AM ביקפורדס, Inc התמיכה של ציוד וטרינרי. מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר מן המכון הלאומי לבריאות (HL-75774 R01, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), טבק קשורות קליפורניה מחלות תוכנית המחקר של אוניברסיטת קליפורניה (15IT-0257 ו-1514RT 0169) , ומכון קליפורניה עבור הרגנרציה לרפואה (RS1-00183). NH נתמך על ידי מענק של איגוד הלב האמריקני. איגוד הלב יכול.

1. דיפרנציאציה של ESCs Murine לתאי אנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול עבור המבדילים ESCs לתאי אנדותל מתואר במקומות אחרים ולא מוקד בפרוטוקול זה 2,3. בקצרה, התאים מותר להבדיל, ואת התאים חיובית עבור סמנים האנדותל כגון CD31 או cadherin אנדותל כלי הדם (VE-cadherin) הם מטוהרים מכן על ידי מיון הקרינה התא הפעיל (FACS). </li></ol> 2. בנייה של ג&#39;ין כתב פעמיים היתוך ו transduction lentiviral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליטת אור ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התאים שונה כדי להביע את הגנים הכתב כמו גחלילית בלוציפראז (fluc). עבור יישום זה, התאים שלנו מכילים הקרינה הן fluc משופרת ירוק חלבון (eGFP) גן היתוך בשליטת היזם היוביקוויטין פנימי. כדי לשנות את התאים, את וקטור lentiviral transgene המכיל אלמנטים גנטיים מפתח מותאם למלא ביו בטיחות קריטריונים, כמו גם יעילות מוגברת התמרה, pFU-FG וקטור שפותחה במעבדה שלנו נושאת את fluc-eGFP כתב הגן היתוך ניתן להשתמש ביציבות transduce בתאים לאחר התמיינות. זה מאפשר לבנות היתוך הן פליטת אור ומעקב הקרינה של התאים המושתלים. ההליך להפקת חלקיקי נגיף, התמרה הייצור של תאים שכותרתו כי הגנים להביע כתב מתואר במקומות אחרים 4. </li></ol> 3. השתלה של ESC שמקורם בתאי האנדותל כדי hindlimb איסכמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין ההליך על ידי הכנת עכבר שעבר איסכמיה hindlimb עבור השתלת תאים. כדי לעשות זאת, במקום את העכבר לתוך תא הרדמה אינדוקציה המכיל 1-3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1L/min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא לא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מבית הבליעה אינדוקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, במקום חיה במצב פרקדן על שולחן הניתוחים ולחבר אותו זרם מתמשך של 1-3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1L/min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את עור hindlimb עם שלושה עלובי לסירוגין בבטאדין ואלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניקוי העור, להשיג 1,000,000 ESC שמקורם בתאי האנדותל ב 30 μL של פוספט בופר סליין (PBS). טען תאים אלה לתוך מחט מד 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים מוכנים, בעדינות להרים להאריך את hindlimb כדי להמחיש טוב יותר את המיקום של שריר הגסטרוקנמיוס. בעוד רגל מוארך, הכנס את המחט דרך העור לתוך השריר הבסיסית. הקפד לא הגישה את העצם. בעדינות ולאט לאט להזריק את התערובת 30 תא μL לתוך הגסטרוקנמיוס. עבור זריקה תוך שרירית, 30 μL הוא קרוב לגבול של נפח כי ניתן להזריק. לכן, 28-מד אינסולין מזרקים הם העדיפו, משום שעל פי הניסיון שלנו, הם לחסל את נפח הפסד מחטים המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקת תושלם, להחזיר את העכבר לכלוב התאוששות ולנטר אותה ברציפות עד ערה. אפשר החיה להתאושש במשך מספר שעות ולאחר מכן להמשיך עם פליטת אור בתחום ההדמיה vivo של התאים המושתלים. </li></ol> 4. פליטת אור הדמיה של ESC שמקורם בתאי האנדותל in vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המושתלים ESC-derived תאים endothelials שונו כדי להביע גם את fluc ואת הגן היתוך eGFP בשליטת היזם היוביקוויטין פנימי. לכן, פליטת אור ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תאים בתוך hindlimb איסכמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הצעד הזה, להפעיל את מערכת פליטת אור הדמיה תמונה Living תוכנה הרכישה. לאחר מכן לאתחל את מערכת הרכישה לציין את הממדים של שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, שחור על גבי נייר מט מקום בתיבה הדמיה לספוג פליטת רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בתיבת הדמיה מוכן, במקום את העכבר לתוך תא הרדמה אינדוקציה המכיל 1-3% חמצן isoflurane במוצא של 1L/min. השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא לא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מבית הבליעה אינדוקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער משני hindlimbs באמצעות מכונת גילוח חשמלית לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 10 μL של D-luciferin לגרם משקל גוף לתוך הצפק. D-luciferin מוכנה מראש לתוך פתרונות מניות מסונן של 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר luciferin מוזרק, במקום חיה לתוך תיבת הדמיה על הנייר שחור במצב שכיבה, קשור זרימה רציפה של isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצבת חיה לתוך תיבת הדמיה חיבור isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל לרכוש תמונות 10-60 שניות על מנת לקבוע זמן החשיפה האופטימלית עבורו את התמונה לא רווי. אם התמונה הופכת להיות רווי, לצמצם את זמן החשיפה. אם אות פליטת אור חלש מאוד, להגדיל את זמן החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנצליםg את זמן החשיפה האופטימלית, המשך רכישת תמונות כל 1-3 דקות עד האות מגיע לכל היותר, ואז נמוג. כאשר הרכישה הושלמה, לשמור את הקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את הנתונים, בחר אזורים של עניין (ROIs) שמכסים את ההזרקה. כביקורת שלילית, ההחזר על ההשקעה דומה ניתן לבחור עבור הרגל לא פעל. שימוש בתוכנה, למדוד את הקרינה הכוללת, אשר מבוטא ביחידות של פוטונים / שניות / 2 ס&quot;מ / steradian (P / S / cm 2 / sr), עבור ROIs עבור כל timepoint. הערך המקסימלי אמור לשמש את הנתונים הסופיים. הנתונים יכולים גם להיות מיוצא אקסל לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הנתונים רכשה, להחזיר את בעל החיים לכלוב התאוששות ולנטר באופן רציף עד מתעורר בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נוהל זה כדי לעקוב אחר תאים לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הזמן הרצוי, החיה יכולה להיות מורדמים להערכת תפקוד הרקמה. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/old/1034_2009_1_22_4/figure 1.png" alt="איור 1" width="600" height="600" /> פליטת אור נציג תמונה של התאים המושתלים בתוך hindlimb איסכמי שמאל מוצג באיור 1. במהלך רכישה של פליטת אור, עוצמת יגדל עם הזמן, ואת הערך המקסימלי שהושג במהלך הזמן צריך להיות כפי שדווח הערך הסופי.

