Name: דגם Murine של איסכמיה Hindlimb (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: למדו את שיטת הכריתה הכירורגית של עורק הירך בעכברים ליצירת איסכמיה חד-צדדית בגפיים האחוריים. השיטה מאומתת באמצעות דופלר לייזר ומסייעת בחקר מחלות עורקים היקפיות ותהליכי חידוש כלי הדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים אנדריאה Axtell, סטושי Itoh, MD, ג&#39;ף Velotta, MD, גרנט הויט, רוברט ג רובינס, MD, יו ג&#39;ין, MD, טים דויל, PhD, והדמיה הקטן סטנפורד בעלי חיים Core לקבלת סיוע טכני. המחברים גם להודות AM ביקפורדס, Inc התמיכה של ציוד וטרינרי. מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר מן המכון הלאומי לבריאות (HL-75774 R01, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), טבק קשורות קליפורניה מחלות תוכנית המחקר של אוניברסיטת קליפורניה (15IT-0257 ו-1514RT 0169) , ומכון קליפורניה עבור הרגנרציה לרפואה (RS1-00183). NH נתמך על ידי מענק של איגוד הלב האמריקני.

1. אינדוקציה של איסכמיה Hindlimb חד צדדית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי הניתוח הדרוש לפעולה זו כוללים: מלקחיים הצביע בסדר, הצביע מלקחיים, מספריים באביב, מספריים כירורגיות, מחזיק מחט, והוא מפשק. אנחנו עושים מפשק שלנו באמצעות מהדק כי הוא קטן יותר מאשר retractors זמינים מסחרית. לעקר בכלים אלה לפני הניתוח על ידי החיטוי או מעקר חם חרוז. כלי כויה וסטרילי ספוגיות כותנה דק הצביע יהיה גם צורך בניתוח זה. מומלץ כי את הכלים להיות מעוקרים מחדש בקצות כנדרש במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הכלים מוכנים, במקום את העכבר לתוך תא הרדמה אינדוקציה המכיל 1-3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1L/min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא לא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מבית הבליעה אינדוקציה. מומלץ לשטוף את ההרדמה מתיבת לפני פתיחת המכסה, כדי להקטין את החשיפה למפעיל isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז במקום חיה במצב פרקדן על השולחן מראש ההפעלה ולחבר אותו זרם מתמשך של isoflurane. באמצעות מכונת גילוח חשמלית, להסיר את השיער מן hindlimb. החל קרם להסרת שיער ביסודיות להסיר שיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בעמדת פרקדן על משטח לוהט עטוף על שולחן הניתוחים, ולחבר אותו זרם מתמשך של isoflurane. הרחב ולהבטיח את hindlimb עם חתיכת סרט. לאחר hindlimb הוא מאובטח, לנגב את העור עם שלושה עלובי לסירוגין בבטאדין ואלכוהול. במשך שארית ההליך הכירורגי, במיקרוסקופ לנתיחה בבית 10X או 20X הגדלה לקבל תצוגה מוגדלת של האזור hindlimb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר ומספריים כירורגית, לעשות חתך של העור, כ 1 ס&quot;מ, מהברך כלפי הירך המדיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש שנאגרו מלוחים פוספט (PBS), לחלח בסדר צמר גפן הצביע, בעדינות לסלק רקמות שומן תת עורי המקיפים את שריר הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, להחיל את כויה רוחבי כדי לחרות ו לנתח באמצעות רקמת שומן תת עורי כדי לחשוף את עורק הירך הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מפשק לפתוח את הפצע כדי לקבל תצוגה טובה יותר של כלי הדם בגפיים התחתונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר ספוגית כותנה דק ומחודד, בעדינות לחדור דרך מעטה הירך קרומי לחשוף את צרור neurovascular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, באמצעות מערכת נקייה של מלקחיים בסדר צמר גפן, לבתר להפריד את עורק הירך מהעורק עצב הירך ואת במיקום פרוקסימלי ליד המפשעה. לאחר דיסקציה, לעבור קווצת תפר 7-0 משי מתחת סוף הפרוקסימלי של עורק הירך. לחסום את עורק הירך הפרוקסימלית באמצעות קשרים כפולים. מניחים את העניבה על הספינה כמו הפרוקסימלי של הפצע ככל האפשר כדי להשאיר אורך לקשור את השני קטע להתערב כי יהיה transected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את עורק הירך מעורק הירך במיקום דיסטלי קרוב לברך. Pass קווצת תפר 7-0 מתחת בסוף הדיסטלי של העורק הפמורלי בקרבה העורק popliteal. לחסום את כלי השיט באמצעות קשרים כפולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את עורק הירך הדיסטלי עם קבוצה שנייה של קשרים כפולים הפרוקסימלי רק כדי להגדיר את הראשון של קשרים. סט שני של התפרים ישמש מרתק העורק במהלך ההליך העסקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, למטרות מרתק, לחסום את עורק הירך הפרוקסימלי עם קבוצה שנייה של קשרים כפולים דיסטלי רק כדי להגדיר את הראשון של קשרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transect קטע של עורק הירך בין קשרים דיסטלי וסמוך ספוגית כותנה דק מחודד מספריים האביב. היזהר לא לנקב את קיר עורק הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מפשק ולסגור את החתך באמצעות תפרים Vicryl 5-0. תפרים אלה אינם צריכים להסיר במועד מאוחר יותר, כפי שהם נמסים מעצמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתך סגור, במקום חיה על גבי משטח לוהט עטוף בכלוב התאוששות לפקח ברציפות עד ערה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיה התאוששה במשך שעה 1, להמשיך את הצעד דופלר לייזר זלוף דם כדי לאשר את הגיוס איסכמיה. </li></ol> 2. לייזר דופלר זלוף דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הצעד דופלר לייזר זלוף, במקום את העכבר לתוך תא הרדמה אינדוקציה המכיל 1-3% isoflurane ב 100% חמצן בקצב זרימה של 1L/min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את העכבר בתא אינדוקציה עד שהוא לא מגיב לגירויים חיצוניים. ואז להסיר את החיה מבית הבליעה אינדוקציה. מומלץ לשטוף את ההרדמה מתיבת לפני פתיחת המכסה, כדי להקטין את החשיפה למפעיל isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חיה על השולחן מראש ההפעלה מחובר זרימה רציפה של isoflurane. ואז להסיר את השיער מן hindlimb באמצעות מכונת גילוח חשמלית ואחריו קרם להסרת שיער לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת השיער,במקום חיה על משטח מחומם 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות תחת זרימה רציפה של isoflurane. צג הטמפרטורה הליבה כדי להבטיח euthermia, כמו שינויי טמפרטורה יהיה להשפיע במידה ניכרת זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 דקות, במקום חיה במצב פרקדן על משטח אור קליטת שאינם משקפים כגון בד בצבע ירוק, קשור זרימה רציפה של isoflurane. הרחבת hindlimbs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להפעיל את הלייזר דופלר imager ואת תוכנת הרכישה לאתחל את התוכנה. ציין את גודל שדה הראייה ואת הפתרון. עדיף לשמור את שדה הראיה וצפיפות פיקסל עקבי בין בעלי חיים על מנת להפוך בעתיד ניתוח קל יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתיחת קובץ חדש. לחצו על התחל כדי להתחיל לרכוש את נתוני התמונה. באופן כללי, imager מזהה אוטומטית את המרחק של העכבר, אבל אם תתבקש לעשות זאת, ציין את המרחק של החיה כדי imager. הלייזר יראה את הגבולות של שדה הראייה ולאחר מכן להתחיל לרכוש נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרכישה תושלם, התמונה תתחיל להופיע מגוון של צבעים המעידים על רמת זלוף דם לרגליים. צבעים ניתן להגדיר מגוון זלוף ספציפיים יותר להשוות נתונים בין בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תושלם רכישת נתונים, שמור את הקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להחזיר את החיה לכלוב התאוששות ולנטר את חיה ברציפות עד ערה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את הנתונים, השתמש התאמה לסף בתוכנה ניתוח לחסר כל רעשי רקע. סף של 0.2 בדרך כלל ערך סביר. בחר 2 אזורים של עניין, או ROIs, כי כיסוי כל שטח hindlimb. מגוון של ציוני דרך ניתן להשתמש כדי לתקנן את ההחזר על ההשקעה בין איברים חיים. ואז לקבוע את השתנות אומר זלוף וב ההחזר על ההשקעה. ההבדל זלוף זלוף יחס בין האיבר איסכמית איבר לשלוט אז יכול להיות נחוש בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך זה ניתן לחזור לעקוב אחרי השינויים זלוף hindlimb לאורך זמן. בשלב הזמן הרצוי, בעל החיים יכול להיות מורדמים לצורך הערכה של תפקוד רקמות לעומת נתוני התמונה זלוף. </li></ol> 3. נציג תוצאות: האנטומיה של vasculature hindlimb מוצג באיור 1 2. תרשים נציג hindlimb לאחר explantation עורק הירך מוצג באיור 2. כדי לאשר את הגיוס של איסכמיה של hindlimb, ניתוח לייזר דופלר תמונה זלוף מדגים הפחתה דרמטית את זרימת הדם אל איבר איסכמי, בהשוואה איבר הבקרה, כפי שמוצג באיור 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="איור 1" width="600" height="406" /> באיור 1. אנטומיה של vasculature hindlimb. כוכביות לציין את מיקומם של קשירת לזירוז של איסכמיה hindlimb. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="תמונה 2" width="600" height="450" /> איור 2. דיאגרמה נציג מראה את האנטומיה של hindlimb לאחר קשירת של העורק הפמורלי באתרי הפרוקסימלית ומ דיסטלי לאחר ההסרה של עורק הירך. <img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="איור 3" width="600" height="256" /> 3. איור לייזר דופלר תמונות מראה זרימת הדם לפני ואחרי הגיוס של איסכמיה כדי hindlimb שמאל (מסומן בחץ).