<ol><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> JoVE. , (2008).</li>
<li>Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).</li>
<li>Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk1-positive+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+serve+as+vascular+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors.</a> Nature. 408, 926-926 (2000).</li>
<li>De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+lentiviral+vectors+in+noninvasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging.</a> Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+regulation+of+stem+cells+and+progenitor+cells%3A+potential+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).</li>
<li>Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113, 1005-1114 (2006).</li>
<li>Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+bioluminescence+reporter+gene+imaging+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

ESCs הם מקור התא מבטיח לטיפול איסכמיה רקמות בגלל הפלסטיות של בידול שלהם ויכולתם להצמיח שושלות תאים הכולל את כל שלוש שכבות נבט, כולל בתאי האנדותל. כדי להתגבר על חששות אתיים הקשורים ESCs, הנגרם לתאי גזע pluripotent (iPSCs) עשוי להיות חלופה pluripotent בתאי גזע ממקור זה מתגבר על שיקולים אתיים. מלבד ESCs, בתאי גזע בוגרים, כגון ובתאים אנדותל (EPCs) ותאי גזע hematopoietic (HSCs) יכול לשמש גם, אבל אלה סוגי תאים אולי האפקט הטיפולי מוגבלת בחולים עם PAD. משלוח תוך שרירית של תאים היא פולשנית וקלה לביצוע, וזה מצב...

<table><tbody><tr><td>כלי ניתוח</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחט מזריק</td><td>כלי</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>עדיף להשתמש במזרק אינסולין 28G</td></tr><tr><td>סלקושין פוספאטי מאוזן (PBS) </td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-לוסיפרין</td><td>ריאגנט</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td>הכינו מראש תמיסות סטוק מסוננות של D-luciferin בריכוז של 15 מ"ג/מ"ל ב-PBS</td></tr><tr><td>מערכת דימות ביו-לומינסנציה IVIS 200 ותוכנת רכישת נתונים </td><td>ציוד</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Xenogen Corporation</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

עובריים, נגזר גזע לתאי אנדותל לטיפול איסכמיה hindlimb

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

עורקים היקפית (PAD) המחלה נובעת היצרות של העורקים ההיקפיים המספקים דם מחומצן וחומרים מזינים ברגליים ובכפות הרגליים, פתולוגיה זו גורמת לתופעות כגון צליעה לסירוגין (כאב בהליכה), כיבים כואבים איסכמי, או אפילו איבר סכנת נמק. מקובל לחשוב כי האנדותל של כלי הדם, monolayer של בתאי האנדותל המשקיעה את פני השטח luminal של כל כלי הדם הלימפה, משחקת תפקיד דומיננטי הומאוסטזיס של כלי הדם ואת התחדשות כלי הדם. כתוצאה מכך, גזע מבוססי תאים התחדשות של האנדותל עשויה להיות גישה מבטיחה לטיפול PAD. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השתלת תא גזע עובריים (ESC), שמקורם בתאי האנדותל לטיפול איסכמיה hindimb חד צדדית כמודל של PAD, ואחריו מעקב פולשני של התא הישרדות ביות ועל ידי הדמיה פליטת אור. החומרים הספציפיים ונהלים למסירה תא הדמיה יתוארו. פרוטוקול זה עוקב אחר פרסום בתיאור אינדוקציה של איסכמיה hindlimb ידי Niiyama ואח&#39; 1.

הליך כירורגי עבור משלוח של תא גזע עובריים שמקורם בתאי האנדותל כדי hindlimb איסכמי הוא הוכיח, עם מעקב פולשני על ידי הדמיה פליטת אור.

עובריים, נגזר גזע לתאי אנדותל לטיפול איסכמיה Hindlimb

מחלה עורקית פריפרית (PAD) נגרמת כתוצאה מהיצרות של העורקים הפריפריים המספקים דם חומצני וחומרי הזנה לרגליים ולכפות הרגליים. זה...