<ol><li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCook%2C+MJ+%22The+anatomy+of+the+laboratory+mouse%22">The anatomy of the laboratory mouse</a>. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+trait+locus+%28LSq-1%29+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li>
</ol>

ישנם כמה מקורות של השתנות לשקול בעת תכנון וביצוע מודלים איסכמיה hindlimb. ראשית, ברמה של איסכמיה עשויים להשתנות בהתאם למיקום של קשירת ביחס לזה של ענפים בצד. לכן, עבור עקביות של המודל, החיות צריכים לעבור את אותה רמה של קשירת העורקים. מקור נוסף של השתנות התאוששות איסכמי קשורה לגיל של החיות, עם בעלי חיים צעירים (6-8 שבועות) לאחר שיעורי החלמה מהירה ומלאה יותר מאשר בעלי חיים מבוגרים יותר (80-10 חודשים), כפי שנבחנו על ידי hemodynamic (כלומר זלוף לייזר דופלר) או פונקציונלי (כלומר בדיקה הליכון) מודד. עבור מחקרים בהם אחד הוא הערכת סוכן angiogenic, זה עשוי להיות עדיף להשתמש בבעלי חיים מבוגרים, כי הבדל גדול בין הקבוצות אפשר לראות עם התערבות טיפולית. לעומת זאת, עבור מחקרים בהם אחד להערכת גורם אנטי angiogenic, זה עשוי להיות עדיף להשתמש בבעלי חיים צעירים על מנת למקסם את גודל ההשפעה 3. אם מבוצע כהלכה, לא צריך להיות מינימלי לסיבוכים כגון דימום, זיהום, או תמותה. אם הדימום מתרחש על ידי הפרעה מקרית של עורק הירך או כלי אחר, לחץ מתון עם צמר גפן סטרילי היטה המוליך או גזה יש להחיל לאתר של דימום עד שהדימום ייפסק. בעלי חיים מראה סימנים של זיהום יש לטפל עם אנטי זיהומיות סוכנים. בעלי חיים מציג נמק משמעותי ייתכן שיהיה צורך beeuthanized. סיבוך זה שכיח יותר אצל בעלי חיים מבוגרים, כמה זנים, כגון עכברים BALB ג 4. בנוסף, מודל איסכמיה hindlimb עלול לגרום לכאב קל עד מתון. לכן, משככי כאבים כגון עצירות או carprofen צריכה להינתן לפי הצורך לטיפול בכאב, על פי המלצות IACUC. לסיכום, אנו הדגימו שיטה פשוטה לשחזור ללימוד PAD במודל של איסכמיה Murine hindlimb. המודל איסכמיה hindlimb עם ניתוח לייזר דופלר הדמיה היא מערכת מצוינת ללמוד פתולוגיות כלי הדם להערכת מועמדים טיפולית.

<table><tbody><tr><td>כלי ניתוח</td><td>כלי</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקלונים מכותנה Constix</td><td>כלי</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>בטדין (Povidone-iodine)</td><td>ריאגנט</td><td>PDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% alcohol</td><td>ריאגנט</td><td>Kendall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלח Phosphate Buffered Saline</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חוט תפירה משי 7-0</td><td>כלי</td><td>Genzyme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חוט תפירה vicryl 5-0</td><td>כלי</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת גילוח חשמלית</td><td>כלי</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר קוואטר</td><td>כלי</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת Laser Doppler and PeriScan PIM 3</td><td>ציוד</td><td>Perimed</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דגם murine של איסכמיה hindlimb

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

בארצות הברית, מחלת עורקים היקפית (PAD) משפיעה על כ -10 מיליון אנשים, והיא נפוצה גם ברחבי העולם. טיפולים רפואיים להקלה סימפטומטית מוגבלים. התערבויות כירורגיות או endovascular שימושיים עבור אנשים מסוימים, אבל לטווח ארוך התוצאות הן לעתים קרובות מאכזב. כתוצאה מכך, יש צורך בפיתוח טיפולים חדשים לטיפול PAD. הכנת Murine איסכמיה hindlimb הוא מודל של PAD, והוא שימושי לבדיקה טיפולים חדשים. כאשר לעומת דגמים אחרים של איסכמיה רקמות כגון קשירת עורקים כליליים או מוחין, קשירת עורק הירך מספק מודל פשוט יותר של רקמה איסכמית. יתרונות אחרים של מודל זה הם וקלות הגישה עורק הירך לבין שיעור תמותה נמוך. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את המתודולוגיה של המודל Murine של איסכמיה hindimb חד צדדית. חומרים ותהליכים ספציפיים ליצירת מודל הערכת יתוארו, כולל הערכה של זלוף איבר על ידי לייזר דופלר הדמיה. פרוטוקול זה יכול גם להיות מנוצל להשתלה ולא פולשנית מעקב של תאים, אשר באה לידי ביטוי הואנג et al. 1.

ההליך הכירורגי לזירוז של איסכמיה hindlimb החד צדדית באה לידי ביטוי, עם אישור של איסכמיה על ידי הדמיה זלוף דופלר לייזר.

דגם Murine של איסכמיה Hindlimb

בארצות הברית, מחלת עורקים פריפריים (PAD) פוגעת בכ-10 מיליון אנשים, והיא נפוצה גם ברחבי העולם. טיפולים רפואיים עבור...