מחלה עורקית היקפית. PAD נגרמת כתוצאה מהיצרות של העורקים ההיקפיים המספקים דם וחמצן לרגליים ולכפות הרגליים, מה שמוביל לתפקוד כלי דם לקוי. כדי לקבוע האם ניתן להשתמש בתאי גזע לטיפול ב-PAD, אנו מזריקים תאי אנדותל המופקים מתאי גזע עובריים לגפה האחורית לאחר השראת איסכמיה.מאחר שתאים אלו עברו מודיפיקציה כדי לבטא לוקיפראז של גחלילית, ניתן לעקוב אחריהם באמצעות דימוי בביולומינצנציה כדי לקבוע אם הם נודדים לאתר הפגיעה ואם יש להם אפקט טיפולי. שלום, אני ג'ון קוק. אני פרופסור לרפואה כאן בחטיבה לרפואה קרדיווסקולרית באוניברסיטת סטנפורד.המעבדה שלנו מתעניינת באנגיוגנזה ובהתחדשות כלי דם. בסרטון זה, שני פוסט-דוקטורנטים שלי, ד"ר Nan Wong ו-Hir Niyama, יציגו בפניכם את ההליכים להשתלה תרפויטית של תאים באיסכמיה של הגפה האחורית והדמיה לא פולשנית של הישרדות תאים. הליכים אלו כוללים את השלבים הבאים: הובלה של תאי גזע עובריים ותאי סטריאו לטיפול באיסכמיה חד-צדדית של הגפה האחורית, ומעקב לא פולשני אחר הומבינג והישרדות תאים באמצעות הדמיית bioluminescence.נתחיל בתהליך. התחל את הפרוצדורה בהכנת עכבר מזן SV 1 29 בן שמונה חודשים שעבר איסכמיה של הגפה האחורית לצורך השתלת תאים. לשם כך, הנח את העכבר בתא השראת ההרדמה המכיל 1-3% ISO fluorine ב-100% oxygen בקצב זרימה של 1 liter per minute.השאירו את העכבר בתא ההשראה עד שיהיה חסר תגובה לגירויים חיצוניים. לאחר מכן, הוציאו את בעל החיים מתא ההשראה. מקמו את בעל החיים בתנוחה גבית (supine) על שולחן הניתוח וחברו אותו לזרימה רציפה של 1% עד 3% ISO בתוך 100% Oxygen בקצב זרימה של ליטר אחד לדקה.נגב את העור של הגפה האחורית בשלוש שפשופים לסירוגין של Betadine ואלכוהול. לאחר ניקוי העור, השג 1 מיליון תאי אנדותל המופקים מתאי גזע עובריים של עכבר ב-30 µL של phosphate buffered saline. טען תאים אלו לתוך מחט בכיל 28 gauge עם PBS.כאשר התאים מוכנים, הרימו בעדינות והושיטו את הגפה האחורית כדי לדייק את הראות של מיקום שריר ה-gastrocnemius. בזמן שהרגל מושטת, הכניסו את המחט דרך העור אל השריר שמתחתיו. היזהרו שלא להתקרב לעצם והזריקו בעדינות ובאיטיות את תערובת התאים בנפח 30 µL אל ה-gastrocnemius.עבור הזרקה תוך-שרירית, 30 microliter קרוב לגבול הנפח שניתן להזריק. לכן, מזרקי אינסולין בכילייב 28 gauge מועדפים, כיוון שניסיוננו מראה שהם מונעים אובדן נפח במחטי המזרק. לאחר השלמת ההזרקה, החזירו את העכבר לכלוב ההתאוששות.יש לאפשר לבעל החיים להתאושש למשך מספר שעות, ולאחר מכן להמשיך בדימות ביו-לומינצנציה in vivo של התאים המושתלים. תאי האנדותל הגזורים מתאי ESC שהושתלו עברו מודיפיקציה לביטוי של הגן ללוציפראז של גחלילית ושל הגן המהולל של חלבון פלואורסצנציה ירוק משופר תחת בקרתו של פרומוטור אוביקוויטין פנימי. לכן, ניתן להשתמש בביו-לומינצנציה כדי לעקוב אחר התאים בתוך הגפה האחורית האיסכמית.כדי להתחיל בשלב זה, הפעילו את מערכת הדימוי הביולומניסנטי ואת התוכנה לרכישת דימויי תאיים חיים. לאחר מכן, בצעו אתחול למערכת הרכישה. לבסוף, הגדירו את ממדי שדה הראייה.לאחר מכן, הניחו נייר שטיח שחור על תיבת ההדמיה כדי לספוג פליטה מהרקע. ברגע שתיבת ההדמיה מוכנה, הניחו את העכבר בתא השראת ההרדמה המכיל 1% עד 3% isof fluorine בחמצן בזרימה של one liter per minute. השאירו את העכבר בתא ההשראה עד שיהיה חסר תגובה לגירויים חיצוניים.לאחר מכן הוצא את החיה מתא ההשראה. מזריקי 10 µL של לוציפרין לכל גרם משקל גוף אל תוך הפריטוניאום. הלוציפרין מוכן מראש כתמיסות מלאי מסוננות בריכוז של 15 mg/mL ב-PBS.לאחר הזרקת הלוציפראז, מקמו את בעל החיים בתוך תיבת הדימות מעל הנייר השחור בתנוחה גבית (supine), כאשר הוא מחובר לזרימה רציפה של ISO fluorine. התחילו ברכישת תמונות למשך 10 עד 60 שניות כדי לקבוע את זמן החשיפה האופטימלי שבו התמונה אינה רוויה. אם התמונה הופכת לרוויה, הפחיתו את זמן החשיפה.אם אות הביולומינסנציה חלש מאוד, הגדילו את זמן החשיפה. באמצעות זמן החשיפה האופטימלי, המשיכו ברכישת תמונות מדי דקה עד שלוש דקות עד שהאות יגיע למקסימום ואז ידעך. לאחר השלמת כל רכישה, שמרו את הקובץ כדי לנתח את הנתונים, ובחרו אזורי עניין (ROIs) המכסים את אתר ההזרקה כביקורת שלילית.ניתן לבחור ROI דומה עבור הרגל שאינו מנותח. באמצעות התוכנה, מדדו את הרדיאנס הכולל עבור אותם ROIs עבור כל קובץ.יש להשתמש בערך המקסימלי בנתונים הסופיים. ניתן גם לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני של Excel לשימוש עתידי. לאחר השגת כל הנתונים, החזיר את בעל החיים לכלוב ההתאוששות ועקוב אחריו עד להתעוררותו; חזור על נוהל זה כדי לעקוב אחר התאים.עם הזמן, בנקודת זמן רצויה, ניתן להקריב את בעל החיים לצורך הערכת תפקוד הרקמה. להלן מהלך זמן מייצג של דימות ביולומינצנציה של תאים מושתלים בגפה האחורית השמאלית האיסכמית יום אחד לאחר הזרקת התאים; האזור המעוגל באדום הוא אזור העניין ROI שאליו הועברו התאים. הצבע תואם למספר התאים המושתלים, כאשר צבעים אדום וצהוב מעידים על עוצמת ביולומינצנציה חזקה יותר בהשוואה לצבעים כחול וירוק.כפי שניתן לראות, הגפה המשמשת כביקורת אינה מראה ביולומינצנציה, בעוד שהגפה שהוזרקו אליה תאים מראה ביולומינצנציה חזקה במהלך רכישת אות הביולומינצנציה. אות הביולומינצנציה ב-ROI יעלה עם הזמן עד שיגיע לערך מקסימלי ולאחר מכן יירד בדמות זו. הערך המקסימלי של הביולומינצנציה, כפי שנמדד על ידי הרדיאנס המקסימלי, מתקבל ב-27 דקות מתחילת הרכישה.יש לדווח על ערך מקסימלי זה לצורך ניתוח הנתונים. הצגנו בפניכם כעת כיצד להעביר ולעקוב אחר תאים שהופקו מ-ESC בסדרה לטיפול באיסכמיה של הגפה האחורית. להליך זה יכולה לקדום השראה של איסכמיה בגפה האחורית, כפי שמוצג בסרטון JoVE אחר על ידי ER et all.בביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגביל את נפח התאים המוזרקים ב-PBS למקסימום 30 µL כדי למנוע דליפה תת-עורית של תאים. כמו כן, בעת רכישת תמונות ביולומינצנציה, יש להימנע מרוויה של עוצמת התמונה כתוצאה ממרווחי חשיפה ארוכים מדי. וזהו.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