בארצות הברית, מחלת העורקים הפריפריאליים, PAD, פוגעת בכ-10 מיליון אנשים, ובמיוחד במעשני סיגריות, בחולי סוכרת ובאנשים מעל גיל 70. המטרה הכללית של ניתוח זה היא להשראת איסכמיה של הגפיים האחוריות על ידי קשירה של המקטעים הפרוקסימליים והדיסטליים של העורק הפמורלי. הפרוצדורה מתחילה בהרדמה, גילוח ומיקום העכבר על שולחן הניתוח במצב שכיבה על הגב.לאחר מכן, מבוצע חתך בעור מהברך לכיוון הירך המדיאלית, החושף את העורק הפמורלי שמתחתיו. בשלב הבא, העורק הפמורלי מופרד בזהירות מהוריד הפמורלי. קשרים כפולים מבוצעים באתר הליגציה הדיסטלי וכן באתר הליגציה הפרוקסימלי.לאחר מכן כורתים את מקטע העורק הפמורלי. אתר החתך נסגר באמצעות תפרים והחיה נשארת להתאושש מההרדמה. כדי לאשר את השראת האיסכמיה בגפה האחורית, העכבר המורדם מונח בתנוחה גבנית.לאחר מכן, שתי הגפיים האחוריות נסרקות באמצעות דופלר לייזר. התמונה נשמרת לאחר מכן ונבחנת כדי להעריך את הפרפוזיה. היי, אני ג'ון קוק.אני פרופסור לרפואה כאן בחטיבה לרפואה קרדיו-וסקולרית באוניברסיטת סטנפורד. המעבדה שלנו מתעניינת באנגיוגנזה ובשיקום כלי דם. בסרטון זה, שני עמיתי הפוסט-דוקטורט שלי, ד"ר Nan Wong והיר Niyama, יציגו לכם את הכנת הפרפוזיה של איסכמיה ברגל האחורית של עכבר, המהווה מודל חשוב למחלה עורקית פריפרית ומשמשת לעיתים קרובות במעבדה שלנו להערכת ההשפעות של גורמי גדילה וטיפול תאי על אנגיוגנזה.אנו משתמשים בפרוצדורות אלו במעבדה שלנו כדי לחקור את השפעתן של תאים אנדותליאליים המופקים מתאי גזע לתיקון כלי דם. אז בואו נתחיל. כלי הניתוח הדרושים לפעולה זו כוללים פינצטה עדינה בעלת חוד, פינצטה מחודדת, מספרי קפיץ, מספריים כירורגיים, מחזיק מחט וסורג (retractor).אנו מכינים רטראקטור (מרחיב) משלנו באמצעות מהדק נייר מכיוון שהוא קטן יותר מאלו הזמינים מסחרית. יש לעקר כלים אלו לפני הניתוח באמצעות מכשיר עיקור בחרוז חם; לניתוח זה יידרשו גם מכשיר קוואטר (צריבה) ומקלוני צמר סטריליים בעלי קצה דק. כאשר הכלים מוכנים, יש להניח את העכבר בתא השראת ההרדמה המכיל 1% עד 3% isoflurine בחמצן של מאה אחוזים בקצב זרימה של 1 liter per minute.השאירו את העכבר בתא ההשראה עד שיהיה חסר תגובה לגירויים חיצוניים. לאחר מכן, הוציאו את החיה מתא ההשראה. הניחו את החיה בתנוחה גבנית (supine) על שולחן ניתוח מקדמי וחברו אותה לזרימה רציפה של isoflurane.הסר את הפרווה מהגפה האחורית באמצעות מכשיר גילוח חשמלי. מרח קרם להסרת שיער כדי להסיר את הפרווה באופן יסודי. לאחר גילוח העכבר, פesח וקבע את הגפה האחורית באמצעות חתיכת סרט הדבקה.לאחר שהגפה האחורית מקובעת, נגב את העור בשלוש שפשופים לסירוגין של Betadine ואלכוהול. באמצעות פינצטה עדינה ומספריים כירורגיים, בצע חתך בעור באורך של כסנטימטר אחד, מהברך לכיוון הירך המדיאלית, תוך שימוש במקלוני צמר גפן לחים וחדים שנטבלו ב-phosphate buffered saline (PBS).הסר בעדינות בעזרת מברשת רקמת שומן תת-עורית המקיפה את שריר הירך. לאחר מכן, השתמש במכשיר קאוטריזציה באופן רוחבי ובגדלים מתאימים כדי לבצע דיסקציה דרך רקמת השומן התת-עורית, במטרה לחשוף את העורק הפמורלי שמתחתיה. לאחר מכן, השתמש במרחיב (retractor) כדי לפתוח את הפצע ולהשיג תצפית טובה יותר על כלי הדם של הגפה התחתונה.בעזרת פינצטה עדינה ומקלון צמר עם קצה מחודד, יש לבצע דקירה עדינה דרך נרתיק הירך (femoral sheath) הקרומי כדי לחשוף את הצרור הנוירו-וסקולרי. לאחר מכן, באמצעות סט נקי של פינצטה עדינה ומקלון צמר, יש לבצע דיסקציה ולהפריד את העורק הפמורלי (femoral artery) מהוריד הפמורלי ומהעצב במיקום הפרוקסימלי סמוך למפשעה. לאחר הדיסקציה, יש להעביר חוט תפירה מסוג silk 7-0 מתחת לקצה הפרוקסימלי של העורק הפמורלי.חסמו את העורק הפמורי הפרוקסימלי באמצעות קשרי כפולים. מקמו את הקשר על כלי הדם בנקודה הפרוקסימלית ביותר בתוך הפצע, כדי להשאיר אורך לקשר השני ולמקטע ביניהם אשר ייכרת. הפרידו את העורק הפמורי מהווריד הפמורי במיקום הדיסטלי הקרוב לברך.השחילו חוט תפר בעובי 7-0 תחת הקצה הדיסטלי של העורק הפמורלי, פרוקסימלית לעורק הפופליטי. חסמו את כלי הדם באמצעות קשרי כפול. חסמו את העורק הפמורלי הדיסטלי עם סט שני של קשרי כפול, ממש פרוקסימלית לסט הקשרים הראשון.סט תפרים שני זה ישמש לתפיסת העורק במהלך הליך החיתוך. באופן דומה, לצורכי תפיסה, חסמו את עורק ה-fal הפרוקסימלי באמצעות הסט השני של קשרים כפולים, ממש דיסטלית לסט הקשרים הראשון. חתכו את מקטע עורק הירך שבין הקשרים הדיסטליים לפרוקסימליים בעזרת מקלון צמר דק בעל חוד ומספרי קפיץ.יש לנקוט זהירות כדי לא לנקב את דופן הווריד הפמורלי. יש להסיר את המרחיב (retractor) ולסגור את החתך באמצעות תפרי 5-0 quil. לאחר סגירת החתך, יש להחזיר את החיה לכלוב ההתאוששות ולעקוב אחריה עד להתעוררותה. לאחר שעה של התאוששות, יש להמשיך בבדיקת פרפוזיית דם בשיטת לייזר דופלר.שלב לאישור השראת האיסכמיה. כדי להתחיל את שלב ביצוע מדידות זרימת הדם באמצעות לייזר דופלר, מקמו את העכבר בתא השראת ההרדמה המכיל 1% עד 3% iso fluorine במאה אחוז חמצן בקצב זרימה של ליטר אחד לדקה. השאירו את העכבר בתא ההשראה עד שיהיה חסר תגובה לגירויים חיצוניים.לאחר מכן הוצא את החיה מתא ההשראה והנח אותה על שולחן טרום-הניתוח המחובר לזרימה רציפה של isof fluorine. לאחר מכן, הסר את הפרווה מהגפה האחורית באמצעות תספורה חשמלית, ולאחר מכן השתמש בקרם להסרת שיער לפי הצורך. לאחר הסרת הפרווה, הנח את החיה על משטח מחומם בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות תחת זרימה רציפה של iso fluorine.לאחר חמש דקות, הנח את בעל החיים במצב שכיבה על הגב על משטח בולע אור שאינו מחזיר השתקפות, כגון בד בצבע ירוק המחובר לזרימה רציפה של iso fluorine. פשר את הגפיים האחוריות. לאחר מכן, הפעל את מדמיג הלייזר דופלר (laser doppler imager) ואת תוכנת הרכישה ואתחל את התוכנה.הגדירו את גודל שדה הראייה והרזולוציה. מומלץ לשמור על שדה ראייה וצפיפות פיקסלים עקביים בין החיות. כדי להקל על הניתוח העתידי, פתחו קובץ חדש.