embryonic-stem-cell-derived-endothelial-cells-for-treatment-hindlimb

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההליך הכירורגי לזירוז של איסכמיה hindlimb החד צדדית באה לידי ביטוי, עם אישור של איסכמיה על ידי הדמיה זלוף דופלר לייזר.

דגם Murine של איסכמיה Hindlimb

שיטה טיטניום זריעת דם biomaterials ליצור קשר עם תאים עצמיים ו biocompatibility בדיקות מתואר. שיטה זו משתמשת ובתאים אנדותל צינורות טיטניום, זורעים בתוך דקות של ניתוח ההשתלה לתוך חזירי venae cavae. טכניקה זו ניתנת להתאמה מכשירים רבים אחרים ביו מושתלת.

עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה

בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) מסתובבים לתאי אנדותל עם פוטנציאל חזק שגשוג משובט המוצגים...

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

אנו מתארים את השיטה של ​​תאי גזע תכנות לביטוי יתר גורמים טיפוליים לאנגיוגנזה באמצעות חלקיקים פולימריים מתכלים. תהליכים שתוארו כוללים סינתזת פולימר, transfecting בתאי גזע שמקורם בשומן במבחנה, ומאמת את היעילות של תאי גזע מתוכנתים לקדם אנגיוגנזה במודל איסכמיה hindlimb עכברי.

תאי גזע תכנות טיפולי אנגיוגנזה שימוש אורגניים פולימריים חלקיקים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.

תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

אנו מתארים הליך כירורגי המשמש כדי לגרום איסכמיה היקפית בארנבים עם היפרליפידמיה וסוכרת. ניתוח זה משמש כמודל טרום קליני לתנאים המנוסים במחלות עורק היקפי בחולים. אנגיוגרפיה מתואר גם אמצעי כדי למדוד את היקף הוכנסו איסכמיה והתאוששות של perfusion.

המודל הקליני של איסכמיה הגפיים האחוריות בארנבים סוכרתית

כאן, המודל הניסיוני הטיפולי איסכמיה מוצג ואחריו סוללה של פונקציונלי, בדיקות היסטולוגית ומולקולרית כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים אנגיוגנטית.

הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה

מוצג כאן פרוטוקול פשוט להתמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך כשבוע.

התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מחקר קליני פרוספקטיבי, אקראי ומבוקר המעריך הזרקת תאי גזע מזנכימליים מחבל הטבור האנושי לטיפול בכיבים כרוניים ברגל סוכרתית.

מחקר פרוספקטיבי, אקראי ומבוקר של הזרקת תאי גזע מזנכימליים מחבל הטבור האנושי לטיפול בכיבים ברגל סוכרתית

למדו כיצד להזריק תאי אנדותל נגזרים מתאי גזע עובריים לרגל אחורית איסכמית בעכברים. השיטה כוללת מעקב לא פולשני באמצעות דימות ביולומינסנציה להערכת יעילות הטיפול.

עובריים, נגזר גזע לתאי אנדותל לטיפול איסכמיה Hindlimb

גלה סרטונים נוספים