לחצו על start כדי להתחיל ברכישת נתוני הדמיה. כאשר תתבקשו, הגדירו את המרחק של בעל החיים מהמדמיה. הלייזר יציג את גבולות שדה הראייה ולאחר מכן יתחיל ברכישת הנתונים.לאחר השלמת הרכישה, התמונה תתחיל להציג מגוון צבעים המעידים על רמת זרימת הדם לרגליים. ניתן להגדיר את הצבעים לטווח זרימה ספציפי. כדי להשוות בצורה טובה יותר את הנתונים בין בעלי חיים עם סיום רכישת הנתונים, שמרו את הקובץ, לאחר מכן החזירו את בעל החיים לכלוב ההתאוששות ונטרו אותו ברציפות עד להתעוררותו.כדי לנתח את הנתונים, השתמשו בכוונון הסף (threshold adjustment) בתוכנת הניתוח כדי להפחית רעשי רקע. סף של 0.2 הוא בדרך כלל ערך סביר. בחרו שני אזורי עניין (regions of interest) או ROIs המכסים כל אחד מאזורי הגפיים האחוריות.ניתן להשתמש במגוון של נקודות ייחוס (landmarks) כדי להגדיר באופן סטנדרטי את ה-ROI בין גפיים ובעלי חיים, ולאחר מכן לקבוע את הפרפוזיה הממוצעת ואת השונות ב-ROI. לאחר מכן ניתן לקבוע בקלות את הפרש הפרפוזיה ואת יחס הפרפוזיה בין הגפה האיסכמית לגפה הבקרה. ניתן לחזור על הליך זה כדי לעקוב אחר שינויים בפרפוזיה של הגפה האחורית.עם הזמן, בנקודת זמן רצויה, ניתן להקריב את בעל החיים לצורך הערכת תפקוד הרקמה. בהשוואה לנתוני דמיון של פרפוזיה, מוצג כאן תרשים מייצג של הגפה האחורית לאחר חשיפה של העורק הפמורלי. התפרים מסמנים את מיקומי אתרי הליגציה הפרוקסימליים והדיסטליים.כאשר הניתוח מבוצע בזהירות, הדימום הוא מינימלי וניתן להשלים את הניתוח בפחות משעה אחת. וכאן מוצגות תוצאות ניתוח תמונת פרפוזיית לייזר דופלר. התמונה משמאל מראה את הפרפוזיה של שתי הגפיים לפני השראת איסכמיה.בעוד שהתמונה מימין מראה את הפרפוזיה של שני הגפיים, לאחר שהגפה האחורית השמאלית עברה השראה איסכמית. עוצמת הצבע בתמונה מעידה על כמות זרימת הדם.בהשוואה לגפה השליטה, הגפה האיסכמית מראה מעט מאוד צבע, מה שמעיד על הפחתה דרסטית בזרימת הדם. באמצעות נתונים אלו, התוכנה יכולה לכמת את הפרפוזיה הממוצעת בגפה האיסכמית ובגפת השליטה כדי לקבוע את הפרש הפרפוזיה ואת יחס הפרפוזיה. לפיכך, תוצאות אלו מאשרות את השראת האיסכמיה לגפה האחורית.הראינו לכם כיצד להשרות איסכמיה חד-צדדית של הגפה האחורית במודל עכבר, וכיצד לאשר את השראת האיסכמיה באמצעות ביצוע מדידת זרימת דם בשיטת לייזר דופלר. מודל איסכמיה של הגפה האחורית עם ניתוח באמצעות דימות לייזר דופלר הוא מערכת מצוינת לחקר פתולוגיות וסקולריות ולהערכה של מועמדים טיפוליים. לאחר הליך זה ניתן לבצע השתלה ומעקב לא-פולשני של תאים, כפי שמוצג בסרטון JoVE אחר של Huang et al.בעת ביצוע הליכים אלו, חשוב לזכור לנקוט במשנה זהירות כדי לא לנקב את דופן הווריד הפמורלי בעת כריתת העורק הפמורלי באמצעות מספרי דיסקציה. כמו כן, יש להשתמש באתר ליגציה דומה עבור כל החיות בניסוי כדי להבטיח עקביות של מודל האיסכמיה החמורה. זהו כל השלב.תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

חוסר הבנת מכניסטית של פגיעת איסכמיה reperfusion חוט השדרה יש הפריע נספחים נוספים למניעת paraplegia הבא פעולות אב העורקים בסיכון גבוה. לכן, הפיתוח של מודלים של בעלי החיים הוא הכרחי. כתב יד זה מדגים שיתוק גפיים תחתון לשעתק הבא חסימת אב העורקים החזי במודל עכברי.

פרפלגיה Reproducable ידי בית חזה אבי העורקים ספיגה במודל Murine של חוט השדרה איסכמיה reperfusion

אנחנו מציגים את שיטה כירורגית כדי לגרום לאיסכמיה / reperfusion הניסיוני (I / R) פציעה כדי לדמות אוטם שריר הלב (MI) בעכברי מודל, המאפשר ליותר בהירות במיצוב של קשירה בעורק השמאלי הקדמי יורד (LAD) כדי להגדיל את שחזור ניסויים MI בעכברים.

דגם של שריר הלב איסכמיה reperfusion הפגיעה Murine באמצעות קשירת של העורק השמאלי קדמי יורד

אינדוקציה כירורגית של איסכמיה של הגפיים האחוריות בעכבר שימושית לבחינת אנגיוגנזה, אולם זה נפגע בזני עכברים מסוימים המולדים המציגים נמק רקמות המושרה על ידי איסכמיה. מתוארות שיטות לגרימת איסכמיה תת-חריפה בגפיים באמצעות מכווצים אמרואידים כדי לעקוף בעיה זו באמצעות אינדוקציה של חסימת עורקים הדרגתית.

שיטות חריפה subacute Murine Hindlimb איסכמיה

אנו מתארים מודל עכבר של שבץ מוחי הנגרם על ידי חסימה של עורק המוח האמצעי באמצעות תפר מצופה סיליקון. ניתן ליישם את הפרוטוקול כדי לגרום לחסימה קבועה או איסכמיה זמנית, ואחריה רפרפוזיה.

אינדוקציה של שבץ איסכמי ו איסכמיה reperfusion בעכברים באמצעות הטכניקה ויזואליזציה ספיגות עורקים התיכונים של אזור האוטם

אנו מתארים הליך כירורגי המשמש כדי לגרום איסכמיה היקפית בארנבים עם היפרליפידמיה וסוכרת. ניתוח זה משמש כמודל טרום קליני לתנאים המנוסים במחלות עורק היקפי בחולים. אנגיוגרפיה מתואר גם אמצעי כדי למדוד את היקף הוכנסו איסכמיה והתאוששות של perfusion.

המודל הקליני של איסכמיה הגפיים האחוריות בארנבים סוכרתית

כאן, המודל הניסיוני הטיפולי איסכמיה מוצג ואחריו סוללה של פונקציונלי, בדיקות היסטולוגית ומולקולרית כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים אנגיוגנטית.

הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה

כאן אנו מתארים הליך כירורגי המראה כיצד להשיג הארכה קבועה של עורק שמאלי הקדמי כלילית בעכברים. מודל זה הוא בעל רלוונטיות גבוהה לחקור את הפתופסולוגיה של אוטם שריר הלב ואת התהליכים הביולוגיים המקביל.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

מאמר זה מדגים גישה כירורגית יעילה ליצירת איסכמיה חריפה בעכברים עם חתך קטן. גישה זו יכולה להיות מיושמת על ידי רוב קבוצות המחקר ללא כל שדרוגי מעבדה.

מודל כירורגי מותאם של איסכמיה בגפיים אחוריות ב- ApoE-/- עכברים באמצעות חתך מיניאטורי

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה וניתנת לשחזור שיכולה לגרום לאוטם שריר הלב או לפגיעה באיסכמיה של שריר הלב בעכברים על ידי קשירה מדויקת של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי באמצעות מיקרומניפולציה.

השראת אוטם שריר הלב ופגיעה באיסכמיה של שריר הלב בעכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל ייחודי ורלוונטי מבחינה קלינית של מחלת עורקים היקפית המשלב עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול מעכב סינתאז תחמוצת החנקן כדי לגרום לנמק אחורי בעכברים FVB. זלוף תוך-לבבי DiI משמש לאחר מכן להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל.

הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל במודל נמק הינדלימב מורין

אנו מתארים כיצד ליצור מודל כירורגי נפוץ של פגיעה איסכמיה רפרפוזיה במעיים (IRI) במכרסמים. ההליך כרוך חסימה של העורק mesenteric העליון ואחריו שחזור זרימת הדם. מודל זה שימושי למחקרים הבוחנים גורמים חוסמים של IRI במעיים הן ברפואה וטרינרית והן ברפואה אנושית.

מודל מכרסם של פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה במעי באמצעות חסימה של העורק המזנטרי העליון

למדו את שיטת הכריתה הכירורגית של עורק הירך בעכברים ליצירת איסכמיה חד-צדדית בגפיים האחוריים. השיטה מאומתת באמצעות דופלר לייזר ומסייעת בחקר מחלות עורקים היקפיות ותהליכי חידוש כלי הדם.

דגם Murine של איסכמיה Hindlimb

גלה סרטונים נוספים